Summary
마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.
Abstract
폐암 돌기 세포 (DC)는 호흡기 tolerogenic 응답의 제어뿐만 아니라 3 침입 병원균 1,2를 감지의 근본적인 역할을한다. 폐암 돌기 세포 중 적어도 세 가지 주요 하위 집합은 생쥐에서 설명되었습니다 : 종래의 DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 IFN 생산 킬러 DC (IKDC) 6,7. CDC 집합은 폐 8 가장 유명한 DC의 하위 집합입니다.
DC의 하위 집합을 식별하는 것으로 알려진 일반적인 마커는 CD11c, 유형 I 또한, monocytes, macrophages, neutrophils 및 일부 B 세포 9 표현 transmembrane 인테 그린 (β2)입니다. 일부 조직에서는, 마우스 DC를 식별하는 마커로 CD11c를 사용하면 대부분의 CD11c + 세포가 주요 histocompatibility 복잡한 클래스 II (MHC - II)의 높은 수준을 표현 CDC의 하위 집합을 나타냅니다 비장에 같은 유효합니다. 그러나, 폐는 더 이질적인 조직입니다사이드 DC의 하위 집합은 MHC - II의 낮은 수준의 한판 승부 CD11c 높은 수준을 표현 뚜렷한 세포 인구의 높은 비율 있습니다. 의 특성과 대부분 F4/80, 지라 대식 세포 표지 자사의 표현에 따르면, CD11c 하이 MHC - II 그런 건 폐 전지 인구가 잠재적인 DC 전구체 11로, 폐동맥 macrophages 최근 10으로 확인되었습니다.
마우스 PDC 대조적으로, 폐의 면역 반응에 CDC의 특정 역할의 연구는 이러한 세포의 격리에 도움이 될 특정 마커의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서,이 작품에서 우리는 고도로 정제된 마우스 폐 질병을 분리하는 절차를 설명합니다. 폐 DC의 하위 집합의 분리는 호흡기 병원균뿐만 아니라 폐의 호스트 면역 반응을 일으킬 수있다 환경 요인에 대한 응답에서 이러한 세포의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 매우 유용한 도구를 나타냅니다.
Protocol
1. 폐 재관류 및 단일 세포 현탁액
- 대퇴 정맥을 통해 intraperitoneal 케타민을 / xylazine 마취 혼합물의 주입 (MG / 마우스 케타민을 1.8, xylazine 0.19) 및 과다와 마우스를 안락사
- 절단하고 부드럽게 복막의 바깥쪽 피부를 다시 당겨 흉강을 폭로. 심장과 폐 모두 노출 갈빗대 절단하여 다이어프램을 열 진행합니다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - HBSS (칼슘 / 마그네슘없는 HBSS에 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 가득 5 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 폐가 Perfuse. 25 G 바늘을 연결하고 우심실에 바늘을 삽입합니다. 주사하는 동안 누출을 방지하기 위해, 집게를 사용하여 바늘 주위 myocardiac 조직을 확보. 상수 압력을 유지하면서 부드럽게 솔루션을 주입. 정확한 재관류는 폐암의 인플레이션과 분홍색 / 흰색 색상의 변화가 발생합니다.
- 이 조직에서 잠재적인 오염을 폐기하기 위해 림프절을 배수 제거합니다.
- 수집폐 조직은 얼음에 페트리 접시에 전송하고, 면도날을 사용하여 작은 조각으로 썰어.
- 5 ML / collagenase의 소화 솔루션의 폐를 포함하는 gentleMACS C 관에 근거 조직을 전송 (collagenase 유형 1A 0.5 MG / ML 플러스 유형 IV 소 췌장 DNase 20 5% FBS, 100 U / ML 페니실린과 100 μg이 포함된 HBSS에 μg / ML ML의 스트렙토 마이신) /.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 gentleMACS의 dissociator을 사용합니다. m_lung_01 : 프로그램을 선택합니다. 30 분 37 ° C에서 샘플을 품어. 관에게 조직 조각을 resuspend 위해 5 분마다 흔들어. 프로그램 m_lung_02 진행합니다.
- 4 335 X g에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 샘플을 전송 ° C. 이 단계 후, 4 시에 시약 및 centrifugations을 유지 ° C가 세포 생존의 감소를 방지합니다.
- 뜨는을 취소하고 실온에서 1 분 ACK lysing 버퍼 2 ML을 추가하여 나머지 적혈구를 lyse. 13 세포를 씻으십시오4 335 X g에서 10 분 동안 차가운 PBS/0.5 %의 BSA와 원심 분리기 ° C.의 ML
- 차가운 PBS/0.5 %의 BSA 5 ML에 뜨는, resuspend 총 세포를 버리고 100 μm의 나일론 메쉬를 철저하게 전달합니다.
- trypan 파랑 제외 염료를 사용하여 전체 휴대폰 번호를 확인합니다.
2. 자기 고립과 CD11c + 세포의 농축
- 4 ° C에서 200 X g에서 10 분간 단일 세포 현탁액을 원심 분리기와 뜨는 폐기.
- 10 8 전체 세포마다 분리 버퍼 400 μl에 Resuspend 세포 펠렛 (PBS, 0.5 % BSA, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 4 30 분 anti-CD16/CD32 항체 (0.5μg / 10 6 셀)를 사용하여 바인딩을 차단 FC - 중재 unspecific 항체 ° C.
- 4 200 X g에서 10 분 동안 차가운 분리 버퍼와 원심 분리기 10 ML과 세포를 씻으 ° C. 분리 버퍼 400 μl의 세포를 Resuspend.
- 10 8 회 CD11c MicroBeads 100 μl 추가
- 4 ° C에서 200 X g에서 10 분 동안 차가운 분리 버퍼와 원심 분리기 10 ML과 세포를 씻고 뜨는 폐기.
- 감기 분리 버퍼 3 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend.
- 프로그램 posseld를 선택하여 autoMACS 프로 TM 구분 기호를 사용하여 자기 분리를 수행합니다. 긍정적인 분율 (0.5 ML)를 수집합니다.
3. 기존 돌기 세포 (CDC) 격리
- 반 CD11c PE - Cy7 및 anti-IA/IE (MHC - II) FITC 항체 30 분 동안 4 ° C.와 함께 품어 풍부한 CD11c 양성 세포 현탁액 항체의 최적화된 농도는 세포의 0.5 μg / 10 6입니다.
- 4 335 X g에서 10 분 동안 차가운 PBS/0.5 %의 BSA와 원심 분리기 ° C.로 세포를 씻어 Resuspend PBS/0.5 %의 BSA의 0.5 ML의 세포와 40 μm의 나일론 메쉬을 통해 전달합니다.
- 로 이동순결 모드에서 FACS의 아리아 셀 분류기를 사용하여 세포를 정렬합니다. 정화 세포의 손상을 방지하기 위해 수집 튜브에 PBS/0.5 %의 BSA 100 μl를 추가합니다. 셀 정렬 과정에 걸쳐 냉장 온도에서 세포 보관하십시오.
4. 단일 세포 현탁액 및 CD11c + 세포 농축을 얻기위한 대체 프로토콜
- gentleMACS의 dissociator의 교체에서 단계 1.5에서 접지된 폐 조직은 37 ° C.에서 1 시간 동안 폐암과 부화 당 collagenase 솔루션의 5 ML을 포함한 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다 와동은 세포 매 15 분 조직 조각을 resuspend하기 위해서. 에서 밖으로 20 G 바늘에 연결된 3 ML의 주사기를 통해 샘플에게 6-8 번 통과하여 조직을 중단. 과정에서 거품을 만들어 피하십시오, 달리 세포 생존이 위험해질 것입니다. 단일 세포 현탁액이 얻어되면 1.8 단계로 진행합니다.
- AutoMACSPro TM separa의 교체에토르, CD11c 세포의 강화를위한 자기 절연은 또한 두 맥 컬럼을 통해 수동으로 세포 현탁액을 전달하여 수행할 수 있습니다. 해당 컬럼의 선택은 샘플 크기에 따라 달라집니다.
5. 대표 결과 :
폐 CDC는 CD11c 하이 / MHC - II 안녕하세요 셀룰라 인구로 구분됩니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1, CDC는 비장 (4.8 %) 등의 다른 조직에 비해 1.4 %의 적은 비율을 나타냅니다. 그러나, 비장과는 달리, 폐 CD11c 양성 세포는 CDC보다 다른 세포 인구를 포함하여, MHC - II의 다른 양의 표현한다. 단일 셀 준비 후, 총 폐 세포의 세포 수율은 3.8-3.0에 대해 조금있는에서 1 % 이상 60-70%의 가능성과 함께 X 10 7 세포 / 폐암은 CDC의 하위 집합을 표현했다. 이 비율은 전체 폐암 CDC가 약 10 T를 증가했던 CD11c 자성 분리 후 증가되었습니다원래 준비 (그림 2A)에서 imes (> 16 %). 그러나, MHC - II (CD11c 하이 / MHC - II 이오, macrophages)의 낮은 금액을 표현하는 CD11c 세포가 폐 CDC 집합과 혼합되었다 높은 오염 세포 인구 (> 70 %) 대표. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2B, 그 세포는 CDC 순도가> 96 %에 도달 셀 정렬 단계 이후에 제거했다. 전체 절차 이후에 CDC의 일반적인 수율은 5 X 10 4 셀 / 폐되었습니다. Microphotographs은 전형적인 dendrites (상단 패널)와 둥근 세포로 CDC의 형태학의 특성을 보여줍니다. 한편, CD11c 안녕하세요 / MHC - II 소호 macrophages (MΦ, 낮은 패널) 12 전형적인 세포 protuberances를 보여줍니다 morphologically 다른 하위 집합을 나타낸다.
마우스 폐와 비장 그림 1. 차동 DC 주파수. 폐C57BL / 6 마우스에서 차 비장 조직을 collagenase와 수집 치료를했다. collagenase의 소화 다음, 세포는 반 마우스 CD11c - PE - Cy7 및 안티 마우스 IA / IE - FITC로 얼룩진했다. 대표 유동세포계측법의 플롯은 폐와 비장의 CDC의 비율 (CD11c 하이 / MHC - II 안녕)를 보여줍니다.
그림 2. 마우스 폐에서 CDC의 분리. 마우스 폐 단일 세포 현탁액을 방지 CD11c microbeads으로 표시하고 자동으로 셀 분리 통과.) 대표 줄거리는 CDC의 비율 (CD11c 하이 / MHC - II 안녕)를 보여 주며되었습니다 Macrophages (MΦ, CD11c 안녕하세요 / MHC - II 싸다) CD11c 농축 후 인구. 농축 분율의 추가 얼룩 방지 - 마우스 CD11c - PE - Cy7 및 안티 마우스 IA / IE - FITC을 사용하여 따라갔다. 이중 긍정 세포 분류와 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 에자신의 형태를 확인, 세포가 수정 라이트 - Giemsa의 얼룩과 cytospun과 스테인드되었습니다. B) 대표 플롯은 CDC의 비율과 셀 정렬 후 MΦ을 보여줍니다. Microphotographs는 폐 질병 통제 센터와 폐 MΦ의 대표 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm의.
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Discussion
폐 마우스 DC의 격리가 호흡기 자극의 다양한 연구를위한 중요한 기술이다. 이러한 세포를 얻는 과정은 세포의 손실뿐만 아니라 세포 생존과 정결을 방지 중요한 단계를 포함하고 있습니다. 수령 전에 폐가 Perfusing 것은 물론 오염 물질을 감소 적혈구와 같은 주변 세포를 제거하는 데 도움이 될 것입니다. 폐 다수의 처리 때 자동 분리의 사용 advanteogus 수있다 그렇지 않으면 수동으로 완료되면 collagenase는 소화 후 조직의 분산이 부드럽게 수행되어야한다는 것을 염두에 유지, 대체 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 폐 조직의 잠복기는 collagenase 솔루션 동안 지정된 부화 시간 이상 연장해서는 안됩니다. 이 단계 후에, 나머지 과정은 세포 사망을 줄이기 위해 얼음처럼 차가운 버퍼 및 냉장 원심 분리기를 사용하여 수행할 수 있어야합니다. 오염 적혈구의 용해 더 t 반복하지 말았어야 할 단계입니다두 번 한 전체 과정. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 통과, 지정된 단계에서 세포 분류기의 막히는뿐만 아니라 세포 순결을 손상됩니다 셀 집계를 줄이기 위해를 방지하기 위해 중요합니다. 분리된 세포의 체외에서 자세한 문화 관련되어있는 경우, 모든 단계는 어떤 오염을 방지하기 위해 biosafety 캐비닛에 따라 수행되어야합니다. 이것은 셀 정렬 단계는 시료의 불임을 손상 것으로 기대하지 않습니다.
돌기 세포는 본래과 적응 면역의 상호 작용 연구를위한 중요한 있습니다. 설명한 절차는 적절한 항체가 자기 고립과 8 정렬 셀 때 사용하는 경우 다른 DC의 하위 집합의 격리를 위해 적용할 수있는 잠재력이있다. 또한, 폐 macrophages (CD11c 하이 / MHC - II 싸다)도 동일한 셀 준비에서 정화 수 있습니다. 동물 B 당 격리 수 폐동맥 DC의 제한된에도 불구하고Y는이 프로 시저를 사용하여,이 기술은 폐 DC를 공부하는 가장 정확한 시스템을 제공합니다. 그러나, 이전 DC 절연에, 생쥐는 FMS - 티로신 키나제와 마찬가지로 3 (Flt3 -) 리간드, DC 번호에게 13 증가 요원과 함께 치료를 수 있습니다. 비장의 DC가 분리 쉽고 빠르게 할 수 있지만, 폐 및 비장에있는 DC의 성숙 상태의 차이가 고려되어야합니다. 비장 DC, 폐 DC 표현 예 : 바이러스 감염 8,14 후 성숙 한 전환하는 미숙 표현형 대조적으로.
요약, 폐 DC의 특정 하위 집합의 격리는 설명 프로토콜을 통해 호스트 면역 반응의 구체적인 역할 및 / 또는 폐 DC의 공헌을 결정하고 모든 실험 마우스 모델에 적용할 수있는 데 도움이 독특한 도구를 제공합니다 그것은 호흡기의 연구를 포함한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자 microphotographs 그의 도움을 셀 정렬과 피터 Mottram 함께 그녀의 도움 LSU의 유동세포계측법 코어 시설에서 마릴린 디트리히에 감사드립니다. 이 작품은 비행 수행자 의학 연구소, LSU 경쟁력 연구 프로그램 수상, 그리고 NIH / NIAID 기금 P20 RR020159 및 R03AI081171에 의해 후원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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