Summary
Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.
Abstract
Lung dendritische cellen (DC) spelen een fundamentele rol in sensing binnendringende ziekteverwekkers 1,2 als in de controle van tolerogene reacties 3 in de luchtwegen. Ten minste drie belangrijke subsets van long dendritische cellen zijn beschreven bij muizen: de conventionele DC (CDC) 4, plasmacytoïde DC (PDC) 5 en de IFN-producerende killer DC (IKDC) 6,7. De CDC subset is de meest prominente DC subset in de longen 8.
De gemeenschappelijke marker bekend bij DC subsets te identificeren is CD11c, een type I transmembraan integrine (β2), die ook tot uitdrukking op monocyten, macrofagen, neutrofielen en een aantal B-cellen 9. In sommige weefsels, met behulp van CD11c als een marker voor muis-DC te identificeren geldig is, net als in de milt, waar de meeste CD11c + cellen vertegenwoordigen de CDC-subset die hoge niveaus van de belangrijkste histocompatibiliteitscomplex klasse II (MHC-II) uitdrukt. Echter, de long is een meer heterogeen weefsel waar wordenkant DC subsets, is er een hoog percentage van een afzonderlijke cel bevolking die hoge niveaus van CD11c uitdrukt bout lage niveaus van MHC-II. Op basis van haar karakterisering en meestal op de uitdrukking van F4/80, een milt macrofaag marker, heeft de CD11c hi MHC-II-lo long celpopulatie is geïdentificeerd als pulmonaire macrofagen, 10 en meer recentelijk, als een potentiële voorloper DC 11.
In tegenstelling tot de muis PDC, heeft de studie van de specifieke rol van CDC in de pulmonale immuunreactie te wijten aan het ontbreken van een specifieke marker die kan helpen bij de isolatie van deze cellen beperkt. Daarom is in dit werk beschrijven we een procedure om sterk gezuiverd muis long CDC isoleren. De isolatie van pulmonale DC subsets is een zeer nuttig instrument om inzicht in de functie van deze cellen te krijgen in reactie op respiratoire pathogenen alsmede milieu-factoren die de gastheer immuunreactie in de longen kan leiden.
Protocol
1. Longperfusie en enkele celsuspensie
- Euthanaseren van de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine anesthesiemengsel (in mg / muis ketamine 1,8, xylazine 0,19) en verbloeding via de lies
- Expose de borstholte door het snijden en voorzichtig terug te trekken de buitenste schil van het buikvlies. Ga verder naar het membraan openen door het snijden van de ribbenkast aan zowel het hart en de longen bloot te leggen.
- Perfuseren zachtjes de longen met behulp van een 5 ml injectiespuit gevuld met EDTA-HBSS (1 mM EDTA in calcium / magnesium-vrij HBSS). Sluit een 25 G naald en steek naald in de rechter hartkamer. Om te voorkomen dat lekkage tijdens de injectie, zet de myocardiac weefsel rond de naald met behulp van een tang. Voorzichtig te injecteren oplossing met behoud van een constante druk. Nauwkeurige perfusie zal resulteren in long inflatie en een kleur te veranderen naar roze / wit.
- Verwijder de drainerende lymfeklieren om eventuele besmetting van dit weefsel te verwijderen.
- Verzamelenlongweefsel, over te dragen aan een petrischaaltje op het ijs, en hak het in kleine stukjes met behulp van een scheermesje.
- Overdracht van de grond weefsel in een gentleMACS C buisje met 5 ml / long van collagenase spijsvertering oplossing (collagenase type 1A 0,5 mg / ml plus type IV runderen alvleesklier DNase 20 pg / ml in HBSS dat 5% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine).
- Gebruik de gentleMACS dissociator om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Kies het programma: m_lung_01. Incubeer monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Schud buis om de 5 minuten naar weefselfragmenten mengen. Ga verder met het programma m_lung_02.
- Transfer monster tot een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C. Na deze stap, houden alle reagentia en centrifugations bij 4 ° C tot vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen te voorkomen.
- Gooi supernatant en lyseren resterende rode bloedcellen door het toevoegen van 2 ml van ACK lyseren buffer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Was de cellen met 13ml koude PBS/0.5% BSA en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C.
- Gooi supernatant, resuspendeer totaal cellen in 5 ml koud PBS/0.5% BSA en passeren een grondige 100 um nylon mesh.
- Bepaal het totale aantal cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting kleurstof.
2. Magnetische isolatie en CD11c + cellen verrijking
- Centrifuge enkele celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C en gooi supernatant.
- Resuspendeer celpellet in 400 ul van scheiding buffer (PBS, 0,5% BSA, en 2 mM EDTA) per 10 in totaal 8 cellen. Block Fc-gemedieerde niet-specifieke binding van antilichaam door gebruik te maken anti-CD16/CD32 antilichaam (0.5μg / 10 6 cellen) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen met 10 ml koude scheiding buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 400 ul van scheiding buffer.
- Voeg 100 ul CD11c microkorrels per 10 8
- Was de cellen met 10 ml koude scheiding buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C en gooi supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 3 ml koud scheiding buffer.
- Voer magnetische scheiding met behulp van de autoMACS Pro TM Separator door het selecteren van het programma posseld. Verzamel de positieve fractie (0,5 ml).
3. Conventionele dendritische cel (CDC) isolatie
- Incubeer verrijkt CD11c positieve celsuspensie met anti-CD11c PE-Cy7 en anti-IA/IE (MHC-II)-FITC antilichamen gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Geoptimaliseerd de concentratie van antilichamen is 0,5 ug / 10 6 van cellen.
- Was de cellen met koude PBS/0.5% BSA en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 0,5 ml PBS/0.5% BSA en geven ze door een 40 urn nylon mesh.
- Ga verder naarsorteert de cellen met behulp van de FACS Aria celsorteerder in de zuiverheid mode. Voeg 100 ul van PBS/0.5% BSA aan de collectie buizen in om schade van gezuiverde cellen te voorkomen. Houd uw cellen bij een gekoelde temperatuur in de cel sorteerproces.
4. Alternatief protocol voor het verkrijgen van een enkele cel schorsing en CD11c + cellen verrijking
- Ter vervanging van de gentleMACS dissociator, kan de grond longweefsel van stap 1.5 worden overgedragen aan een 15 ml conische buis met 5 ml van de oplossing per collagenase long en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Vortex cellen elke 15 minuten om weefselfragmenten mengen. Verstoren het weefsel door het passeren van het monster 6-8 keer in en uit door middel van een 3 ml spuit is aangesloten op een 20 G naald. Voorkomen dat bellen tijdens het proces, anders wordt de levensvatbaarheid van de cellen worden aangetast. Zodra enkele celsuspensie wordt verkregen, gaat u verder tot 1,8 stap.
- Ter vervanging van de AutoMACSPro TM scheidingtor, magnetische isolatie voor de verrijking van de CD11c cellen, kunnen ook worden uitgevoerd door het passeren van de celsuspensie handmatig door middel van twee MACS kolommen. De keuze van de juiste kolommen zal variëren afhankelijk van de steekproefomvang.
5. Representatieve resultaten:
Lung CDC worden geïdentificeerd als CD11c hi / MHC-II hi celpopulatie. Zoals getoond in Fig. 1, CDC vertegenwoordigen een kleiner percentage van 1,4% in vergelijking met sommige andere weefsels zoals milt (4,8%). Echter, in tegenstelling tot de milt, long CD11c positieve cellen uitdrukkelijke verschillende hoeveelheden van MHC-II, met inbegrip van een celpopulatie anders dan die van de CDC. Na de single-cell voorbereiding, de cel opbrengst van het totaal longcellen was ongeveer 3,0 tot 3,8 x 10 7 cellen / long met een levensvatbaarheid van 60-70%, waaruit een iets meer dan 1% CDC subset vertegenwoordigd. Dit percentage werd verhoogd na de CD11c magnetische isolatie, wanneer de totale long CDC werd opgehoogd ongeveer 10 tIMES (> 16%) van het oorspronkelijke preparaat (Fig. 2A). Echter, CD11c cellen die lage hoeveelheden van MHC-II (CD11c hi / lo MHC-II, macrofagen) vertegenwoordigde een hoge besmetting celpopulatie (> 70%), dat werd vermengd met de longen CDC subset. Zoals getoond in Fig. 2B, waren die cellen geëlimineerd na de celsortering stap wanneer de CDC zuiverheid> 96% bereikt. De gebruikelijke opbrengst van CDC nadat de hele procedure werd 5 x 10 4 cellen / long. Microfoto's tonen morfologische kenmerken van de CDC als afgeronde cellen met de typische dendrieten (bovenste paneel). Aan de andere kant, CD11c hi / lo MHC-II vertegenwoordigde een morfologisch verschillende subset dat cellulaire uitsteeksels die typisch zijn voor macrofagen (MΦ, onderste paneel) 12 shows.
Figuur 1. Differentiële DC-frequentie in de muis longen en milt. Lung eennd milt weefsel van C57BL / 6 muizen werden verzameld en behandeld met collagenase. Naar aanleiding van collagenase spijsvertering, werden cellen gekleurd met anti-muis CD11c-PE-Cy7 en anti-muis IA / IE-FITC. Vertegenwoordiger van flowcytometrie plots tonen percentages van de CDC (CD11c hi / MHC-II hi) in de longen en milt.
Figuur 2. Isolatie van de CDC van muis longen. Muis long enkele celsuspensie werd gelabeld met anti-CD11c microbolletjes en doorgegeven door middel van een automatische cel afscheider. A) Een vertegenwoordiger plot toont de percentages van de CDC (CD11c hi / MHC-II hi) en macrofagen (MΦ, CD11c hi / lo MHC-II) populaties na CD11c verrijking. Verdere kleuring van de verrijkte fractie gevolgd met behulp van anti-muis CD11c-PE-Cy7 en anti-muis IA / IE-FITC. Dubbele positieve cellen werden gesorteerd en geanalyseerd door flowcytometrie. Naaridentificeren van hun morfologie, cellen werden cytospun en gekleurd met een aangepaste Wright-Giemsa kleuring. B) Representatieve percelen tonen percentages van CDC en MΦ na celsortering. Microfoto's tonen een representatief beeld van de longen CDC en long MΦ. Schaalbalk = 20 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolatie van pulmonale muis DC is een belangrijke techniek voor de studie van een breed scala van respiratoire stimuli. Het proces van het verkrijgen van deze cellen bevat cruciale stappen die het verlies van cellen en levensvatbaarheid van de cellen en zuiverheid te voorkomen. Perfusie van de long voor de collectie zal helpen om een perifere cellen te elimineren als contaminant erytrocyten te verminderen. Het gebruik van de geautomatiseerde dissociatie kan worden advanteogus wanneer een groot aantal van de longen worden afgehandeld, anders kunt u kiezen voor de alternatieve protocol, rekening houdend dat de spreiding van het weefsel na collagenase vertering moet voorzichtig worden gedaan wanneer handmatig gedaan. De incubatietijd van het longweefsel, terwijl in collagenase oplossing mag niet worden verlengd na de aangegeven incubatietijd. Na deze stap, moet het resterende proces worden gedaan met behulp van ijs-koude buffers en gekoelde centrifuges tot celdood te verminderen. De lysis van erytrocyten besmetten is een stap die niet mag worden herhaald meer than twee keer tijdens het hele proces. Het passeren van de celsuspensie door middel van een nylon mesh, op de aangegeven stappen, is cruciaal voor verstopping van de cel sorter, alsook naar cel aggregaten die de cel zuiverheid zal verminderen compromis te voorkomen. Als verdere cultuur in vitro van de geïsoleerde cellen betrokken is, moeten alle stappen worden uitgevoerd onder een bioveiligheid kast om verontreiniging te voorkomen. Het is niet te verwachten dat de cel het sorteren stap zal de steriliteit van het monster compromis.
Dendritische cellen zijn cruciaal voor studies van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem interacties. De beschreven procedure heeft de potentie om te worden toegepast voor de isolatie van andere DC-subsets indien van toepassing antilichamen worden gebruikt tijdens de magnetische isolatie en de cel sorteren 8. Daarnaast kunnen pulmonaire macrofagen (CD11c hi / lo MHC-II) ook gezuiverd worden uit dezelfde cel voorbereiding. Ondanks het beperkte aantal pulmonale DC die kunnen worden geïsoleerd per dier by het gebruik van deze procedure, deze techniek geeft de meest accurate systeem om long DC te bestuderen. Echter, voorafgaand aan de DC-isolatie, konden muizen worden behandeld met FMS-net als tyrosine kinase 3 (Flt3-) Ligand, een middel dat verhoogt DC nummers 13. Hoewel de milt DC kan gemakkelijker en sneller te isoleren, moet de verschillen in de rijping toestand van de DC in de longen en de milt worden in aanmerking genomen. In tegenstelling tot de milt DC-, long-DC geven van een onvolwassen fenotype dat is een volwassen een geschakeld na bijvoorbeeld een virale infectie 8,14.
Kortom, het isolement van de specifieke subsets van long DC door de beschreven protocol, zorgt voor een uniek instrument dat kan helpen om de specifieke rol en / of inbreng van pulmonale DC in de ontvangende immuunreacties te bepalen en kan worden toegepast op elk experimenteel muismodel die inhoudt dat de studie van de luchtwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar Marilyn Dietrich danken aan het LSU Flow Cytometry Core Faciliteit voor haar hulp met de cel sorteer-en Peter Mottram voor zijn hulp bij de microfoto's. Dit werk werd gefinancierd door de Flight Attendant Medical Research Institute, het LSU-Competitive Research Program Award, en de NIH / NIAID Subsidies P20 RR020159 en R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J.
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
