Summary
En højtrenset forberedelse af musen lunge dendritiske celler er beskrevet. Særlig vægt gives til isolering af konventionelle dendritiske celler delmængde.
Abstract
Lung dendritiske celler (DC) spiller en fundamental rolle i sensing invaderende patogener 1,2 samt i kontrollen af tolerogenic svar 3 i luftvejene. Mindst tre delmængder af lunge dendritiske celler er blevet beskrevet i mus: konventionelle DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 og IFN-producerende killer DC (IKDC) 6,7. CDC delmængde er den mest fremtrædende DC delmængde i lungerne 8.
Den fælles markør kendt for at identificere DC delmængder er CD11c, en type I transmembrane integrin (β2), som også er udtrykt på monocytter, makrofager, neutrofile og nogle B-celler 9. I nogle væv, bruger CD11c som markør for at identificere musen DC gyldig, som i milten, hvor de fleste CD11c + celler repræsentere CDC delmængde, der udtrykker høje niveauer af de store histocompatibility komplekse klasse II (MHC-II). Men lungen er en mere heterogen væv, hvor derside DC delmængder, der er en høj procentdel af en særskilt cellepopulation, der udtrykker høje niveauer af CD11c anfald lave niveauer af MHC-II. Baseret på at karakterisere og for det meste på sin udtryk for F4/80, en milt makrofag markør, har CD11c hi MHC-II lo lunge cellepopulation blevet identificeret som pulmonale makrofager 10 og senere, som en potentiel DC forløber 11.
I modsætning til mus PDC, har studiet af den særlige rolle, CDC i det pulmonale immunforsvar været begrænset på grund af manglen på en specifik markør, der kunne hjælpe i isolation af disse celler. Derfor, i dette arbejde, beskriver vi en procedure for at isolere højtrenset musen lunge CDC. Isolering af pulmonale DC delmængder repræsenterer et meget nyttigt redskab til at opnå indsigt i funktionen af disse celler som reaktion på respiratoriske patogener såvel som miljømæssige faktorer, der kan udløse værtens immunrespons i lungerne.
Protocol
1. Lunge perfusion og enkelt celle suspension
- Aflive musen med en intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin bedøvelse blanding (i mg / mus ketamin 1,8, xylazin 0,19) og afblødning via collum vene
- Expose brysthulen ved at klippe og forsigtigt at trække tilbage den ydre hud af bughinden. Fortsæt at åbne mellemgulvet ved at skære i brystkassen til at afsløre både hjerte og lunger.
- Perfuse forsigtigt lungerne ved hjælp af en 5 ml sprøjte fyldt med EDTA-HBSS (1 mm EDTA i calcium / magnesium-fri HBSS). Tilslut en 25 G nål og Stik nålen ind i højre hjertekammer. For at forhindre lækage under injektionen, sikre myocardiac vævet omkring nålen ved at bruge pincet. Forsigtigt injicere opløsningen og samtidig opretholde et konstant tryk. Nøjagtig perfusion vil resultere i lungen inflation og et farveskift til pink / hvid.
- Fjern afdrypning lymfeknuder at smide enhver potentiel forurening fra dette væv.
- Samllungevæv, som overføres til en petriskål på is, og hak det til små stykker ved hjælp af et barberblad.
- Overførsel jordet vævet ind i et gentleMACS C rør, der indeholder 5 ml / lunge collagenase fordøjelse opløsning (collagenase typen 1A 0,5 mg / ml plus type IV kvæg bugspytkirtlen DNase 20 mg / ml i HBSS indeholder 5% FBS, 100 E / ml penicillin og 100 mikrogram / ml streptomycin).
- Brug gentleMACS dissociator at opnå en enkelt celle suspension. Vælg program: m_lung_01. Inkuber prøven ved 37 ° C i 30 minutter. Ryst røret hver 5 minutter til resuspendere væv fragmenter. Fortsæt med program m_lung_02.
- Overførsel prøve til en 15 ml konisk rør og centrifugeres i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C. Efter dette trin, holde alle reagenser og centrifugations ved 4 ° C for at undgå reduktion i cellernes levedygtighed.
- Kassér supernatanten og lyseres tilbageværende røde blodlegemer ved at tilsætte 2 ml ACK Lysing buffer i 1 minut ved stuetemperatur. Vask cellerne med 13ml kold PBS/0.5% BSA og centrifuger i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten, resuspender alt cellerne i 5 ml kold PBS/0.5% BSA og bestå grundig en 100 mM nylon mesh.
- Bestem det samlede celle nummer ved hjælp trypan blå udelukkelse farvestof.
2. Magnetisk isolation og CD11c + celler berigelse
- Centrifuge enkelt celle suspension i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C og smid supernatant.
- Resuspender cellepelleten i 400 μl af separation buffer (PBS, 0,5% BSA, og 2 mM EDTA) pr 10 8 totale celler. Block Fc-medieret uspecifikke antistof binding ved hjælp anti-CD16/CD32 antistof (0.5μg / 10 6 celler) i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 10 ml koldt adskillelse buffer og centrifuger i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C. Resuspender cellerne i 400 μl af adskillelse buffer.
- Tilsæt 100 μl af CD11c mikrokugler pr 10 8
- Vask cellerne med 10 ml koldt adskillelse buffer og centrifuger i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C og smid supernatant.
- Resuspender cellepelleten i 3 ml koldt adskillelse buffer.
- Udfør magnetisk separation ved hjælp af autoMACS Pro TM Separator ved at vælge programmet posseld. Saml de positive fraktion (0,5 ml).
3. Konventionel dendritiske celle (CDC) isolation
- Inkuber beriget CD11c positive cellesuspension med anti-CD11c PE-Cy7 og anti-IA/IE (MHC-II)-FITC antistoffer i 30 minutter ved 4 ° C. Optimeret koncentration af antistoffer er 0,5 mikrogram / 10 6 celler.
- Vask cellerne med koldt PBS/0.5% BSA og centrifuger i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C. Resuspender cellerne i 0,5 ml PBS/0.5% BSA og videregive dem gennem et 40 μm nylon mesh.
- Fortsæt tilsortere celler ved hjælp af FACS Aria celle sorteringsanlæg i renheden mode. Tilsæt 100 μl af PBS/0.5% BSA til samlingen rør for at forhindre beskadigelse af renset celler. Hold dine celler på en nedkølet temperatur i hele cellesortering processen.
4. Alternativ protokol for at opnå en enkelt celle suspension og CD11c + celler berigelse
- Ved udskiftning af gentleMACS dissociator, kan jordforbindelse lungevæv fra trin 1,5 overføres til en 15 ml koniske rør, der indeholder 5 ml collagenase opløsning pr lunge og inkuber i 1 time ved 37 ° C. Vortex celler hver 15 minutter for at resuspendere væv fragmenter. Forstyrre vævet ved at bestå prøven 6-8 gange ind og ud gennem en 3 ml sprøjte tilsluttes en 20 G kanyle. Undgå at gøre bobler i løbet af processen, ellers cellernes levedygtighed vil blive kompromitteret. Når enkelt celle suspension er opnået, skal du fortsætte til trin 1.8.
- Ved udskiftning af AutoMACSPro TM sepaTor, magnetisk isolering til berigelse af CD11c celler, kan også udføres ved at vælte cellesuspensionen manuelt gennem to MACS kolonner. Udvælgelsen af de relevante kolonner vil variere afhængig af prøvens størrelse.
5. Repræsentative resultater:
Lung CDC er identificeret som CD11c hi / MHC-II hi cellepopulation. Som vist i Fig. 1, CDC udgør en mindre andel på 1,4% i forhold til nogle andre væv såsom milt (4,8%). Men i modsætning til milt, udtrykke lunge CD11c positive celler forskellige mængder af MHC-II, herunder en cellepopulation anderledes end den, CDC. Efter encellede forberedelse, var cellen udbyttet af de samlede lungeceller omkring 3,0 til 3,8 x 10 7 celler / lunge med en levedygtighed på 60-70%, hvorfra en lidt over 1% repræsenterede CDC delmængde. Denne procentdel var steget efter CD11c magnetisk isolation, hvor de samlede lungen CDC blev øges ca 10 tIME'er (> 16%) fra den oprindelige forberedelse (Fig. 2A). Men CD11c celler, der udtrykker lave mængder MHC-II (CD11c hi / MHC-II lo, makrofager) repræsenterede en stor forurener cellepopulation (> 70%), som blev blandet med lunge CDC delmængde. Som vist i Fig. 2B blev disse celler fjernet efter cellesortering skridt, når CDC renhed nåede> 96%. Den sædvanlige udbytte af CDC, efter at hele proceduren var 5 x 10 4 celler / lunge. Microphotographs viser morfologiske karakteristika CDC som afrundede celler med den typiske dendritter (øverste panel). På den anden side, er repræsenteret CD11c hi / MHC-II lød en morfologisk anden delmængde, der viser cellulære udvækster, som er typiske af makrofager (MΦ, nederste panel) 12.
Figur 1. Differential DC hyppighed hos mus lunge og milt. Lung ennd milt væv fra C57BL / 6 mus blev indsamlet og behandlet med collagenase. Efter collagenase fordøjelsen, blev cellerne farvet med anti-mus CD11c-PE-Cy7 og anti-mus IA / IE-FITC. Repræsentant flowcytometri plots viser procentdele af CDC (CD11c hi / MHC-II hi) i lunge og milt.
Figur 2. Isolation af CDC fra muse-lunge. Mouse lunge enkelt celle suspension var mærket med anti-CD11c mikrokugler og ledes gennem en automatisk celleseparator. A) En repræsentant plot viser procentdele af CDC (CD11c hi / MHC-II hi) og makrofager (MΦ, CD11c hi / MHC-II lo) populationer efter CD11c berigelse. Yderligere farvning af den berigede fraktion fulgt ved hjælp af anti-mus CD11c-PE-Cy7 og anti-mus IA / IE-FITC. Dobbelt positive celler blev sorteret og analyseret af flowcytometri. Tilidentificere deres morfologi, blev cellerne cytospun og farves med en modificeret Wright-Giemsa farvning. B) repræsentant parceller viser procentdele af CDC og MΦ efter celle sortering. Microphotographs vise et repræsentativt billede af lunge CDC og lunge MΦ. Skala bar = 20 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering af pulmonal musen DC er en vigtig teknik til studiet af en bred vifte af respiratoriske stimuli. Processen med at opnå disse celler indeholder vigtige skridt, der forhindrer tab af celler samt cellernes levedygtighed og renhed. Perfusing lungen før kollektionen vil medvirke til at fjerne enhver perifere celler samt reducere forurenende erytrocytter. Brugen af automatiserede dissociation kan advanteogus, når et stort antal lunger håndteres, ellers kan du vælge den alternative protokol holde sig for øje, at spredningen af vævet efter collagenase fordøjelse skal gøres forsigtigt, når du er færdig manuelt. Inkubationstiden af lungevævet mens der i collagenase opløsning bør ikke forlænges ud over den angivne inkubationstid. Efter dette trin, skal de resterende processen gøres ved hjælp af is-kold buffere og nedkølet centrifuger til at reducere celledød. Den lyse af forurenende erytrocytter er et skridt, som ikke bør gentages mere tHan to gange under hele processen. Passing cellesuspensionen gennem en nylon mesh på det angivne trin, er afgørende for at undgå tilstopning af cellen sorteringsanlæg samt at reducere celle aggregater, som vil gå på kompromis cellen renhed. Hvis yderligere kultur in vitro af isolerede celler er involveret, skal alle trin udføres under et biosikkerhed skab for at undgå enhver form for forurening. Det forventes ikke, at cellen sortering skridt vil kompromittere sterilitet af prøven.
Dendritiske celler er afgørende for studier af det medfødte og adaptive immunsystem interaktioner. Den beskrevne procedure har potentialet til at blive anvendt til isolering af andre DC delmængder hvis det er relevant antistoffer anvendes under de magnetiske isolation og cellen sortering 8. Derudover kan pulmonale makrofager (CD11c hi / MHC-II lo) også blive renset fra den samme celle forberedelse. Trods det begrænsede antal af pulmonale DC, der kan isoleres pr dyr by ved hjælp af denne procedure, denne teknik giver den mest præcise system til at studere lunge DC. Men forud for DC isolation, kan mus blive behandlet med FMS-Like tyrosinkinase 3 (Flt3-) ligand, en agent, der øger DC numrene 13. Selvom milt DC kan være lettere og hurtigere at isolere, skal forskelle i modning tilstand DC i lunger og milt blive taget i betragtning. I modsætning til milt DC-, lunge-DC udtrykke en umoden fænotype, der er skiftet til en moden ene efter fx en virusinfektion 8,14.
Sammenfattende gennem den beskrevne protokol, isolering af de specifikke delmængder af lunge DC, giver et unikt værktøj, der kan hjælpe til at bestemme den specifikke rolle og / eller bidrag af pulmonal DC i værtens immunrespons og kan anvendes på enhver eksperimentel musemodel , der omfatter undersøgelse af luftvejene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke for at Marilyn Dietrich på LSU Flowcytometri Core facilitet for hendes hjælp med cellesortering og Peter Mottram for hans hjælp med microphotographs. Dette arbejde blev finansieret af Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-kompetitive forskning Program Award, og NIH / NIAID Tilskud P20 RR020159 og R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J.
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
