Summary
Ett renat beredning av dendritiska mus lungceller beskrivs. Särskild vikt läggs vid isolering av konventionella dendritiska celler delmängd.
Abstract
Lung dendritiska celler (DC) spelar en grundläggande roll i avkänning invaderande patogener 1,2 samt kontroll av tolerogenic svar 3 i luftvägarna. Minst tre huvudsakliga grupper av celler lunga dendritiska har beskrivits i möss: konventionella DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 och IFN-producerande killer DC (IKDC) 6,7. CDC delmängd är den mest framträdande DC delmängd i lungan 8.
Den gemensamma markör kända för att identifiera DC delmängder är CD11c, en typ I transmembrant integrin (β2) som också uttrycks på monocyter, makrofager, neutrofiler och några B-celler 9. I vissa vävnader, med hjälp av CD11c som markör för att identifiera musen DC är giltiga, som i mjälte, där de flesta CD11c + celler representerar CDC delmängd som uttrycker höga nivåer av de stora histocompatibility komplex klass II (MHC-II). Men det är lungan en mer heterogen vävnad där varasidan DC delmängder finns det en hög andel av en distinkt cellpopulation som uttrycker höga nivåer av CD11c anfallen låga nivåer av MHC-II. Baserat på dess karakteristik och främst på dess uttryck F4/80, en mjälten makrofager markör har CD11c hi MHC-II-lo lung cellpopulation identifierats som lungmakrofager 10 och mer nyligen, som en potentiell DC föregångare 11.
I motsats till musen PDC, har studiet av den särskilda roll som CDC i pulmonell immunförsvaret varit begränsad på grund av brist på en specifik markör som kan hjälpa vid isolering av dessa celler. Därför, i detta arbete, beskriver vi ett förfarande för att isolera renat musen lung CDC. Isolering av pulmonell DC delmängder utgör ett mycket användbart verktyg för att få insikt i funktionen hos dessa celler som svar på respiratoriska patogener samt miljöfaktorer som kan utlösa värd immunsvar i lungan.
Protocol
1. Lung perfusion och enda cellsuspensionen
- Euthanize musen med en intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin anestesiblandningar (i mg / mus ketamin 1,8, xylazin 0,19) och exsanguination via femoral ven
- Exponera brösthålan genom att klippa och försiktigt dra tillbaka den yttre huden på bukhinnan. Fortsätt att öppna membranet genom att skära av bröstkorgen för att exponera både hjärta och lungor.
- BEGJUTA försiktigt i lungorna med hjälp av en 5 ml spruta fylld med EDTA-HBSS (1mm EDTA i kalcium / magnesium-fri HBSS). Anslut en 25 G-nål och stick in nålen i höger kammare. För att förhindra läckage under injektion, säkra myocardiac vävnad runt nålen med hjälp av pincetten. Försiktigt injicera lösning samtidigt som ett konstant tryck. Exakt perfusion kommer att resultera i lung-inflation och en färgförändring till rosa / vit.
- Ta bort dränerande lymfkörtlar att göra eventuella föroreningar från denna vävnad.
- Samlalungvävnad, överför till en petriskål på is, och hacka den i små bitar med hjälp av ett rakblad.
- Överför jordad vävnaden i ett gentleMACS C rör som innehåller 5 ml / lunga kollagenas matsmältningen lösning (kollagenas typ 1A 0,5 mg / ml plus typ IV nötkreatur bukspottskörteln DNas 20 mikrogram / ml i HBSS innehåller 5% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 mikrogram / ml streptomycin).
- Använd gentleMACS dissociator att få en enda cell suspension. Välj program: m_lung_01. Inkubera provet vid 37 ° C i 30 minuter. Skaka röret var 5 minuter för att resuspendera vävnad fragment. Fortsätt med programmet m_lung_02.
- Överför provet till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera i 10 minuter vid 335 x g vid 4 ° C. Efter detta steg, hålla alla reagenser och centrifugering vid 4 ° C för att förhindra minskningen av cellernas livskraft.
- Kassera supernatanten och Lyse kvarvarande röda blodkropparna genom att tillsätta 2 ml ACK lyserings buffert i 1 minut vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med 13ml kall PBS/0.5% BSA och centrifugera i 10 minuter vid 335 x g vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten, återsuspendera totalt celler i 5 ml kallt PBS/0.5% BSA och passera grundlig ett 100 mesh ìm nylon.
- Bestäm den totala antalet celler genom att använda trypan blå utanförskap färgämne.
2. Magnetisk isolering och CD11c + celler anrikning
- Centrifugera enda cell, suspension 10 minuter vid 200 x g vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 400 l av separation buffert (PBS, 0,5% BSA, och 2 mM EDTA) per 10 8 totalt celler. Blockera Fc-medierad ospecifik antikroppsbindning med anti-CD16/CD32 antikropp (0.5μg / 10 6 celler) i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 10 ml kallt separation buffert och centrifugera i 10 minuter vid 200 x g vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 400 l av separation buffert.
- Tillsätt 100 ìl CD11c mikrokulor per 10 8
- Tvätta cellerna med 10 ml kallt separation buffert och centrifugera i 10 minuter vid 200 x g vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 3 ml kallt separation buffert.
- Utför magnetisk separation med autoMACS Pro TM Separator genom att markera programmet posseld. Samla de positiva fraktionen (0,5 ml).
3. Konventionella dendritiska celler (CDC) isolering
- Inkubera berikat CD11c positiva cellsuspension med anti-CD11c PE-Cy7 och anti-IA/IE (MHC-II)-FITC-antikroppar i 30 minuter vid 4 ° C. Optimerad koncentrationen av antikroppar är 0,5 mikrogram / 10 6 celler.
- Tvätta cellerna med kallt PBS/0.5% BSA och centrifugera i 10 minuter vid 335 x g vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 0,5 ml PBS/0.5% BSA och passera dem genom en 40 ìm nylon mesh.
- Gå vidare tillsortera celler med hjälp av FACS sorterare Aria cell i renhet läge. Tillsätt 100 ìl PBS/0.5% BSA till samlingen rören för att förhindra skador av renat celler. Håll dina celler på en kyld temperatur i hela cellen sorteringen.
4. Alternativ protokoll för att få en enskild cell fjädring och CD11c + celler anrikning
- I utbyte av gentleMACS dissociator kan jordade lungvävnad från steg 1,5 överföras till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml kollagenas lösning per lunga och inkubera under 1 timme vid 37 ° C. Vortex celler var 15 minuter för att resuspendera vävnad fragment. Stör vävnaden genom att skicka provet 6-8 gånger in och ut genom en 3 ml spruta kopplad till en 20 G nål. Undvik att göra bubblor under processen, annars cellviabiliteten kommer att äventyras. När enskild cell suspension erhålls, fortsätt till steg 1,8.
- I utbyte av AutoMACSPro TM separationenTor, magnetisk isolering för anrikning av CD11c celler, kan också göras genom att skicka cellsuspensionen manuellt genom två MACS kolumner. Valet av lämpliga kolumner kommer att variera beroende på provets storlek.
5. Representativa resultat:
Lung CDC identifieras som CD11c hi / MHC-II hi cellpopulation. Som visas i figur. 1, CDC utgör en mindre andel av 1,4% jämfört med vissa andra vävnader såsom mjälte (4,8%). Men i motsats till mjälten, lungorna CD11c positiva celler uttrycker olika mängder av MHC-II, inklusive ett cellpopulation annorlunda än CDC. Efter den encelliga förberedelser, var cellen avkastningen på totalt lungceller ca 3,0 till 3,8 x 10 7 celler / lunga med en bärkraft på 60-70% där drygt 1% representerade CDC delmängd. Denna procentsats ökade efter CD11c magnetiska isolering där det totala lung CDC ökas ca 10 tIME (> 16%) från den ursprungliga beredningen (Fig. 2A). Men representerade CD11c celler som uttrycker små mängder av MHC-II (CD11c hi / MHC-II lo, makrofager) en hög förorenar cellpopulation (> 70%) som blandas med lungorna CDC delmängden. Som visas i figur. 2B var dessa celler upphört efter cellen sortering steg när CDC renhet nått> 96%. Den vanliga avkastning CDC efter det att hela proceduren var 5 x 10 4 celler / lunga. Mikrofotografier visar morfologiska egenskaper hos CDC som rundade celler med typisk dendriter (övre panelen). Å andra sidan, företrädd CD11c hi / MHC-II lo ett morfologiskt annan delmängd som visar cellulära protuberances som är typiska för makrofager (MΦ, undre panelen) 12.
Figur 1. Differentiell DC-frekvens i mus lunga och mjälte. Lung ettnd mjälte vävnad från C57BL / 6 möss samlades in och behandlades med kollagenas. Efter kollagenas matsmältning, var cellerna färgas med anti-mus CD11c-PE-Cy7 och anti-mus IA / IE-FITC. Representant flödescytometri tomter visar procent av CDC (CD11c hi / MHC-II hi) i lunga och mjälte.
Figur 2. Isolering av CDC från mus lungan. Mouse lunga enda cellsuspension var försedd med anti-CD11c mikrokulor och passerade genom en automatisk cell separator. A) en representant plot visar den procentuella CDC (CD11c hi / MHC-II HI) och makrofager (MΦ, CD11c hi / MHC-II-lo) populationer efter CD11c berikande. Ytterligare färgning av berikade bråkdel följde med anti-mus CD11c-PE-Cy7 och anti-mus IA / IE-FITC. Dubbel positiva celler var sorteras och analyseras med flödescytometri. För attidentifiera deras morfologi, var cellerna cytospun och färgas med en modifierad Wright-Giemsa färgning. b) Representativa tomter visar procentsatser av CDC och MΦ efter cell sortering. Mikrofotografier visar en representativ bild av lung CDC och lunga MΦ. Skala bar = 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering av pulmonell mus DC är en viktig teknik för att studera ett brett spektrum av respiratoriska stimuli. Processen för att erhålla dessa celler innehåller kritiska moment som förhindrar förlust av celler samt cellernas livskraft och renhet. Perfusing lungan innan samlingen kan bidra till att eliminera perifera celler samt minska föroreningar erytrocyter. Användningen av automatiserade dissociation kan advanteogus när ett stort antal lungorna hanteras, annars kan du välja den alternativa protokoll, med tanke på att spridningen av vävnaden efter kollagenas matsmältningen bör göras försiktigt då göras manuellt. Inkubationstiden för lungvävnad medan kollagenas lösning inte bör förlängas efter den angivna inkubationstiden. Efter detta steg måste den återstående processen göras med iskall buffertar och kylda centrifuger för att reducera celldöd. Lys av förorenande erytrocyter är ett steg som inte bör upprepas mer tHan två gånger under hela processen. Passing cellsuspensionen genom ett nylonnät, på angiven steg är avgörande för att förhindra igensättning av cellen sorterare samt att minska cellaggregat som kommer att äventyra cellen renhet. Om ytterligare kultur in vitro av de isolerade celler är inblandade, måste alla steg utföras under en biosäkerhet skåp för att förhindra kontaminering. Det är inte troligt att cellsortering steg äventyra sterilitet provet.
Dendritiska celler är avgörande för studier av medfödda och adaptiva immunförsvaret interaktioner. Det förfarande som beskrivs har potential att användas för isolering av andra DC delmängder vid behov antikroppar används under den magnetiska isolering och cellen sortering 8. Dessutom kan lungmakrofager (CD11c hi / MHC-II-lo) också renas från samma cell beredning. Trots det begränsade antalet pulmonell DC som kan isoleras per djur by med hjälp av detta förfarande ger denna teknik den mest korrekta systemet för att studera lungorna DC. Men innan DC isolering, kunde möss som behandlas med FMS-Som tyrosinkinas 3 (Flt3-) ligand, en agent som ökar DC nummer 13. Även mjälten DC kan vara lättare och snabbare att isolera, måste skillnaderna i mognad tillstånd DC i lungan och mjälten tas i beaktande. I motsats till mjälten DC, lunga DC uttrycka en omogen fenotyp som är bytt till en mogen en efter t.ex. en virusinfektion 8,14.
Sammanfattningsvis, isolering av den specifika undergrupper av lung fm genom den beskrivna protokollet, ger ett unikt verktyg som kan hjälpa till att bestämma den särskilda roll och / eller bidrag pulmonell DC i den mottagande immunsvaret och kan tillämpas på alla experimentella musmodell som innebär studiet av luftvägarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka till Marilyn Dietrich vid LSU flödescytometrisystem Core Facility för hennes hjälp med cellen sortering och Peter Mottram för hans hjälp med mikrofotografier. Detta arbete har finansierats av Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-Competitive Research Program Award och NIH / NIAID Bidrag P20 RR020159 och R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J.
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
