Summary
Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.
Abstract
Las células pulmonares dendríticas (DC), juegan un papel fundamental en la detección de 1,2 patógenos invasores, así como en el control de las respuestas tolerogénicas 3 en el tracto respiratorio. Al menos tres subgrupos principales de las células dendríticas del pulmón se han descrito en ratones: CC convencionales (CDC) 4, plasmocitoide DC (PDC) 5 y el asesino DC IFN-producción (IKDC) 6,7. El subconjunto de los CDC es el subconjunto DC más destacados en el pulmón 8.
El marcador común conocida para identificar subgrupos de DC CD11c es, un tipo que la integrina transmembrana (β2) que también se expresa en monocitos, macrófagos, neutrófilos y algunas células B 9. En algunos tejidos, con CD11c como marcador para identificar ratón DC es válido, como en el bazo, donde la mayoría de las células CD11c + representan el subconjunto de los CDC, que expresa los altos niveles del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II). Sin embargo, el pulmón es un tejido más heterogénea, donde sesubconjuntos lado DC, hay un alto porcentaje de una población de células distintas que expresa los altos niveles de CD11c pelea niveles bajos de MHC-II. Con base en su caracterización y sobre todo en su expresión de F4/80, un marcador de macrófagos del bazo, el CD11c alta MHC-II pulmonar he población celular ha sido identificado como macrófagos pulmonares 10 y más recientemente, como un posible precursor de DC 11.
En contraste con el ratón PDC, el estudio de la función específica de los CDC en la respuesta inmune pulmonar ha sido limitado debido a la falta de un marcador específico que podría ayudar en el aislamiento de estas células. Por lo tanto, en este trabajo se describe un procedimiento para aislar altamente purificada de pulmón de ratón CDC. El aislamiento de los subconjuntos pulmonar DC representa una herramienta muy útil para obtener información sobre la función de estas células en respuesta a patógenos respiratorios, así como los factores ambientales que pueden desencadenar la respuesta inmune del huésped en el pulmón.
Protocol
1. Perfusión pulmonar y la suspensión de células individuales
- La eutanasia a los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina mezcla anestésica (en mg / ratón ketamina 1.8, xilazina 0,19) y desangrado por la vena femoral
- Exponer la cavidad torácica por el corte y retraiga la piel exterior del peritoneo. Procederá a la apertura del diafragma por el corte de la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones.
- Perfusión de los pulmones con suavidad utilizando una jeringa de 5 ml llena de EDTA-HBSS (1 mM EDTA en magnesio libre de calcio / HBSS). Conecte una aguja G 25 e insertar la aguja en el ventrículo derecho. Para evitar fugas durante la inyección, seguro que el tejido de miocardio alrededor de la aguja por el uso de fórceps. Inyectar suavemente la solución, manteniendo una presión constante. Perfusión precisa dará lugar a la inflación de pulmón y un cambio de color de rosa / blanco.
- Quitar ganglios linfáticos de drenaje para descartar cualquier posible contaminación de este tejido.
- Recogertejido pulmonar, la transferencia de una placa de Petri en el hielo, y cortar en pedazos pequeños, usando una cuchilla de afeitar.
- La transferencia de tejido a tierra en un tubo de gentleMACS C con 5 ml / pulmón de la solución de colagenasa digestión (colagenasa tipo 1A 0,5 mg / ml, más de tipo IV pancreática bovina DNasa 20 mg / ml en HBSS que contiene 5% de SFB, 100 U / ml penicilina y 100 mg / ml estreptomicina).
- Utilice el disociador gentleMACS para obtener una suspensión de células individuales. Elección del programa: m_lung_01. Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos. Agite el tubo cada 5 minutos para volver a suspender fragmentos de tejido. Proceder con m_lung_02 programa.
- Transferir la muestra a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Después de este paso, tenga todos los reactivos y centrifugados a 4 ° C para evitar una reducción de la viabilidad celular.
- Desechar el sobrenadante y el resto de lisar los glóbulos rojos mediante la adición de 2 ml de tampón de lisis ACK durante 1 minuto a temperatura ambiente. Lavar las células con 13ml de BSA frío PBS/0.5% y centrifugar durante 10 minutos a 335 x g a 4 ° C.
- Deseche las células sobrenadante, el total de resuspender en 5 ml de BSA frío PBS/0.5% y pasa a fondo una malla de 100 micras de nylon.
- Determinar el número total de células mediante el uso de tinte de exclusión con azul tripán.
2. Aislamiento magnético y el enriquecimiento de las células CD11c +
- Centrifugar la suspensión de células individuales de 10 minutos a 200 x g a 4 º C y desechar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 400 l de tampón de separación (PBS, 0,5% de BSA y 2 mM EDTA) por 10 8 células totales. Bloquear Fc-mediada por anticuerpos no específicos de enlace mediante anti-CD16/CD32 anticuerpos (0.5μg / 10 6 células) durante 30 minutos a 4 ° C.
- Lavar las células con 10 ml de tampón de separación frío y centrifugar durante 10 minutos a 200 x g a 4 ° C. Resuspender las células en 400 l de tampón de separación.
- Añadir 100 ml de MicroBeads CD11c por 10 8
- Lavar las células con 10 ml de tampón de separación frío y centrifugar durante 10 minutos a 200 x g a 4 º C y desechar el sobrenadante.
- Resuspender el botón celular en 3 ml de tampón de separación de frío.
- Realizar la separación magnética utilizando el separador autoMACS Pro TM seleccionando el posseld programa. Recoger la fracción positiva (0,5 ml).
3. Células dendríticas convencionales (CDC) de aislamiento
- Incubar enriquecido CD11c suspensión de células positivas a anti-CD11c-PE Cy7 y anti-IA/IE (MHC-II)-FITC anticuerpos durante 30 minutos a 4 ° C. Concentración de anticuerpos optimizado es de 0,5 mg / 10 6 de las células.
- Lavar las células con BSA frío PBS/0.5% y centrifugar durante 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Resuspender las células en 0,5 ml de PBS/0.5% de BSA y pasar a través de una malla de 40 micras de nylon.
- Proceder a laordenar a las células mediante el uso de la FACS Aria clasificador de células en el modo de pureza. Añadir 100 ml de PBS/0.5% de BSA para los tubos de recolección con el fin de prevenir el daño de las células purificadas. Mantener a las células a una temperatura refrigerada durante todo el proceso de separación celular.
4. Protocolo alternativo para la obtención de una suspensión de células individuales y enriquecimiento de las células CD11c +
- En sustitución del disociador gentleMACS, el tejido pulmonar a tierra desde el paso 1.5 se puede transferir a un tubo cónico de 15 ml que contiene 5 ml de solución de colagenasa por los pulmones y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. Vortex células cada 15 minutos con el fin de volver a suspender fragmentos de tejido. Destruir el tejido de pasar la muestra a 6-8 veces de entrada y salida a través de una jeringa de 3 ml conectada a una aguja de 20 G. Evitar hacer burbujas durante el proceso, de lo contrario la viabilidad celular se verá comprometida. Una vez que la suspensión de células individuales se obtiene, continúe con el paso 1.8.
- En sustitución de la separación AutoMACSPro TMtor, aislamiento magnético para el enriquecimiento de las células CD11c, también se puede realizar al aprobar la suspensión de células de forma manual a través de dos columnas de MACS. La selección de las columnas necesarias variarán en función del tamaño de la muestra.
5. Los resultados representativos:
Pulmonar CDC se identifican como CD11c hi / MHC-II la población de células de alta. Como se muestra en la fig. 1, los CDC representan un porcentaje menor del 1,4% en comparación con algunos otros tejidos como el bazo (4,8%). Sin embargo, en contraste con el bazo, el pulmón de células CD11c positivo expresan diferentes cantidades de MHC-II, incluyendo una población de células diferentes que la de los CDC. Después de la preparación de una sola célula, la producción de células de pulmón de células total era de aproximadamente 3,0 a 3,8 x 10 7 células / pulmonar con una viabilidad de 60 a 70% de los cuales un poco más del 1% representado subconjunto CDC. Este porcentaje se incrementó después de que el aislamiento CD11c magnética donde el total del pulmón CDC se incrementó alrededor de 10 tIME (> 16%) de la preparación original (Fig. 2A). Sin embargo, las células que expresan CD11c bajas cantidades de MHC-II (CD11c hi / lo MHC-II, los macrófagos) representa una alta contaminación de la población de células (> 70%), que se mezcló con el subconjunto de pulmón CDC. Como se muestra en la fig. 2B, las células fueron eliminados tras la etapa de clasificación de células, cuando la pureza CDC alcanzó> 96%. El rendimiento normal de los CDC después de todo el procedimiento fue de 5 x 10 4 células / pulmón. Microfotografías muestran las características morfológicas de los CDC como células redondeadas con las dendritas típicas (panel superior). Por otro lado, CD11c hi / lo MHC-II representa un subconjunto morfológicamente diferentes que muestra protuberancias celulares que son típicas de los macrófagos (MΦ, panel inferior) 12.
Figura 1. Diferencial DC frecuencia en el pulmón y el bazo del ratón. Un pulmóntejido º del bazo de ratones C57BL / 6 fueron recogidos y tratados con colagenasa. Después de la digestión colagenasa, las células fueron teñidas con anti-ratón CD11c-PE-IA Cy7 y anti-ratón / IE-FITC. Representante de las parcelas de citometría de flujo muestran los porcentajes de los CDC (CD11c de alta / alta MHC-II) en el pulmón y el bazo.
Figura 2. Aislamiento de los CDC de pulmón de ratón. Suspensión de ratón de pulmón de células individuales fue marcado con anti-CD11c microesferas y pasa a través de un separador celular automático. A) Un gráfico muestra los porcentajes de representación de los CDC (CD11c de alta / alta MHC-II) y macrófagos (MΦ, CD11c hi / lo MHC-II) la población después del enriquecimiento CD11c. Tinción más de la fracción enriquecida seguido utilizando anti-ratón CD11c-PE-IA Cy7 y anti-ratón / IE-FITC. Doble células positivas fueron ordenados y analizados por citometría de flujo. Aidentificar su morfología, las células fueron cytospun y se tiñeron con una versión modificada de Wright-Giemsa tinción. B) Representante parcelas muestran los porcentajes de los CDC y MΦ después de la separación de células. Microfotografías muestran una imagen representativa de pulmón CDC y MΦ pulmón. Barra de escala = 20 micras.
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Discussion
El aislamiento de DC pulmonar del ratón es una técnica importante para el estudio de una amplia gama de estímulos respiratorios. El proceso de obtención de estas células incluye los pasos críticos que impiden la pérdida de las células, así como la viabilidad celular y la pureza. Perfusión del pulmón antes de la recogida ayudará a eliminar las células periféricas, así como reducir los eritrocitos contaminantes. El uso de la disociación puede ser automatizado advanteogus cuando un gran número de los pulmones se manejan, de lo contrario se puede optar por el protocolo alternativo, teniendo en cuenta que la dispersión de los tejidos después de la digestión con colagenasa se debe hacer con cuidado cuando se hace manualmente. El período de incubación del tejido pulmonar, mientras que en la solución de colagenasa no debe extenderse más allá del tiempo de incubación indicado. Después de este paso, el resto del proceso se debe hacer con agua helada y tampones centrífugas refrigeradas para reducir la muerte celular. La lisis de los eritrocitos contaminantes es un paso que no se debe repetir el tHan dos veces durante todo el proceso. Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon, en los pasos indicados, es fundamental para evitar la obstrucción del clasificador de células, así como para reducir los agregados celulares que pondrá en peligro la pureza de la célula. Si la cultura más in vitro de las células aisladas se trata, todos los pasos se deben realizar en un gabinete de bioseguridad para evitar cualquier contaminación. No se espera que el paso de la clasificación de células pondrá en peligro la esterilidad de la muestra.
Las células dendríticas son cruciales para el estudio de las interacciones inmune innata y adaptativa. El procedimiento descrito tiene el potencial de ser aplicado para el aislamiento de otros subgrupos de DC si los anticuerpos adecuados se utilizan durante el aislamiento magnético y la clasificación de células 8. Además, los macrófagos pulmonares (CD11c hi / lo MHC-II) también puede ser purificado a partir de la preparación misma celda. A pesar del número limitado de DC pulmonar que puede ser aislado por animal by mediante este procedimiento, esta técnica proporciona el sistema más preciso para estudiar DC pulmón. Sin embargo, antes del aislamiento DC, los ratones pueden ser tratadas con tipo fms tirosina quinasa 3 (FLT3) ligando, un agente que aumenta el número DC 13. Aunque DC bazo puede ser más fácil y más rápido para aislar, las diferencias en el estado de maduración de la DC en el pulmón y el bazo deben ser tomados en consideración. En contraste con el bazo DC, DC pulmón expresar un fenotipo inmaduro que se cambia a un mercado maduro después de una infección viral por ejemplo, 8,14.
En resumen, el aislamiento de los grupos específicos de pulmón DC a través del protocolo descrito, proporciona una herramienta única que puede ayudar a determinar el papel específico y / o contribución de DC pulmonar en las respuestas inmunitarias del huésped y se puede aplicar a cualquier modelo experimental de ratón que implica el estudio de las vías respiratorias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Marilyn Dietrich en el Centro de Citometría de Flujo LSU central por su ayuda en la clasificación de células, y Mottram Pedro por su ayuda con las microfotografías. Este trabajo fue financiado por el Flight Attendant Medical Research Institute, el Premio de Investigación LSU-programa competitivo, y las subvenciones del NIH / NIAID P20 RR020159 y R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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