Summary
הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.
Abstract
תאים דנדריטים ריאות (DC) לשחק תפקיד מהותי חישה הפולש 1,2 פתוגנים כמו גם בשליטה על התגובות tolerogenic 3 בדרכי הנשימה. לפחות שלושה תת העיקרי של התאים הדנדריטים ריאות תוארו בעכברים: DC קונבנציונלי (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 ו IFN-בהפקת הרוצח DC (IKDC) 6,7. משנה ה-CDC היא משנה DC הבולטים הריאה 8.
סמן משותף ידוע לזהות תת DC היא CD11c, סוג אני הטרנסממברני integrin (β2) אשר באה לידי ביטוי גם על מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים חלק מתאי B 9. ברקמות מסוימות, באמצעות CD11c כסמן העכבר לזהות DC תקף, כמו הטחול, שם רוב התאים + CD11c לייצג את קבוצת המשנה CDC המבטא רמות גבוהות של הגדולים מורכבים histocompatibility מחלקה II (MHC-II). עם זאת, הריאה היא רקמה הטרוגנית יותר להיות שםצד תת DC, יש אחוז גבוה של האוכלוסייה תא ברורים המבטא רמות גבוהות של CD11c התקף רמות נמוכות של MHC-II. בהתבסס על האפיון שלה בעיקר על ביטויו של F4/80, סמן macrophage הטחול, היי CD11c MHC-II תא lo האוכלוסייה ריאות זוהה מקרופאגים ריאתי 10 ולאחרונה, כמבשר פוטנציאל DC 11.
בניגוד עכבר PDC, ללמוד את התפקיד הספציפי של ה-CDC בתגובה החיסונית ריאתי הוגבל בשל היעדר של סמן מסוים שיכול לעזור בבידוד של תאים אלה. לכן, בעבודה זו אנו מתארים הליך לבודד מטוהרים עכבר ריאות CDC. הבידוד של ריאתי תת DC מייצג כלי מאוד שימושי כדי לקבל תובנות לתוך הפונקציה של תאים אלה בתגובה פתוגנים בדרכי הנשימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את התגובה החיסונית לארח בריאה.
Protocol
1. ריאות זלוף ההשעיה תא בודד
- להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של תערובת ההרדמה קטאמין / xylazine (ב mg / עכבר 1.8 קטמין, xylazine 0.19) ו exsanguination דרך וריד הירך
- לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך משיכתו בעדינות בחזרה את העור החיצוני של הצפק. המשך כדי לפתוח את הסרעפת על ידי חיתוך החזה כדי לחשוף גם את הלב והריאות.
- Perfuse בעדינות את הריאות באמצעות מזרק 5 מ"ל מלאים EDTA-HBSS (1mm EDTA סידן / מגנזיום ללא HBSS). חבר מחט 25 G ו להכניס מחט לתוך החדר הימני. כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה, לאבטח את הרקמה myocardiac סביב המחט באמצעות מלקחיים. בעדינות להזריק פתרון תוך שמירה על לחץ קבוע. זלוף מדויק תגרום לאינפלציה ריאה ושינוי צבע ורוד / לבן.
- הסר ניקוז בלוטות הלימפה כדי לבטל כל אפשרות של זיהום מן הרקמה הזאת.
- לגבותרקמת הריאה, להעביר בצלחת פטרי על קרח, לקצוץ אותו לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח.
- העברת רקמה מעוגנת לתוך צינור gentleMACS C המכיל 5 מ"ל / ריאות של פתרון העיכול collagenase (collagenase סוג 1A 0.5 מ"ג / מ"ל בתוספת סוג IV שור הלבלב DNase 20 מיקרוגרם / מ"ל ב HBSS המכיל 5% FBS, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל).
- השתמש dissociator gentleMACS לקבל השעיה תא בודד. בחר תוכנית: m_lung_01. דגירה מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Shake צינור כל 5 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. המשך m_lung_02 התוכנית.
- העברת מדגם צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. לאחר שלב זה, לשמור את כל ריאגנטים centrifugations ב 4 ° C כדי למנוע ירידה כדאיות התא.
- בטל supernatant ו lyse הנותרים כדוריות דם אדומות על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ lysing ACK דקה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 13 תאיםמ"ל של BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C.
- בטל supernatant, תאים הכולל resuspend ב 5 מ"ל של BSA PBS/0.5% קר לעבור יסודית רשת ניילון 100 מיקרומטר.
- קבע את מספר הסלולרי סך באמצעות trypan צבע כחול הדרה.
2. בידוד מגנטי והעשרה CD11c + תאים
- צנטריפוגה ההשעיה תא בודד במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב 400 μl של חיץ ההפרדה (PBS, BSA 0.5%, ו - 2 mM EDTA) לכל 10 8 תאים בסך הכל. בלוק Fc בתיווך נוגדנים נוקבים מחייב באמצעות anti-CD16/CD32 נוגדן (0.5μg / 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- שטפו תאים עם 10 מ"ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C. Resuspend תאים μl 400 של חיץ ההפרדה.
- הוסף 100 μl של microbeads CD11c לכל 10 8
- שטפו תאים עם 10 מ"ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של חיץ ההפרדה קר.
- בצעו הפרדה מגנטי באמצעות מפריד Pro autoMACS TM ידי בחירת posseld התוכנית. אסוף את חלק חיובי (0.5 מ"ל).
3. הדנדריטים בתא בידוד קונבנציונלי (CDC)
- דגירה מועשר CD11c ההשעיה התא חיובי עם אנטי CD11c PE-Cy7 ו anti-IA/IE (MHC-II), FITC נוגדנים במשך 30 דקות 4 ° C. ריכוז מיטבי של נוגדנים הוא 0.5 מיקרוגרם / 10 6 תאים.
- שטפו תאים עם BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 0.5 מ"ל של BSA PBS/0.5% ולהעביר אותם דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר.
- המשךלמיין את התאים באמצעות סדרן תא FACS Aria במצב טוהר. הוסף 100 μl של BSA PBS/0.5% ל צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים מטוהרים. שמור את התאים בטמפרטורה בקירור לאורך כל תהליך מיון התא.
4. פרוטוקול חלופי לקבלת ההשעיה תא בודד והעשרה CD11c + תאים
- בשנת החלפת dissociator gentleMACS, רקמת הריאה מעוגנת משלב 1.5 ניתן להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת collagenase לכל ריאה דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C. וורטקס תאים כל 15 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. לשבש את הרקמה על ידי העברת מדגם 6-8 פעמים פנימה והחוצה דרך מזרק 3 מ"ל קשור מחט G 20. הימנע עושה בועות בתהליך, אחרת הכדאיות התא יהיה בסכנה. לאחר ההשעיה תא בודד מתקבל, המשך לשלב 1.8.
- בשנת החלפת TM AutoMACSPro separaטור, בידוד מגנטי להעשרת התאים CD11c, יכולה גם להתבצע על ידי העברת מתלה התא באופן ידני באמצעות שתי עמודות MACS. בחירת העמודות המתאימות ישתנה בהתאם לגודל המדגם.
5. נציג תוצאות:
ריאות CDC מזוהים CD11c היי / MHC-II האוכלוסייה היי התא. כפי שמוצג באיור. 1, ה-CDC מהווים אחוז קטן יותר של 1.4% לעומת כ ברקמות אחרות כגון הטחול (4.8%). עם זאת, בניגוד טחול, ריאות תאים CD11c חיובית לבטא כמויות שונות של MHC-II, כולל האוכלוסייה תא שונה מזו של ה-CDC. לאחר הכנה מתא בודד, התשואה של התא לתאי ריאה הכולל היה כ 3.0-3.8 x 10 7 תאים / ריאות עם הכדאיות של 60-70% ממנה קצת מעל 1% מיוצג משנה CDC. אחוז זה עלה לאחר בידוד המגנטי CD11c שבו הריאות CDC הכולל היה מוגדל כ 10 times (> 16%) מן הכנה המקורי (איור 2A). עם זאת, תאים CD11c לבטא כמויות נמוכות של MHC-II (CD11c היי / MHC-II והנה, מקרופאגים) ייצג האוכלוסייה גבוה תא מזהם (> 70%) אשר היה מעורב עם תת הריאה ה-CDC. כפי שמוצג באיור. 2B, תאים אלה בוטלו לאחר שלב המיון, כאשר תא טוהר CDC הגיע> 96%. התשואה הרגילים של ה-CDC לאחר ההליך כולו היה 5 x 10 4 תאים / ריאות. Microphotographs להראות מאפיינים מורפולוגיים של ה-CDC כמו תאים מעוגלים עם דנדריטים טיפוסי (הפאנל העליון). מצד שני, המיוצג על CD11c היי / MHC-II lo תת שונים מורפולוגית שמראה בליטות הסלולר האופייניים של מקרופאגים (MΦ, הפאנל התחתון) 12.
1. איור דיפרנציאלי DC תדירות הריאות והטחול העכבר. ריאותרקמת טחול nd מ C57BL / 6 עכברים נאספו שטופלו collagenase. בעקבות עיכול collagenase, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תזרים נציג מגרשים cytometry להראות אחוזי ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) בתוך הריאות והטחול.
באיור 2. בידוד של ה-CDC מן הריאות העכבר. ריאה עכבר תא בודד ההשעיה סומן עם אנטי CD11c microbeads ויעברו מפריד תא אוטומטי.) נציג העלילה מראה את האחוזים של ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) ו המקרופאגים (MΦ, CD11c היי / MHC-II LO) אוכלוסיות לאחר העשרה CD11c. מכתים נוסף של השבר בעקבות מועשר באמצעות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תאים חיובית כפולה מוינו ונותחו על ידי cytometry הזרימה. אלמורפולוגיה לזהות שלהם, התאים היו cytospun ומוכתמת עם צביעה שונה רייט Giemsa. B) מגרשים נציג להראות אחוזי ה-CDC MΦ לאחר מיון התא. Microphotographs להראות תמונה מייצגת של הריאה-CDC MΦ ריאות. בר סולם = 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בידוד ריאתי עכבר DC היא טכניקה חשובה לחקר מגוון רחב של גירויים בדרכי הנשימה. תהליך קבלת תאים אלה כולל שלבים קריטיים למנוע אובדן של תאים, כמו גם כדאיות התא וטוהר. המרוססת הריאה לפני איסוף יעזור לחסל את כל התאים הפריפריה כמו גם לצמצם את זיהום אריתרוציטים. השימוש ניתוק אוטומטי ניתן advanteogus כאשר מספר גדול של הריאות מטופלים, אחרת אתה יכול לבחור עבור פרוטוקול חלופי, תוך התחשבות כי הפיזור של הרקמה לאחר עיכול collagenase צריך להיעשות בעדינות כאשר נעשה באופן ידני. תקופת הדגירה של רקמת הריאה בעוד פתרון collagenase לא צריך להיות מורחב מעבר לזמן הדגירה המצוין. לאחר שלב זה, התהליך הנותר חייב להיעשות באמצעות קר כקרח buffers ו צנטריפוגות בקירור כדי להפחית מוות של תאים. תמוגה של אריתרוציטים לזהם היא צעד זה לא אמור להיות חזר לא יותרהאן פעמיים במהלך כל התהליך. מירוץ ההשעיה התא דרך רשת ניילון, בכל השלבים המצוין, הוא קריטי כדי למנוע סתימת סדרן של התא, כמו גם להפחית אגרגטים התא אשר תתפשר על טוהר התא. אם התרבות נוספת במבחנה של תאים בודדים הוא מעורב, כל הצעדים חייבים להתבצע מתחת לארון biosafety כדי למנוע זיהום. זה לא צפוי כי צעד מיון התא תתפשר עקרות של המדגם.
תאים דנדריטים הם קריטיים עבור מחקרים של אינטראקציות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. ההליך המתואר יש את הפוטנציאל להיות מיושם עבור בידוד של אחרים תת DC אם הנוגדנים המתאימים המשמשים במהלך הבידוד המגנטי התא מיון 8. בנוסף, מקרופאגים ריאתי (CD11c היי / MHC-II lo) יכול גם להיות מטוהרים מן הכנת תא זהה. למרות המספר המוגבל של ריאתי DC כי יכול להיות מבודד לכל בעל חיים בy באמצעות הליך זה, טכניקה זו מספקת את המערכת המדויקת ביותר ללמוד DC ריאות. עם זאת, לפני בידוד DC, עכברים יכולים להיות מטופלים עם kinase-FMS כמו טירוזין 3 (Flt3-) ליגנד, סוכן אשר מגביר את המספרים DC 13. למרות DC הטחול עשוי להיות קל ומהיר כדי לבודד, ההבדלים במצב ההבשלה של הבירה של הריאות והטחול חייב להילקח בחשבון. בניגוד DC הטחול, הריאות DC להביע פנוטיפ בשלה כי הוא עבר לאחת בוגרת לאחר זיהום ויראלי למשל 8,14.
לסיכום, את הבידוד של תת ספציפיות של הריאות DC באמצעות פרוטוקול המתואר, מספק כלי ייחודי שיכול לעזור לקבוע את התפקיד הספציפי ו / או תרומה של DC ריאתי בתגובות מארח החיסון ניתן להחיל על כל מודל עכבר ניסיוני המערבת את המחקר של דרכי הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למרילין דיטריך במתקן cytometry זרימה LSU Core עזרתה עם מיון התא ופיטר Mottram עזרתו עם microphotographs. עבודה זו מומנה על ידי דיילת מכון המחקר הרפואי, את LSU-תחרותי תוכנית פרס המחקר, ו-NIH / NIAID מענקים P20 RR020159 ו R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J.
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
