Summary
Высоко очищенного препарата мышиные клетки легких дендритных описано. Особое внимание уделяется изоляции обычных дендритных подмножество клеток.
Abstract
Легкого дендритные клетки (ДК) играют фундаментальную роль в зондирование вторжения патогенов 1,2, а также в управление вызывающий иммунологическую толерантность ответы 3 в дыхательных путях. По крайней мере, три основных подмножеств клеток легких дендритных были описаны у мышей: обычные DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 и ИФН-убийца производства DC (IKDC) 6,7. Подмножество CDC является наиболее известным DC подмножество в легких 8.
Общий маркер для выявления известных DC подмножеств CD11c, типа я трансмембранного интегрина (β2), что также выражается в моноциты, макрофаги, нейтрофилы и некоторых В-клетки 9. В некоторых тканях, используя CD11c в качестве маркера для выявления мыши DC действительно, как и в селезенке, где большинство CD11c + клеток представляют собой подмножество CDC который выражает высокий уровень главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC-II). Тем не менее, легкие более разнородной ткани, где будетстороны DC подмножества, есть большой процент различных популяции клеток, что выражается высоким уровнем CD11c бой низкого уровня MHC-II. Опираясь на свои характеристики и в основном на его выражение F4/80, селезенки маркер макрофагов, CD11c привет MHC-II вот легкого населения была определена в качестве легочных макрофагов 10 и совсем недавно, в качестве потенциального предшественника DC 11.
В отличие от мыши PDC, изучение специфической роли CDC в легочной иммунный ответ был ограничен из-за отсутствия специфического маркера, который может помочь в изоляции этих клеток. Таким образом, в этой работе мы описываем процедуру, чтобы изолировать высокой степени очистки мыши легких CDC. Изоляция легочных подмножества DC представляет собой весьма полезный инструмент, чтобы получить представление о функции этих клеток в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей, а также экологические факторы, которые могут вызвать иммунный ответ в легких.
Protocol
1. Перфузии легких и суспензии отдельных клеток
- Эвтаназии мышь с внутрибрюшинного введения кетамина / ксилазина смеси анестетиков (в мг / мышь кетамин 1.8, ксилазина 0,19) и обескровливание через бедренную вену
- Expose грудной полости за счет сокращения и осторожно потянув назад внешняя оболочка брюшины. Приступить к открытой диафрагмы за счет сокращения грудной клетки, чтобы выставить как сердце и легкие.
- Заливать мягко легких использованием 5 мл шприц с ЭДТА-HBSS (1 мм ЭДТА кальция / магния без HBSS). Подключите 25 G иглу и вставить иглу в правый желудочек. Для предотвращения утечки во время инъекции, безопасные myocardiac ткань вокруг иглы с помощью щипцов. Осторожно вводят раствор при сохранении постоянного давления. Точная перфузии приведет к инфляции, легких и изменение цвета на розовый / белый.
- Удалите дренаж лимфатических узлов, чтобы отказаться от любого возможного загрязнения из этой ткани.
- Собиратьлегочной ткани, трансфер в чашке Петри на льду, и нарезать его на небольшие части, используя лезвие бритвы.
- Передача заземленной ткани в трубке gentleMACS С, содержащий 5 мл / легких коллагеназы решение пищеварения (коллагеназы типа 1А 0,5 мг / мл плюс тип IV бычьей панкреатической ДНКазы 20 мкг / мл в HBSS, содержащего 5% FBS, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина).
- Используйте диссоциатор gentleMACS для получения суспензии отдельных клеток. Выберите программу: m_lung_01. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 30 минут. Встряхните трубку каждые 5 минут для ресуспендирования фрагментов тканей. Приступить к программе m_lung_02.
- Передача образца до 15 мл коническую трубку и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C. После этого шага, сохранить все реагенты и центрифугирования при 4 ° С до предотвратить снижение жизнеспособности клеток.
- Удалите супернатант и лизиса оставшихся эритроцитов, добавив 2 мл ACK лизирующего буфера в течение 1 минуты при комнатной температуре. Вымойте клеток с 13мл холодной PBS/0.5% BSA и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C.
- Удалите супернатант, ресуспендируют общего числа клеток в 5 мл холодной PBS/0.5% BSA и проходят тщательную 100 мкм нейлоновая сетка.
- Определите общее количество клеток с помощью трипанового синего исключения красителя.
2. Магнитная изоляция и CD11c + клеток обогащения
- Центрифуга суспензии отдельных клеток в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 400 мкл буфера разделения (PBS, 0,5% BSA, и 2 мМ ЭДТА) в 10 8 общего числа клеток. Блок Fc-опосредованная неспецифического связывания антител с помощью anti-CD16/CD32 антител (0.5μg / 10 6 клеток) в течение 30 минут при 4 ° C.
- Вымойте клеток с 10 мл холодного буфера разделения и центрифуги в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 400 мкл разделения буфера.
- Добавить 100 мкл CD11c микрошарики в 10 8
- Вымойте клеток с 10 мл холодного буфера разделения и центрифуги в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 3 мл холодного буфера разделения.
- Выполните магнитной сепарации использованием autoMACS Pro TM сепаратор, выбрав программу posseld. Сбор положительную фракцию (0,5 мл).
3. Обычная клетка дендритные (CDC) изоляции
- Инкубируйте обогащенный CD11c положительные суспензии клеток с анти-CD11c PE-Cy7 и anti-IA/IE (MHC-II)-FITC антител в течение 30 минут при 4 ° C. Оптимизированная концентрации антител составляет 0,5 мкг / 10 6 клеток.
- Вымойте клетки с холодной PBS/0.5% BSA и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл PBS/0.5% BSA и передает их через 40 нейлоновая сетка мкм.
- Переходите ксортировать клетки с помощью ячейки FACS Ария сортировщик в чистоте режиме. Добавить 100 мкл PBS/0.5% BSA в коллекцию трубы, чтобы предотвратить повреждение очищенных клеток. Держите ваши клетки в охлажденном температуру на протяжении всего процесса сортировки клеток.
4. Альтернативный протокол для получения суспензии отдельных клеток и CD11c + клеток обогащения
- В замены диссоциатор gentleMACS, основанные легочной ткани с шагом 1,5 могут быть переданы в 15 мл коническую пробирку, содержащую 5 мл коллагеназы раствора на легких и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Vortex клетки каждые 15 минут, чтобы ресуспендирования фрагментов тканей. Disrupt ткани при прохождении пробы 6-8 раза и через 3 мл шприца, соединенного с иглой 20 G. Избегайте пузырей в процессе, в противном случае жизнеспособность клеток будут поставлены под угрозу. После суспензии отдельных клеток, получается, переходите к шагу 1.8.
- В замены AutoMACSPro ТМ разделениятор, магнитная изоляция для обогащения CD11c клеток, также может быть выполнена путем пропускания клеточной суспензии вручную через два MACS столбцов. Выбор соответствующих столбцах будет варьироваться в зависимости от размера выборки.
5. Представитель Результаты:
Легкого CDC определены как CD11c привет / MHC-II привет клеточной популяции. Как показано на рис. 1, CDC представляют меньший процент на 1,4% по сравнению с некоторыми другими тканями, таких как селезенка (4,8%). Однако, в отличие от селезенки, легких CD11c положительные клетки экспрессируют различные количества MHC-II, в том числе различных клеточных популяций, чем CDC. После одноклеточных подготовки, клетка выход общего числа клеток легких был примерно 3,0 до 3,8 х 10 7 клеток / легкого с жизнеспособность 60-70%, из которых немногим более 1% представлены CDC подмножество. Этот процент был увеличен после CD11c магнитная изоляция где общее легких CDC был увеличен примерно на 10 тРедакторы IME (> 16%) от оригинального препарата (рис. 2). Тем не менее, CD11c клеток, экспрессирующих низкие объемы MHC-II (CD11c привет / MHC-II вот, макрофаги), представленных высоким загрязняющих популяции клеток (> 70%), который был смешан с подмножеством легких CDC. Как показано на рис. 2Б, эти клетки были устранены после шага сортировки клеток, когда чистота CDC достигли> 96%. Обычная выход CDC после всей процедуры составляет 5 х 10 4 клеток / легких. Микрофотографии показывают морфологических характеристик CDC в виде округлых клеток с типичными дендритов (верхняя панель). С другой стороны, CD11c привет / MHC-II вот представлена морфологически различные подмножества, который показывает сотовой выступы, характерные для макрофагов (М ^, нижний график) 12.
Рисунок 1. Дифференциальная DC частоты в легких мыши и селезенки. Легкогом ткани селезенки из C57BL / 6 мышей были собраны и обработаны коллагеназы. После коллагеназы пищеварения, клетки окрашивали анти-мышиных CD11c-PE-Cy7 и анти-мышь IA / IE-FITC. Представитель участки проточной цитометрии показывают процент CDC (CD11c привет / MHC-II привет) в легких и селезенке.
Рисунок 2. Выделение CDC легких мыши. Мышь легких суспензии отдельных клеток метили анти-CD11c микрошарики и проходил через автоматический сепаратор клеток.) Представитель график показывает процент CDC (CD11c привет / MHC-II привет) и Макрофаги (М ^, CD11c привет / MHC-II LO) населения после CD11c обогащения. Дальнейшее окрашивание фракции, обогащенной следуют с использованием анти-мышь CD11c-PE-Cy7 и анти-мышь IA / IE-FITC. Дважды положительные клетки были отсортированы и анализировали с помощью проточной цитометрии. Копределить их морфологии, клетки cytospun и окрашивали изменение Райта-Гимза окрашивания. B) представитель графики показывают проценты CDC и М ^ после сортировки клеток. Микрофотографии показывают представитель изображение легких CDC и легких М ^. Шкала бар = 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение легочных мыши DC является важным методом для изучения широкого спектра дыхательных стимулов. Процесс получения этих клеток включает в себя важные шаги, которые препятствуют потере клеток, а также жизнеспособности клеток и чистоты. Перфузии легкого до сбора поможет устранить любые периферийные клетки, а также уменьшить загрязнение эритроцитов. Использование автоматизированных диссоциации можно advanteogus, когда большое количество легких, обрабатывались, в противном случае вы можете выбрать альтернативный протокол, имея в виду, что дисперсия ткани после коллагеназы пищеварение должно быть сделано аккуратно, когда делается вручную. Инкубационный период легочной ткани, в то время как коллагеназа решение не должно быть расширено за пределы указанного времени инкубации. После этого шага, оставшихся процесс должен быть сделано с помощью ледяной буферов и рефрижераторных центрифуг, чтобы уменьшить гибель клеток. Лизисом загрязняющих эритроцитов шаг, который не следует повторять более тхан дважды в течение всего процесса. Передача клеточной суспензии через нейлоновую сетку, в указанном шагов, имеет решающее значение для предотвращения засорения ячейки сортировщик, а также снизить клеточных агрегатов которых пойдет на компромисс ячейки чистоты. Если в дальнейшем культура в пробирке из изолированных клеток участвует, все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности для предотвращения загрязнения. Он не ожидал, что шаг сортировки клеток пойдет на компромисс стерильности образца.
Дендритные клетки имеют решающее значение для изучения врожденных и адаптивных иммунных взаимодействий. Процедура, описанная имеет потенциал, чтобы быть применены для выделения других подмножеств DC, если соответствующие антитела, которые используются во время магнитной изоляции и сортировки клеток 8. Кроме того, легочные макрофаги (CD11c привет / MHC-II ло) также может быть очищен от того же препарата клетки. Несмотря на ограниченное число легочных постоянного тока, которые могут быть изолированы на одно животное бу с помощью этой процедуры, этот метод обеспечивает наиболее точную систему для изучения легких, округ Колумбия. Однако до изоляции постоянного тока, мышей можно лечить с ФМС-подобной тирозинкиназы 3 (Flt3-) Лиганд, агент, который увеличивает DC номера 13. Хотя селезенки постоянного тока может быть проще и быстрее изолировать, различия в созревания состоянии постоянного тока в легких и селезенке должны быть приняты во внимание. В отличие от постоянного тока селезенки, легких DC выразить незрелый фенотип, который перешел на зрелых один за, например, вирусная инфекция 8,14.
Таким образом, изоляция конкретных подмножеств легких постоянного тока через описанный протокол, дает уникальный инструмент, который может помочь определить конкретную роль и / или вклад легочной постоянного тока в иммунной реакции и может быть применен к любой экспериментальной модели мышей , что включает в себя изучение дыхательных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Мэрилин Дитрих в цитометрии ЛГУ фонда основной поток за помощь в сортировке клеток и Питер Моттрам за его помощь в микрофотографии. Эта работа финансировалась бортпроводника Института медицинских исследований, LSU-Конкурентная исследовательской программы Award, и NIH / NIAID Гранты P20 RR020159 и R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
