Summary
描述一个高度纯化的小鼠肺树突状细胞的准备。具体的重点是给传统的树突状细胞亚群的隔离。
Abstract
龙树突状细胞（DC）感应入侵的病原体1,2以及耐受性反应的控制呼吸道发挥基础性作用。肺癌树突状细胞至少有三个主要的子集已在小鼠描述：传统的直流（CDC）4，浆DC（PDC）和生产干扰素的杀手DC（IKDC） 6,7。 CDC的一个子集，是最突出的DC在肺癌 8的子集。
已知识别DC亚群的共同标记的CD11c，I型跨膜整合（β2），也是在单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和一些B细胞9表达。在一些组织中，作为一个标记，以识别鼠标DC表面CD11c是有效的，在脾，其中大部分表面CD11c +细胞代表CDC的子集，它表达的主要组织相容性复合体Ⅱ类（MHC -Ⅱ ）的高层次。然而，肺组织的地方是一个更异构端DC亚群，是一个不同的细胞群的比例较高，表示回合MHC -Ⅱ水平低的CD11c高水平。的CD11c 您好 MHC -Ⅱ 老龙的细胞群，根据其特性和大多是其表达F4/80，脾巨噬细胞标记，已被确定为10日和最近肺巨噬细胞，作为一个潜在的DC 前体11。
相比之下鼠标PDC，在肺部的免疫反应的疾病预防控制中心的具体作用的研究一直局限于由于缺乏一个特定的标记，在这些细胞的分离，可以帮助。因此，在这项工作中，我们描述了一个过程来分离高纯度的小鼠肺疾病预防控制中心。隔离肺的DC亚群代表一个非常有用的工具，以获得深入了解这些细胞的功能，在应对呼吸道病原体以及环境因素可以触发主机在肺部的免疫反应。
Protocol
1。肺灌注和单细胞悬液
- 安乐死鼠标，通过股静脉与腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉剂的混合物（氯胺酮1.8毫克/鼠标，甲苯噻嗪0.19）和放血
- 切割和腹膜外的皮肤轻轻地拉了回来，暴露胸腔。继续打开切割肋骨暴露的心脏和肺的隔膜。
- 轻轻灌注的肺，用5 ml注射器充满EDTA的HBSS（1MM EDTA钙/镁免费的HBSS）。连接25个G的针头和针插入右心室。为了防止在注射过程中的泄漏，安全使用镊子，针周围的心肌组织。轻轻注入的解决方案，同时保持恒定的压力。准确的灌注会导致肺胀，粉红/白颜色的变化。
- 删除淋巴结放弃任何从这个组织的潜在污染。
- 收集肺组织，在冰上转移到培养皿，并斩小块，用刀片。
- 转移到一个gentleMACS彗星含有胶原酶消化溶液5毫升/肺管接地组织（胶原酶1A型为0.5 mg / ml加IV型牛胰脱氧核糖核酸酶20微克/毫升含5％胎牛血清，100 U / ml青霉素和100μg的HBSS / ml链霉素）。
- 使用gentleMACS dissociator获得单细胞悬液。选择方案：m_lung_01。在37 ° C孵育30分钟的样品。摇管每隔5分钟重新悬浮组织碎片。继续执行程序m_lung_02。
- 10分钟335 X克的样品转移到15毫升锥形管和离心4 ° C 。这一步后，所有的试剂和离心保持在4 ° C，以防止细胞活力下降。
- 弃上清，加入2毫升的ACK裂解在室温下1分钟的缓冲裂解其余的红血细胞。 13细胞与洗毫升的冷PBS/0.5％BSA和离心10分钟335 X克在4 ° C。
- 倒掉上清，重悬细胞总数在5毫升冷PBS/0.5％BSA和通彻100微米尼龙网。
- 确定使用台盼蓝拒染细胞总数。
2。磁隔离和表面CD11c +细胞的富集
- 在4 ° C离心10分钟200 ×克单细胞悬液，弃上清。
- 重悬细胞沉淀在400分离缓冲液（PBS，0.5％BSA和2毫米EDTA）每10共8个细胞。块FC -介导的非特异性抗体结合anti-CD16/CD32抗体（0.5μg/ 10 6细胞）使用30分钟，在4 ° C。
- 10分钟200 ×克洗净细胞10毫升冷分离缓冲和离心机在4 ° C。 400分离缓冲液重悬细胞。
- 加入100μL微珠表面CD11c每10 8
- 洗细胞在4 ° C 10分钟200 ×克10毫升冷分离缓冲和离心，弃上清。
- 在3毫升冷分离缓冲液重悬细胞沉淀。
- 执行使用选择的程序posseld autoMACS临TM分离磁选。收集了积极的一小部分（0.5毫升）。
3。常规树突状细胞（CDC）隔离
- 孵育丰富的CD11c阳性细胞悬液与反表面CD11c PE - Cy7和anti-IA/IE（MHC -Ⅱ）- FITC抗体为30分钟，在4 ° C。优化的抗体浓度为0.5微克/ 10 6细胞。
- 用冷PBS/0.5％BSA和离心10分钟335 X克在4 ° C的细胞PBS/0.5％BSA 0.5毫升悬浮细胞，并通过一个40微米尼龙网。
- 继续进行排序细胞，使用流式细胞仪唱腔细胞分选纯度模式。添加100μLPBS/0.5％BSA的收集管，以防止纯化细胞的损害。整个细胞分选过程中的冷藏温度保持在你的细胞。
4。获得单细胞悬液和表面CD11c +细胞富集的替代协议
- 更换gentleMACS dissociator，从步骤1.5接地的肺组织可转移至15 ml锥形管的胶原酶每肺癌和孵化溶液5毫升含1小时在37 ° C涡细胞每隔15分钟，以重新悬浮组织碎片。组织扰乱通过样品和通过连接到20 G针3毫升注射器的6-8倍。避免在这个过程中的气泡，否则将受到损害细胞的活力。一旦获得单细胞悬液，继续加强1.8。
- 在更换AutoMACSPro 商标分离表面CD11c细胞富集的磁性隔离器，也可以通过两个MAC列的细胞悬液，手工进行。样本的大小而定，选择适当的列会有所不同。
5。代表性的成果：
龙CDC确定的CD11c 您好 / MHC -Ⅱ 您好细胞群。如图。 1，疾病预防控制中心代表所占比例较小为1.4％时相比，其他一些组织，如脾（4.8％）。然而，在对比脾，肺的CD11c阳性细胞表达MHC -Ⅱ的不同金额，包括比CDC不同的细胞群。单细胞的准备工作后，总肺细胞的细胞产量约3.0〜3.8 × 10 7细胞/肺癌的60-70％，从一个小超过1％的可行性代表CDC的一个子集。这个百分比增加后表面CD11c的磁隔离肺总量CDC是递增约10吨IMES（> 16％）从原来的准备（图2A）。然而，表面CD11c细胞表达MHC -Ⅱ（ 嗨的CD11c / 罗 MHC -Ⅱ，巨噬细胞）的低量，高污染的细胞群（> 70％）与肺部疾病预防控制中心的一个子集混合。如图。 2B，这些细胞被淘汰后，CDC纯度达到96％时，细胞分选步骤。疾病预防控制中心后，整个过程通常产量为5 × 10 4细胞/肺。显微表明中华网与典型的树突（上图）四舍五入细胞的形态特征。另一方面，表面CD11c 您好 / 罗 MHC -Ⅱ代表了形态不同的子集，显示细胞突起，这是典型的巨噬细胞（巨噬细胞， 下半部分）12。
图1。差分直流变频在小鼠肺和脾脏 。龙一个ND C57BL / 6小鼠的脾组织收集和处理与胶原酶。胶原酶消化，抗鼠的CD11c - PE - Cy7和抗小鼠IA / IE - FITC细胞染色。代表流式细胞仪图显示在肺，脾（CDC百分比的CD11c 您好 / MHC -Ⅱ 您好 ）。
小鼠肺单细胞悬液与反表面CD11c磁珠标记，并通过自动细胞分离A）代表图显示CDC的百分比（嗨的CD11c /您好MHC -Ⅱ） 和图2。小鼠肺疾病预防控制中心隔离 。 “巨噬细胞（巨噬细胞表面CD11c，您好/罗MHC -Ⅱ）表面CD11c富集后的种群。进一步丰富分数染色其次，使用抗鼠的CD11c - PE - Cy7和抗小鼠IA / IE - FITC。双阳性细胞进行分类，并通过流式细胞仪分析。要确定它们的形态，细胞cytospun和修改后的Wright - Giemsa染色染色B）代表图显示CDC的百分比，巨噬细胞和细胞分选后。显微显示肺疾病预防控制中心和肺巨噬细胞的形象代表。比例尺= 20微米。
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Discussion
肺鼠标直流隔离的呼吸道刺激广泛的研究的一个重要的技术。取得这些细胞的过程中，包括防止损失的细胞以及细胞活力和纯度的关键步骤。肺灌流前收集将有助于消除任何周围细胞以及减少污染物的红细胞。使用自动分解，可当处理大量的肺部advanteogus，否则，你可以选择的替代协议，牢记分散胶原酶消化后的组织应该做的，轻轻的时候手动完成。胶原酶溶液中的肺组织的潜伏期，而不应超出指定的孵化时间延长。这一步后，余下的过程中必须做的，用冰冷的缓冲区和冷冻离心机，以减少细胞死亡。污染红细胞裂解是不应该被重复更多的T一步汉两次在整个过程中。传递细胞悬液通过尼龙网，在指定的步骤，是关键，以防止堵塞的细胞分选，以及降低细胞聚集，这将损害细胞纯度。如果进一步涉及文化，是在体外分离的细胞，必须执行所有步骤，下一个生物安全柜，以防止任何污染。这不是预期的细胞分选步骤，会破坏样品的无菌。
树突状细胞是先天免疫和适应性免疫相互作用的研究是至关重要的。描述的过程，如果相应的抗体在磁隔离和细胞分选 8其他DC亚群的隔离应用的潜力。此外，肺巨噬细胞（表面CD11c 您好 / 罗 MHC -Ⅱ），也可以从相同的细胞制备纯化。尽管数量有限的肺区，可每头牲畜b隔离Ÿ使用此过程中，这种技术提供了最精确的系统来研究肺直流。然而，DC隔离之前，老鼠可以用fms样酪氨酸激酶3（FLT3）配体，代理增加直流数字 13 。虽然脾脏的DC可能会更容易和更快的隔离开来，在肺，脾DC的成熟状态的差异，必须加以考虑。相比之下直流脾，肺DC表达后如病毒感染8,14切换到一个成熟的一个不成熟的表型。
综上所述，肺直流隔离的特定子集，通过描述的协议，提供了一个独特的工具，可以帮助确定在宿主的免疫反应的具体作用和/或肺直流的贡献，并可以应用到任何实验小鼠模型涉及呼吸道的研究。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者想对她的帮助与细胞分选和彼得莫特拉姆在路易斯安那州立大学流式细胞仪核心设施，协助他与显微感谢玛丽莲迪特里希。这项工作是由乘务员医学研究所，路易斯安那州立大学的竞争的研究计划奖，以及美国国立卫生研究院/ NIAID的资助P20 RR020159和R03AI081171。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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