Summary
我々は、大規模な複数の単一ユニットの記録とシリコンプローブとげっ歯類を動作中のローカルフィールドポテンシャルの方法について説明します。ドライブ製造、ドライブとプローブ注入プロセスへのプローブの添付ファイルが簡単に複製するのに十分詳細に示されています。
Abstract
神経科学における主要な課題は、神経アセンブリの集団活動にビヘイビアをリンクしている。ニューロンと回路の入出力の関係の理解は、単離されたニューロンの代表的大規模なサンプルの動作動物、すなわち記録の神経アンサンブルのメカニズム解析のために適切な空間選択性と時間分解能を持つメソッドが必要になります。神経活動のアンサンブルの監視は、被験者1から11を含む小規模および大規模な脳が、両方の動物において過去10年間に著しく進展している。シリコンベースのデバイスで複数のサイトの記録があるため、そのスケーラビリティ、少量の、幾何学的デザインの特に有効である。
ここでは、カスタムメイドのアクセサリコンポーネントを使用して市販のマイクロマシンシリコンプローブを用いて、げっ歯類の動作で複数の単一ニューロンと局所電場電位を記録するための方法について説明します。二つの基本的なオプションfがあります。またはプリアンプにシリコンプローブをインターフェース：プリント回路基板とフレキシブルケーブル。プローブの供給会社（ http://www.neuronexustech.com/ 。 http://www.sbmicrosystems.com/ 。 http://www.acreo.se/ ）は、通常のボンディングサービスを提供し、プリント回路基板に接合プローブを提供するまたはフレキシブルケーブル。ここでは、柔軟なポリイミドケーブルに接続されている4シャンク、32サイトプローブの注入を記述し、可動マイクロドライブに搭載された。プローブ調製、マイクロドライブ、建設、手術の各ステップは、エンドユーザーが簡単にプロセスを複製することができるように図示されている。
Protocol
1。マイクロドライブの構築
電極と頭蓋骨に固定されている固定部を運び可動部：すべてのドライブは、同じ基本的な要素から作られています。理想的なマイクロドライブは、複数の小さなステップの電極の平滑が十分に長い旅を可能にする電極の偶発的な動きを防ぐため、頑丈なことに、動物の行動に干渉することなく、実験者によって操作が簡単、重量の大きさと光の中で小さいです。これらの競合する要求の結果として、異なるドライブ·スイート様々なアプリケーション。
真鍮フラットヘッドネジ、マッチングナット、シングルロウピンヘッダー、2つのカスタムカット真鍮板から調製したプラスチック製のブリッジのみ：4部は、当社の基本的なドライブを構築するために必要とされている。
- ヘッダーから3ピンの部分を破る
- 静かに中央のピンを引き抜きます。
- ドリルビットサイズが＃55とそれを介してドリルで穴を拡大します。
- 目をカット00から90のタップを使用してお読みください。
- 真鍮板二枚を切り取ります。
- Dremmelでプレートの端を提出してください。
- ドリルビットサイズ＃65を使用して、両方の部分の真ん中に穴を開けます。
- 真鍮板がピンに触れているようにドライブの部分を組み立てる。これを達成するために、真鍮板、ねじピン·ヘッダ·ホール、第真鍮板、ナット、連続を通じて、真鍮のネジを挿入します。優しくそうアセンブリが安定になることをしているネジを締めます。
- はんだ端子は真鍮のプレートに終了します。
- ねじの突出末端を提出してください。
- ネジにナットをはんだ。ない真鍮板に半田付けナットを十分に注意してください。
- ドライブの動きをテストします。プラスチック製の橋を高めるために時計回りにネジを回します。
2。シリコンプローブを準備する
ドライブにプローブを固定する前に、cerebrを防ぐために、プローブのボンディング領域に余分な断熱材を追加するospinal液（CSF）または短絡を生産するから湿度：
- 10:1の比率でSylgardエラストマー成分を秤量し、混合します。
- シャープ綿棒を使用して、プローブの先端にSylgardを適用します。
- 2時間60℃に予熱したオーブンで乾燥させます。
記録部位は、任意の残骸を欠いていることを確認するために、プローブ·チップは、洗浄する必要があります。
- Contrad洗剤の4％の希釈を準備します。
- プローブは少なくとも2時間63℃で中性洗剤に浸しましょう。
- 蒸留水で繰り返しプローブを浸漬することにより、洗剤を洗い流してください。
ドライブにプローブを固定する前に、各記録部位のインピーダンスを確認する必要があります。
- 0.9％食塩水にプローブを浸し、インピーダンスメーターに接続します。あまりにも多くの記録部位が間違っインピーダンスは、手順2.4から2.6を持っているか、別のプローブを用いて検討してください。ここでは自家製のチャネルセレクタと組み合わせるフレデリックHaer、株式会社（FHC）からインピーダンス調整モジュールを使用しています。また、Neuralynx、Inc。のNeuroNexus、Inc。またはNanoZによってniPOD同時に、すべてのプローブ·チャネルのインピーダンスを監視することができます。
3。マイクロドライブにプローブを貼付
- かみそりの刃を使用して、堅牢な表面を作成するためにブリッジに複数の溝を切った。
- ドライブのブリッジにプローブを並べる。この手順は、最高のクランプでドライブを保持し、シャンクは、ドライブのネジで完全に平行になるように、マイクロマニピュレータでプローブを調整することにより、手術用顕微鏡下で行われます。これは、それを介して "切断"せずに脳組織にプローブシャンクの移動、前進時にそれを確実にします。ドライブのベースに相対的なプローブ·チップの正確な深さは表面から考慮ターゲット構造の深さを取って、この段階で決定されるべきである頭蓋骨。
- プローブは、その後グリップセメントでブリッジに固定されています。
- オプション：脳内のプローブのトラックを視覚化するため、DII溶液（エタノールで希釈した1から2パーセント）はこの段階では、プローブの背面に適用することができます。
4。頭蓋骨の準備
手術前には、基準とグランド電極と、上のヘッドファラデーケージの部品が用意されています。
- 銅線の2つの2 " - 長い部分と、約1 mmの各絶縁銅線のはんだ一方の端をカットします。
- 針を使用して、それへの銅線の00から90、1/8 "ステンレス製のネジと半田ワンピースの頭をこすり、はんだ付けなどのステンレス鋼の接地ネジ電極には、適切なフラックス（例えば、N-3のすべての目的を必要とするラ社からフラックス）と高いはんだごて先端温度。慎重にネジの溝に流れ込むから任意のはんだを防ぐことができます。これは、接地電極として使用されます。準備するために、別のネジと銅線で繰り返し参照電極。
- 銅メッシュからtrapeziodal部分を切り取ります。これらの作品は、ヘッドを保護するために組み立てられます。
多くの小さな動物の手術で使用されている手術器具と準備は同じです。全体の手術が承認されたNIHのガイドラインに従って、無菌条件を使用して、深いイソフルラン麻酔下で行われます。このビデオに示すように、（モック）手術は、デモンストレーションのみを目的としてあることに注意してください。適切な可視性と撮影の目的は、いくつかの準備手順、手術予防と術後の手順について示した/目に見えるか説明していません。
手術に先立ち、すべてのコンポーネントと電源は、適切な手順（; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdfサバイバル齧歯類の手術のためのガイドラインを参照してください）に続いて、滅菌されるべきである。手術中、頭蓋骨の滅菌フィールドは、滅菌ドレープによって準備され、隔離されています。最後の手術では、広いスペクトルの抗生物質です。ローカルppliedと長時間作用型の鎮痛剤（例えば、ブプレノルフィン、[Buprenex] 0.05 mg / kg）を筋肉内に与えられます。加えて、鎮痛剤（例えば、イブプロフェン）は5日間で約60 mg/kg/24時間で飲料水に記載されています。適切な手術と麻酔の手順については、適切な情報源12を参照してください。
- 定位固定装置に動物をインストールし、剃ると頭皮13を清掃してください。
- 正中線に沿って皮膚を切って、頭皮を脇にプッシュします。 、骨膜を除去するクリーニングと頭蓋骨を乾燥させる。
- ブレグマとラムダとの間の位置との距離を測定し、それに応じて定位アトラス14を使用してプローブの注入部位のx座標とy座標を決定します。メスで頭蓋骨に十字架をこすることで、サイトをマークします。
- 上に別の骨プレート上に、途中で骨に丸頭のドリルビット（サイズ¼）とドライブのサポートネジ（ステンレス鋼、000から120、1/16 "）を使用して頭蓋骨をドリル頭蓋骨の側面を購入する。ネジがしっかりと結合ヘッドギアに頭蓋骨にアンカーを提供します。
- 小脳上の穴をドリルとグランドのステップ4.2で調製した参照電極を挿入します。ローカルフィールドポテンシャル（LFP）を記録するために、リファレンスサイトの選択は重要です。小脳LFPは、この正中線の位置で最小であるすべての皮質領域と筋肉アーティファクトの最小であるため、このサイトが選択されます。
- 頭蓋骨の表面全体に小さなブラシを使用して、象牙質活性化因子（Metabondキット）を適用します。 0.9％食塩水で洗ってください。
- 慎重にアンカーネジとアースと参照電極を覆うが、プローブ注入部位が明確に残して、頭蓋骨に、歯科用セメントを（混合については、製造元の指示に従ってくださいMetabondキット）を適用します。
- 4つの銅メッシュフラップ（ステップ4.3に調製）を頭蓋骨に固定します。このためには、頭蓋骨の前方、左、右、および後部の両側にそれぞれの狭い基盤を固める。番目のeの銅は、骨と直接接触しませんが、常にセメントの層で区切らないでください。
5。脳の表面を準備する
- 頻繁に生理食塩水で骨を潤しながら、丸頭のドリルビットを使用して、複数の段階で移植部位の周りにドリルダウンします。
- 慎重に骨弁を除去し、脳表面を灌漑。
- 複数のシャンクプローブを挿入するため、硬膜の大規模なストリップは削除されます。メスと昆虫針（あるいは、標準タングステン微小電極）から調製されたフック：2つのツールは、硬膜を除去するために必要とされている。硬い表面（例えばガラス顕微鏡スライド）に対して押すことにより、針の先端を曲げて、（ここでは、木製のQ-ティップの一部、あるいはmicrodissectingニードルホルダー）は、ハンドルに取り付けます。
- フックで硬膜を持ち上げて、メスでそれを切る。特別なケアは、PIA、船舶、新皮質の表面の損傷を防ぐために取られます。小さな出血が解決することができます生理食塩水灌漑による。大出血が発生した場合、または新皮質が何らかの方法で侵害された場合は、1つは、手術を終了し、別の動物の作製を検討する必要があります。
6。プローブを注入する
この段階では、皮質表面の血管の密度と配向性を慎重に評価されています。プローブは大きな血管からのフリーエリアでは、脳を貫通しているため、定位座標は、調整する必要があります。
注入は、ドライブ·アセンブリは、定位ホルダーに取り付けられたワニ口クリップで保持することができます。途切れない脳表面の可視性とプローブの先端は成功した侵入のために重要である。
- 常に生理食塩水で開頭術を潤しながら、ゆっくりと、目的のターゲット上で約1ミリメートルにプローブを下げる。新皮質の記録については、プローブ·チップは、皮質に約0.5ミリメートルを下げており、表面の近くに戻って持ち上げた。 ニードル（10 mLのパラフィン油中のワックスの10 20G、65℃で加熱）を介してワックスとパラフィンオイルの温かい溶融混合物を適用することにより、開頭術をシールします。前のアプリケーションに、30°Cにミックスを冷却し、密度をテストします。それは）簡単なプローブの動きを可能にするために十分なソフトでなければなりません。完全なカバレッジを容易にするために、混合物をマイクロcauterizerの先端で硬化したワックスに近づくことによってその場で溶融することができます。
- オンにする無料のナットを残すように注意して、グリップセメントで頭蓋骨にドライブの底部を添付してください。それは、プローブが皮質に損傷を与えますそれ以外の場合は、この段階でドライブのいずれかの偶発的な "バンプ"を回避するために最も重要である。ドライブが頭蓋骨に固定された後、プローブの滑らかな動きを確認する必要があります。
- 頭蓋骨にプローブのコネクタ部分を固める。
7。上のヘッドファラデーケージを構築する
- プルアップ抵抗とプローブとDRI周りに保護シリンダーに銅メッシュフラップを組み立てるVE。シリンダーは、環境ノイズと動作動物中の荷電ウィスカによって生成された徐波の成果物に対して、電気シールドとして機能します。
- 銅メッシュがプローブコネクタの上部レベルですので、余分な材料を離れて切断することによってシリンダーの高さを調整します。
- はんだリファレンスとグランドのネジからコネクタの適切なピンへの配線。また、はんだ隣接する銅メッシュフラップが一緒に銅メッシュにアース線を電気的導通を確保し、はんだ付けします。
- それを強化するため、金属や動物の皮膚の間の任意の直接接触を防ぐために銅メッシュ上にグリップセメントの層を適用します。必要に応じて、さらにヘッドギアを強化するためのエポキシ樹脂の層を適用します。
- ドライブスクリューの動きをテストします。
- ゴム手袋からカット部分とヘッドギアの上部をカバーしています。
8。自由に動く動物の記録
- appropri後術後ケアを食べ、高インピーダンスヘッドステージと軽量、ultraflexibleマルチストランドケーブルを使用して記録システムに動物を接続します。カウンターヘッドギアの重量。
- homecageに毎日記録の品質をテストします。記録部位の位置は、ユニットの発火パターンとローカルフィールドポテンシャルの形状の両方によって判断される。ターゲット構造に達するまで少しずつ（通常は1月8日1日あたり1/4回転まで、すなわち35から70マイクロメートル）でネジを回して徐々にプローブを下げます。
9。代表的な結果
電気信号（ローカルフィールドポテンシャルとユニット活動）が記録された構造と動物の現在の動作に応じて異なります。ラットのオープンフィールドを探求している間に図1は、32チャンネルCA1海馬の録音の例を示します。 supの探査中にローカルフィールドポテンシャルの著名な8ヘルツ（シータバンド）発振に注意してください。複数のシャンクと部位（矢印で示されたスパイクの例）でスパイクerimposed。ニューロンユニットのアクティビティを分析するために、スパイクが検出され、その波形を15から16までのクラスター分析を使用して単一のユニットにソートされます。
図1 4シャンクス×8サイトのシリコンプローブを用いて行動をラットCA1海馬の録音。録音は、広帯域とローカルフィールド電位振動（例えば "シータ"バンド8 Hzのリズム）とニューロンのスパイク活性の両方を勉強することができます20 000 Hzのサンプリングされます。
表1に使用される試薬や機器への代替。
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Discussion
この映画は動作ラットの慢性的な大規模なレコーディング用シリコンプローブの注入手順を示しています。ニューロンの活動の質の録音を確保するための重要なステップは、生物学（脳組織）と技術（シリコンプローブ）材料の両方の脆弱性から生じる。任意のリモート "ハード"面（1つは硬膜を除去せずに脳にそれらを移植しようとした場合、例えば、シャンクが壊れるだろう）とシャンクの接触を避けるために、プローブの処理中に特別な注意が必要です。同様に、脳組織（移植のための脳の表面を準備中、またはそれが移植されると、プローブまたはドライブにぶつかっから）への傷害は、細胞にダメージを与えるとユニット活動の記録を危険にさらすことになるだろう。さらに、接地の電気的パスがconnectoで脳脊髄液、接地ネジ、銅線、銅メッシュフラップとグランド·ピンの間の任意の回路を中断するように、チェックする必要がありますrは、大規模な動きアーチファクトおよび/またはラインノイズ（50 Hzまたは60 Hz）になると思います。ファラデーケージが十分に高くない場合には、突出したマイクロドライブは、アンテナとしての役割を果たすことができる。アンテナ効果は、ドライブだけでなく（はんだドライブと銅メッシュの間に別の銅線）を接地することによって防止することができます。基準信号パスは、同様にチェックする必要があります。
我々は、単一のシリコンプローブの注入を示すが、複数のプローブとドライブを使用して複数のサイトの記録は容易にいくつかの練習の後に行うことができます。さらに、マウス脳のシリコンプローブを注入するために似ていますが、より小さいドライブを使用しています。マルチチャンネル·プリアンプのサイズが小さいと一緒に市販のシリコンプローブとプローブフレックスケーブルコネクタコンポーネントは、大幅に以前の技術に比べて製造工程を単純化しています。今日では、2サイトからのように動作齧歯類で同時に64から128のサイトから録音するように簡単です。わずか10年前にワイヤ電極。
シリコンプローブ技術は急速な発展と広範な使用17を受けています。プリアンプは、プローブ18と統合することができ、小さいヘッドステージ、マルチプレクサまたは遠隔計測システムは、さらに限界に生理的な録音の限界をプッシュし、商業的に製造されています。
シリコンプローブを用いた最近の理論的および実験的研究では、17,19適切に洗練された大規模な録音方法では、新しい数学的洞察力とモデリングの研究と組み合わせることで、1は、脳のボリュームから、代表的に大部分あるいはすべてのニューロンから記録することができるようになることを示している複数のシャンクのシリコンプローブ（; 5月17日 〜1μmの3の細胞の数千）で調査した。しかし、これらの測定値の相関的性質を考えると、神経活動パターンの間の因果関係は必然的に曖昧なままになります。の十分な理解コーディネートアンサンブルの活動は、そのニューロンのコンポーネントから出てくるか少なくとも2つの追加手順を実行する必要があります。文字通りオーケストラのメンバーのように - 最初のものは、一意のアセンブリの動作に貢献してそれぞれが複数の神経細胞の種類の識別です。 、秒、および補完的なステップは、エンジニアは20の電子回路を問い合わせる方法で同定された細胞または細胞群のスパイク活動の原則操作です。最近開発された分子optogeneticツールは、ローカル光刺激20から22により、特定の細胞集団を操作するために使用することができます。シリコンプローブ23と組み合わせて大規模なレコーディング、効率的かつ光学的方法は、識別し、選択して、したがって、脳のネットワークの因果関係に対処することができ、特定の細胞集団を駆動の両方の手段を提供します。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
マリー·キュリー国際フェローシップ送信（欧州連合（EU）のFP/2007-2013グラント契約＃221834と254780）、JDマクダネル財団、NSFグラントSBE 0542013、健康グラントNS034994の国立研究所、精神保健グラントMH5467、ハワードヒューズ医学研究所の国立研究所（Janeliaファームリサーチキャンパス助成金）。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon probe Buzsaki32, 4 shanks x 8 sites. Packaging: flexible polyamide cable | Material | NeuroNexus Technologies | Probe: buzsaki32 Packaging: HC32 | Recording probe |
| Round Brass Screw, 00-90 x 1/2 Round Brass Screws | Material | JIMorris | R0090B500 | Drive part |
| Brass Hex Nut, 00-90 | Material | JIMorris | N0090B | Drive part |
| Brass C260 Strip, ASTM-B36 Thickness: 0.025", Length: 12", Width: 1/2" | Material | Small Parts, Inc. | B000FMYU72 | Drive part |
| Connector Header, pitch 2mm, male, single row, straigt, 36 positions | Material | Digi-Key | 2163S-36-ND | Drive part |
| 2-part Sylgard silicon Elastomer | Material | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | To extra-insulate the probe |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Reagent | Fisher Scientific | 04-355 Decon Laboratories No.:1002 | To clean the recording sites |
| Impedance Conditioning Module | Equipment | FHC, Inc. | 55-70-0 | Impedance meter |
| niPOD - 32 channels | Equipment | NeuroNexus Technologies | niPOD -32 | Impedance meter |
| Grip Cement Industrial Grade | Material | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | Grip cement |
| 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) | Reagent | Invitrogen | D282 | To stain the probe track in the brain |
| Stainless Steel Machine Screw, Binding Head, Slotted Drive, #00-90, 1/8" | Material | Small Parts, Inc. | MX-0090-02B | Ground and reference screws |
| Magnet wire, 20G, nylon-polyurethane coating, MW80 | Material | Small Parts, Inc. | B000IJYRP2 | Ground and reference wire |
| Stainless Steel Machine Screw, Binding Head Slotted Drive, #000-120, 1/16" | Material | Small Parts, Inc. | MX-000120-01B | Anchor screws |
| N-3 All purpose Flux Liquid | Reagent | La-Co (Markal) | 23512 | Allows to solder stainless-steel |
| MicroGrid Precision Expanded Copper | Material | Dexmet | 3 CU6-050 FA | Copper mesh for on-head Faraday cage |
| C&B-METABOND Quick! Cement System - Dentin Activator | Material | Parkell | S380 | |
| C&B-METABOND Quick! Cement System - Dental cement | Material | Parkell | S380 | |
| Sharp point tungsten needle and holder | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6064 and RS-6061 | To make the hook to lift the dura |
| Carbide Bur HP 1/4 | Tool | Henry Schein | 9990013 | |
| Paraffin (Granules) | Material | Fisher Scientific | P31-500 | |
| Mineral Oil, Light (NF/FCC) | Material | Fisher Scientific | O121-1 | |
| GC ELECTRONICS 10-114 2-Part Epoxy Adhesive | Material | Newark Inc | 00Z416 | |
| Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red Single Polyurethane-Nylon (MW80-C) TO 0.041"+/-0.002" OD | Material | New England Biolabs | N28-36E-400-2 | To make the cable between the headstage and the amplifier |
| 32-channel Very Large Scale Integration headstage, 20x gain | Equipment | Plexon | HST/32V-G20 | Headstage |
References
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