Summary
माउस फेफड़ों के वृक्ष के समान कोशिकाओं का एक उच्च शुद्ध तैयारी में वर्णित है. विशिष्ट पारंपरिक वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए जोर दिया जाता है.
Abstract
फेफड़ों के वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) हमलावर रोगज़नक़ों 1,2 tolerogenic प्रतिक्रियाओं के नियंत्रण में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से श्वसन तंत्र में 3 संवेदन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं . फेफड़ों के वृक्ष के समान कोशिकाओं के तीन मुख्य सबसेट कम से कम चूहों में वर्णित किया गया है: पारंपरिक डीसी (सीडीसी) 4, plasmacytoid डीसी (PDC) 5 और IFN उत्पादन हत्यारा (IKDC) डीसी 6,7 . सीडीसी सबसेट 8 फेफड़ों में सबसे प्रमुख डीसी सबसेट है.
डीसी सबसेट की पहचान के लिए जाना जाता है आम मार्कर CD11c, एक प्रकार मैं transmembrane (β2) integrin कि monocytes, मैक्रोफेज, neutrophils और कुछ बी कोशिकाओं 9 पर भी व्यक्त किया है. कुछ ऊतकों में, माउस डीसी की पहचान के लिए एक मार्कर के रूप में CD11c उपयोग के लिए मान्य के रूप में तिल्ली, जहां सबसे CD11c + कोशिकाओं सीडीसी सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं जो प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय (MHC- II) के उच्च स्तर व्यक्त है. हालांकि, फेफड़ों एक अधिक विषम ऊतक कहाँ हो रहा हैपक्ष डीसी सबसेट, वहाँ एक अलग सेल की आबादी का एक उच्च प्रतिशत है कि MHC-II के निम्न स्तर डटकर CD11c के उच्च स्तर व्यक्त है. CD11c हाय MHC-II लो फेफड़ों के सेल की आबादी इसके लक्षण वर्णन पर और ज्यादातर F4/80, प्लीहा बृहतभक्षककोशिका मार्कर के अपनी अभिव्यक्ति पर आधारित है, फेफड़े के 10 और अधिक हाल ही में मैक्रोफेज के रूप में पहचान की गई है एक संभावित डीसी 11 अग्रदूत के रूप में.
माउस PDC करने के लिए इसके विपरीत में, फेफड़े के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सीडीसी की विशिष्ट भूमिका के अध्ययन के एक विशिष्ट मार्कर है कि इन कोशिकाओं के अलगाव में मदद कर सकता है की कमी के कारण सीमित किया गया है. इसलिए, इस काम में, हम करने के लिए एक उच्च शुद्ध माउस फेफड़ों सीडीसी अलग प्रक्रिया का वर्णन. फेफड़े डीसी सबसेट के अलगाव को सांस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोगज़नक़ों पर्यावरणीय कारकों है कि फेफड़ों में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को गति प्रदान कर सकते हैं के जवाब में इन कोशिकाओं के समारोह में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
1. फेफड़ों के छिड़काव और एकल कक्ष निलंबन
- और्विक शिरा के माध्यम से / ketamine xylazine संवेदनाहारी मिश्रण की एक intraperitoneal इंजेक्शन (मिलीग्राम / माउस ketamine 1.8, 0.19 xylazine में) और exsanguination के साथ माउस euthanize
- काटने और धीरे से उसकी पीठ peritoneum के बाहरी त्वचा खींच द्वारा वक्ष गुहा बेनकाब. रिब पिंजरे को काटने के लिए दोनों के दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश द्वारा डायाफ्राम को खोलने के लिए आगे बढ़ें.
- धीरे 5 मिलीलीटर सिरिंज EDTA HBSS (कैल्शियम मैगनीशियम / मुक्त HBSS में 1mm EDTA) के साथ भर का उपयोग फेफड़ों छिड़कना. एक 25 जी सुई कनेक्ट और सही वेंट्रिकल में सुई सम्मिलित. इंजेक्शन के दौरान रिसाव को रोकने के लिए, सुई आसपास myocardiac ऊतक संदंश का उपयोग करके सुरक्षित. धीरे समाधान इंजेक्षन जबकि एक निरंतर दबाव बनाए रखने. सटीक छिड़काव फेफड़ों मुद्रास्फीति और एक गुलाबी सफेद / रंग को बदलने में परिणाम होगा.
- लिम्फ नोड्स draining इस ऊतक से किसी भी संभावित संदूषण त्यागें निकालें.
- लीजिएफेफड़े के ऊतकों, बर्फ पर एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण, और यह एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर छोटे टुकड़े करने के लिए काटना.
- GentleMACS सी युक्त ट्यूब 5 मिलीग्राम / collagenase पाचन समाधान के फेफड़ों में ऊतक जमीन ट्रांसफर (collagenase प्रकार 1A 0.5 मिलीग्राम / एमएल से अधिक प्रकार चतुर्थ गोजातीय अग्नाशय DNase 20 / 5% FBS, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन और 100 μg युक्त HBSS में μg मिलीलीटर / एमएल) स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- GentleMACS dissociator का उपयोग करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त. M_lung_01: कार्यक्रम चुनें. 37 ° C पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं. ट्यूब हर 5 मिनट के लिए ऊतक टुकड़े resuspend हिलाएँ. कार्यक्रम m_lung_02 के साथ आगे बढ़ें.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र नमूना 4 बजे 10 मिनट के लिए 335 x जी पर स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस इस कदम के बाद, 4 पर सभी अभिकर्मकों और centrifugations रखने ° सी सेल व्यवहार्यता में कमी को रोकने के लिए.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ACK lysing बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर शेष लाल रक्त कोशिकाओं lyse. 13 के साथ कोशिकाओं धोठंड PBS/0.5% BSA और 335 x छ पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस के मिलीलीटर
- ठंड PBS/0.5% BSA के 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend कुल कोशिकाओं को त्यागें और पूरी तरह से एक 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल के पास.
- Trypan नीले अपवर्जन डाई का उपयोग करके कुल सेल नंबर का निर्धारण करते हैं.
2. चुंबकीय अलगाव और CD11c + कोशिकाओं संवर्धन
- X 200 छ में 10 मिनट के लिए एकल कक्ष निलंबन और 4 ° C में अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागने .
- जुदाई बफर के 400 μl में Resuspend सेल 10 8 कुल कोशिकाओं के प्रति गोली (Pbs, 0.5% BSA, और 2 मिमी EDTA) . ब्लॉक एफसी की मध्यस्थता unspecific 4 बजे 30 मिनट के लिए anti-CD16/CD32 एंटीबॉडी (कोशिकाओं 0.5μg / 6 10) का उपयोग करके बाध्यकारी एंटीबॉडी डिग्री सेल्सियस
- ठंड जुदाई बफर और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं 4 x 200 छ में 10 मिनट के लिए धो डिग्री सेल्सियस जुदाई बफर के 400 μl में कोशिकाओं Resuspend.
- 8 10 प्रति CD11c microbeads के 100 μl जोड़ें
- 4 ° C में x 200 छ में 10 मिनट के लिए ठंडे जुदाई बफर और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं धो और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- ठंड जुदाई बफर के 3 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend.
- चुंबकीय जुदाई प्रदर्शन कार्यक्रम posseld चुनकर autoMACS प्रो टीएम विभाजक का उपयोग . सकारात्मक अंश (0.5 मिलीलीटर) लीजिए.
3. परम्परागत (सीडीसी) के वृक्ष के समान सेल अलगाव
- सेते विरोधी CD11c पीई Cy7 और anti-IA/IE (MHC-II) FITC एंटीबॉडी 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के साथ समृद्ध CD11c सकारात्मक सेल निलंबन एंटीबॉडी के अनुकूलित एकाग्रता / 0.5 μg कक्षों की 6 10 है.
- ठंड PBS/0.5% BSA और 335 x छ पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं को धो PBS/0.5% BSA के 0.5 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं और उन्हें एक 40 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल के माध्यम से पारित.
- के लिए आगे बढ़ेंपवित्रता मोड में FACS Aria सेल सॉर्टर का उपयोग करके कक्षों सॉर्ट करें. संग्रह ट्यूबों PBS/0.5% BSA के 100 μl जोड़ें क्रम में शुद्ध कोशिकाओं के नुकसान को रोकने. अपनी कोशिकाओं सेल छँटाई प्रक्रिया के दौरान एक प्रशीतित तापमान पर रखें.
4. एक एकल कक्ष निलंबन और CD11c + कोशिकाओं संवर्धन प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल
- GentleMACS dissociator के प्रतिस्थापन में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 कदम से जमीन फेफड़े के ऊतकों एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार 1 घंटे के लिए प्रति फेफड़े और सेते collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है भंवर हर 15 मिनट कोशिकाओं क्रम में ऊतक के टुकड़े resuspend. नमूना में और बाहर एक 3 मिलीलीटर सिरिंज एक 20 जी सुई से जुड़ा के माध्यम से 6-8 बार गुजर द्वारा ऊतकों को बाधित. प्रक्रिया के दौरान बुलबुले बनाने से बचें, अन्यथा सेल व्यवहार्यता समझौता हो जाएगा. एक बार एकल कक्ष निलंबन प्राप्त की है, कदम 1.8 जारी है.
- AutoMACSPro टीएम separa के प्रतिस्थापन मेंटो, CD11c कोशिकाओं के संवर्धन के लिए चुंबकीय अलगाव, सेल निलंबन दो एमएसीएस स्तंभों के माध्यम से मैन्युअल रूप से गुजर द्वारा किया जा सकता है है. उचित कॉलम का चयन नमूना आकार के आधार पर भिन्न हो जाएगा.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
फेफड़े सीडीसी CD11c हाय / MHC-II हाय सेल की आबादी के रूप में पहचाने जाते हैं. जैसा छवि में दिखाया गया है. 1, सीडीसी 1.4% के एक छोटे प्रतिशत जब तिल्ली (4.8%) जैसे कुछ अन्य ऊतकों की तुलना में प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, तिल्ली करने के लिए इसके विपरीत में, फेफड़ों CD11c सकारात्मक कोशिकाओं MHC-II के विभिन्न मात्रा व्यक्त सीडीसी की तुलना में अलग सेल आबादी सहित. एकल कक्ष की तैयारी के बाद, कुल फेफड़ों की कोशिकाओं के सेल उपज के बारे में 3.0 से 3.8 x 10 7 / जिसमें से एक छोटे से 1% से अधिक 60-70% की एक व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं को फेफड़ों सीडीसी सबसेट का प्रतिनिधित्व था. यह प्रतिशत जहां कुल फेफड़ों सीडीसी के बारे में 10 टी incremented था CD11c चुंबकीय अलगाव के बाद बढ़ा दिया गया थाIMEs मूल तैयारी (2A छवि) से (% 16>). हालांकि, CD11c MHC द्वितीय (CD11c हाय / लो MHC-II, मैक्रोफेज) की कम मात्रा में व्यक्त कोशिकाओं एक उच्च contaminating सेल (> 70%) आबादी है जो फेफड़ों सीडीसी सबसेट के साथ मिलाया गया था का प्रतिनिधित्व किया. जैसा छवि में दिखाया गया है. 2B, उन कोशिकाओं सेल छँटाई कदम जब सीडीसी पवित्रता> 96% तक पहुँच के बाद समाप्त किया गया. पूरी प्रक्रिया के बाद सीडीसी के सामान्य उपज 5 10 4 कोशिकाओं / फेफड़ों के एक्स था . Microphotographs ठेठ dendrites (ऊपरी पैनल) के साथ गोल कोशिकाओं के रूप में सीडीसी के morphological विशेषताओं दिखाओ. दूसरी ओर, CD11c हाय / लो MHC-II एक आकृति विज्ञान के विभिन्न सबसेट है कि सेलुलर protuberances जो मैक्रोफेज (MΦ, कम पैनल) 12 के विशिष्ट हैं पता चलता है का प्रतिनिधित्व किया .
चित्रा 1. माउस फेफड़े और तिल्ली में विभेदकों डीसी आवृत्ति. एक फेफड़ेतिल्ली ऊतक एन डी C57BL / 6 चूहों से एकत्र किया गया और collagenase के साथ इलाज किया. Collagenase पाचन के बाद, कोशिकाओं माउस विरोधी CD11c पीई - Cy7 और विरोधी माउस आइए / IE-FITC के साथ दाग थे. प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंडों सीडीसी के फेफड़े और तिल्ली में प्रतिशत (CD11c हाय / हाय MHC-II) दिखाते हैं.
चित्रा 2 सीडीसी के माउस फेफड़ों से अलगाव माउस फेफड़ों एकल कक्ष निलंबन विरोधी CD11c microbeads के साथ लेबल किया गया था और एक स्वचालित सेल विभाजक के माध्यम से पारित ए) एक प्रतिनिधि साजिश सीडीसी का प्रतिशत (CD11c हाय / हाय MHC-II) से पता चलता है और.. मैक्रोफेज (MΦ, CD11c हाय / लो MHC-II) CD11c संवर्धन के बाद आबादी. समृद्ध अंश के आगे धुंधला CD11c पीई Cy7 विरोधी माउस और विरोधी माउस आइए / IE-FITC का उपयोग कर पीछा किया. डबल सकारात्मक कोशिकाओं को हल थे और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया. सेकी पहचान उनकी आकारिकी, कोशिकाओं cytospun थे और दाग के साथ एक संशोधित राइट Giemsa धुंधला. बी) के प्रतिनिधि भूखंडों सीडीसी के प्रतिशत और सेल छँटाई के बाद MΦ दिखाने . Microphotographs फेफड़ों सीडीसी और फेफड़ों MΦ के एक प्रतिनिधि छवि दिखाते हैं. स्केल बार = 20 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
फेफड़े माउस डीसी के अलगाव सांस उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. इन कोशिकाओं को प्राप्त करने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम है कि कोशिकाओं के नुकसान के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल व्यवहार्यता और पवित्रता को रोकने के शामिल है. संग्रह से पहले फेफड़ों Perfusing किसी भी परिधीय कोशिकाओं को खत्म करने में मदद के रूप में अच्छी तरह के रूप में contaminant एरिथ्रोसाइट्स कम हो जाएगा. स्वचालित पृथक्करण का उपयोग advanteogus जब फेफड़ों की एक बड़ी संख्या को नियंत्रित किया जाता है कर सकते हैं, अन्यथा आप वैकल्पिक प्रोटोकॉल के लिए चुनते हैं, को ध्यान में रखते हुए कि collagenase पाचन के बाद ऊतक के फैलाव धीरे किया जाना चाहिए जब मैन्युअल रूप से किया कर सकते हैं. फेफड़े के ऊतकों के ऊष्मायन अवधि collagenase समाधान में जबकि संकेत ऊष्मायन समय से परे नहीं बढ़ाया जाना चाहिए. इस कदम के बाद, शेष प्रक्रिया कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए ठंडा buffers और प्रशीतित centrifuges का उपयोग करने के लिए किया जाना चाहिए. contaminating एरिथ्रोसाइट्स के lysis एक कदम है कि अधिक टी दोहराया नहीं जाना चाहिए हैदो बार हान पूरी प्रक्रिया के दौरान. एक नायलॉन जाल के माध्यम से सेल निलंबन पासिंग, संकेत कदम पर, सेल सॉर्टर के clogging के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल समुच्चय है जो सेल शुद्धता समझौता होगा कम से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि आगे संस्कृति अलग कक्षों के इन विट्रो में शामिल है, सभी कदम एक जैव सुरक्षा के लिए किसी भी प्रदूषण को रोकने के कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए. यह उम्मीद नहीं है कि सेल छँटाई कदम नमूने के बाँझपन समझौता होगा.
वृक्ष के समान कोशिकाओं को सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा बातचीत के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं. वर्णित प्रक्रिया अन्य डीसी सबसेट के अलगाव के लिए लागू हो सकता है अगर उचित एंटीबॉडी चुंबकीय अलगाव और सेल 8 छँटाई के दौरान इस्तेमाल किया जाता है की क्षमता है . इसके अलावा, फेफड़े मैक्रोफेज (CD11c हाय / लो MHC-II) को भी एक ही सेल तैयारी से शुद्ध किया जा सकता है. फेफड़े के डीसी कि पशु ख प्रति अलग किया जा सकता है है की सीमित संख्या के बावजूदy इस कार्यविधि का उपयोग करते हुए, इस तकनीक का सबसे सटीक प्रणाली फेफड़ों के डीसी का अध्ययन प्रदान करता है. हालांकि, डीसी अलगाव से पहले, चूहों tyrosine एफएमएस तरह 3 kinase (- FLT3) ligand, एक एजेंट है कि डीसी संख्या बढ़ जाती है 13 के साथ इलाज किया जा सकता है. हालांकि तिल्ली डीसी आसान और तेजी से अलग करने के लिए हो सकता है, फेफड़े और तिल्ली में डीसी की परिपक्वता राज्य में मतभेद को ध्यान में रखा जाना चाहिए. तिल्ली डीसी, फेफड़ों डीसी एक अपरिपक्व phenotype है कि जैसे एक वायरल संक्रमण 8,14 के बाद एक परिपक्व करने के लिए बंद है व्यक्त करने के लिए इसके विपरीत.
सारांश में, फेफड़ों डीसी के विशिष्ट सबसेट के अलगाव प्रोटोकॉल के माध्यम से वर्णित, एक अद्वितीय उपकरण है कि विशिष्ट भूमिका और / या मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में फेफड़े के डीसी के योगदान का निर्धारण और किसी भी प्रयोगात्मक माउस मॉडल को लागू किया जा सकता मदद कर सकते हैं प्रदान करता है कि श्वसन तंत्र का अध्ययन शामिल है.
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Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों LSU फ्लो Cytometry कोर सुविधा microphotographs के साथ उनकी सहायता के लिए सेल छँटाई और पीटर Mottram के साथ उसकी मदद के लिए मर्लिन Dietrich के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान, LSU अनुसंधान प्रतियोगी कार्यक्रम पुरस्कार, और NIH / NIAID RR020159 P20 और R03AI081171 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J.
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
