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Neuroscience

移动硅探针的神经行为鼠害的大型记录

doi: 10.3791/3568 Published: March 4, 2012

Summary

我们描述了多个单单位的大型录音和行为与硅探针的啮齿动物的局部场电位的方法。驱动器制造,探针附着到驱动器和探针植入过程容易复制足够的细节说明。

Abstract

在神经科学中的一个主要挑战是连接到神经集会集体活动的行为。神经元和电路的输入输出关系的理解与空间的选择性和时空分辨率,适用于机械分析神经合奏动物的行为,即孤立的单个神经元代表性的大样本的录音需要的方法。乐团的神经元活动的监测显着进展在过去十年中,小型和大型脑的动物,包括人类受试者1-11。多个录制现场与以硅为基础的设备,特别是有效的,因为他们的可扩展性,体积小和几何设计。

在这里,我们描述了多个单个神经元和在啮齿动物的行为,使用市售的微加工硅探针定制的配套部件的局部场电位记录方法。有两架F基本选项或接口前置放大器的硅探针:印刷电路板和柔性电缆。探头供电公司( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ),通常会提供粘接服务和提供保税印刷电路板的探头或软电缆。在这里,我们描述了一个4柄,32现场灵活的聚酰亚胺电缆连接到探头的植入,装在一个可移动的微型硬盘。探针制备的每一步,Microdrive微型建设和手术说明,使最终用户可以很容易地复制过程。

Protocol

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1。建设的Microdrive

所有驱动器是由相同的基本元素:运动的一部分,它带有电极和一个固定的部分,这是固定的头骨。一个理想的微硬盘允许平稳,但长期在多个小步骤的电极足够的旅行,是足够坚固,以​​防止意外移动电极,容易操作,而不会干扰动物的行为,具有体积小,重量轻的实验者。由于这些竞争要求的结果,不同的驱动器套件不同的应用程序。

只有4个部分,需要建立我们的基本驱动器:黄铜平头螺钉,匹配的螺母,塑料桥,从单排排针和两个自定义切黄铜板的准备。

  1. 打破了头3针片
  2. 轻轻拉出中间的脚。
  3. 放大通过它与钻头尺寸#55钻洞。
  4. 剪下一个TH阅读使用00-90自来水。
  5. 切出两块铜板。
  6. 文件边缘与Dremmel板。
  7. 钻一个孔在中间的两件用钻头尺寸#65。
  8. 使铜板接触的针脚装配传动件。要做到这一点,插入黄铜螺丝,先后,铜板,脚头的螺纹孔,第二个铜板,螺母。轻轻拧紧螺丝,使大会成为稳定。
  9. 焊接引脚结束铜板。
  10. 文件中的螺丝凸出。
  11. 焊接螺母螺丝。要小心,不要焊接铜板螺母。
  12. 测试驱动器的运动:把螺丝顺时针,以提高塑料的桥梁。

2。准备的硅探针

固定探头驱动器之前,添加额外的绝缘探头粘接面积,以防止cerebrospinal脑脊液(CSF)或产生短路,湿度:

  1. 权衡和10:1的比例混合Sylgard弹性元件。
  2. 使用削尖的棉花撒施,适用于高端探头的Sylgard。
  3. 在60°C时为2小时预热烤箱,让它干。

为了确保录音的网站是没有任何碎片,探针需要清洗:

  1. 准备一个Contrad洗涤剂稀释4%。
  2. 让探头洗涤剂浸泡在63°C至少2小时。
  3. 探头反复浸泡在蒸馏水冲洗洗涤剂。

固定探头驱动器之前,每个录制现场的阻抗应检查:

  1. 0.9%的盐水中,浸探头,连接阻抗米。如果有太多的记录点阻抗不正确,请重复步骤2.4-2.6,或考虑使用不同的探头。在这里,我们使用阻抗调理模块,冯检基Haer有限公司(金控)相结合,用自制的通道选择。另外,,由NeuroNexus,公司或NanoZ的公司,由Neuralynx,niPOD允许阻抗所有的探头通道同时监测。

3。贴上探头的Microdrive

  1. 用刀片切成多个沟槽的桥梁,建立一个坚固的表面。
  2. 放在附近探测到驱动桥。这个过程最好是在手术显微镜下,驱动器与钳和调整探头,通过显微操作,使柄与传动螺杆完全平行。这将确保在进步,进入脑组织的探头柄举动没有“切割通过它。在这个阶段,考虑到目标结构的深度,从表面探针驱动器的基础相对确切的深度应确定头骨。
  3. 然后将探头固定桥握水泥。
  4. 可选:在大脑中的可视化探测轨道,DII的解决方案(1-2%的乙醇稀释),可应用在这个阶段,到探头的背面。

4。准备头骨

手术前,参考和接地电极,在头法拉第笼的部分准备:

  1. 削减两个铜线2“长的小段,和焊料各约1毫米的绝缘铜线。
  2. 用针,刮头1 00-90,1/8“不锈钢螺丝和焊接一块​​铜线焊接等不锈钢接地螺钉电极需要一个适当的流量(例如,N-3目的从La有限公司通量)和烙铁头温度高。小心防止任何焊料流入螺杆的凹槽,这将作为接地电极使用。重复另一个螺钉和铜线准备参比电极。
  3. 削减梯形铜网片。这些作品将被组装保护探头。

手术器械和准备许多小动物手术中使用的相同。整个手术做深异氟醚麻醉下,用无菌条件下,根据国立卫生研究院批准的指引。请注意,仅用于演示目的是在这部影片中(模拟)手术。对于适当的知名度和拍摄的目的,几个准备步骤,手术注意事项和术后的程序不显示/可见或讨论。

手术前,所有的部件和用品应消毒,适当程序后(生存鼠类手术的指引; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf)。在手术过程中,准备对头骨的无菌区和隔离无菌单。在结束手术,广谱抗生素是pplied本地和长效止痛药,肌肉注射(例如,丁丙诺啡,Buprenex] 0.05毫克/千克)。此外,止痛药(如布洛芬)提供饮用水,约60 mg/kg/24小时5天。对于适当的手术和麻醉的程序,征询适当的来源12。

  1. 安装在立体定位仪动物,剃须和清洁头皮13。
  2. 削减沿中线的皮肤,拨开头皮。取下骨膜,清洁和干燥的头骨。
  3. 测量前囟门和lambda之间的位置和距离,并确定相应采用立体定向图谱14探针植入网站的x和y坐标。刮用手术刀在十字架上的头骨,标志着网站。
  4. 在上面钻颅骨成骨中途使用一个圆形头钻头(大小的四分之一)和驱动器支持螺钉(不锈钢,000-120,1/16“),对不同的骨板,Nd对头骨的一侧。螺丝将提供安全债券的头饰头骨的锚。
  5. 上述小脑钻洞并插入地面和步骤4.2准备的参考电极。记录局部场电位(LFP),参考网站的选择是至关重要的。选择这个网站是因为小脑LFP的所有皮层区域和肌肉文物中最小的,这正中位置的最小。
  6. 应用牙本质激活(Metabond包),使用小刷子在整个表面的头骨。 0.9%的生理盐水冲洗。
  7. 适用于牙科水泥(Metabond套件;按照制造商的指示进行搅拌)的头骨,仔细覆盖锚螺钉和接地参考电极,但离开探针植入网站的明确。
  8. 获得四铜网皮瓣(步骤4.3准备)的头骨。对于这一点,巩固他们每个人的狭隘基地前,左,右,后头骨两侧。日é铜绝不应与骨直接接触,但总是由水泥层分离。

5。准备在大脑表面

  1. 用圆头钻头,钻植入部位周围的多个阶段,而经常灌溉用生理盐水骨。
  2. 小心地取下骨瓣和灌溉大脑表面。
  3. 插入多柄探头,硬脑膜大带将被删除。这两个工具都需要清除硬脑膜:手术刀和昆虫针(或者,一个标准的钨电极)准备一个钩子。弯曲针尖对推动坚硬的表面(如玻璃显微镜幻灯片),它连接到一个句柄(在这里,一块木制棉条也可选择microdissecting的持针器)。
  4. 提起钩硬脑膜,用手术刀切。采取特殊照顾,以避免损坏软,船只及大脑皮层表面。小出血可以解决生理盐水冲洗。如果出现大出血,或以任何方式损害的皮层,应考虑终止手术,并准备其他动物。

6。植入探头

在这个阶段,皮质表面血管的密度和方向,仔细评估。立体坐标应调整,因为探头有穿透大脑,在面积较大的船只。

植入,驱动装置可与连接立体持有鳄鱼夹举行。不间断的大脑表面的能见度和探头的秘诀是渗透成功的关键。

  1. 慢慢放下探头下降到约1毫米以上的预定目标,同时不断地灌溉用生理盐水开颅手术。皮层记录,探针降低到约0.5毫米的皮层和解除表面附近。 密封用温暖融化的蜡和石蜡油混合物通过一根针(10-20G蜡石蜡油10毫升,在65°C加热)的开颅手术。申请前,混合冷却至30°C,测试密度。它应该是足够的软,便于探头运动)。为了便于全面覆盖,可熔化混合物在原地接近的微cauterizer的尖硬化蜡。
  2. 将驱动器底部的颅骨与握水泥,小心离开螺母自由转动。在这个阶段最重要的是要避免任何意外的“凸点”的驱动,否则会损坏探头皮层。驱动器被固定在头骨后,运动平稳探头应加以核实。
  3. 头骨水泥探头的连接部分。

7。建筑上的头法拉第笼

  1. 拉起来,组装成保护圆筒周围的探头和DRI铜网皮瓣VE。气缸也可作为电盾对环境噪声和收费行为动物晶须产生的慢波文物。
  2. 切掉多余的材料,所以铜网与探头连接的顶部是水平调整圆柱体的高度。
  3. 焊锡的参考和接地螺钉,导线连接器相应引脚。还焊料相邻的铜网皮瓣,以确保其电气连续性,焊接地线铜网。
  4. 应用层上的铜网,以加强它之间的金属和动物的皮肤直接接触,以防止任何抓地力水泥。另外,申请的环氧树脂层,以进一步加强的头饰。
  5. 测试驱动螺杆的运动。
  6. 盖帽顶部用一块从橡胶手套切。

8。在自由移动的动物录制

  1. 后拨款吃了术后护理,录音系统,使用高阻抗探头和一个轻量级的,的ultraflexible多股电缆连接动物。抗衡的头饰的重量。
  2. 测试的每一天记录的homecage的质量。记录点的位置来判断两个单位放电模式和局部场电位的形状。小增量(通常为1/8到1/4,每天之交,即35-70微米)的转动螺丝,直到达到目标结构,逐步降低探头。

9。代表结果

电生理信号(局部场电位和单位活动)取决于记录的结构和当前的动物行为。图1显示了32个通道的海马CA1区记录的例子,而老鼠是一个开放的领域探索。注意局部场电位的突出8赫兹(THETA带)在勘探与燮振荡erimposed多个柄和网站(箭头表示尖峰)扣球。分析神经元单位活动,尖峰检测和整理成单一单位使用集群分析其波形15-16。

图1
图1。行为用4柄×8网站硅探头的大鼠海马CA1区记录。录音是宽带和采样20 000赫兹,这使得研究领域的潜力本地振荡(如“THETA”乐队的节奏8赫兹)和神经扣球活动。

表1
表1。使用的试剂和设备的替代品。

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Discussion

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这部影片展示了植入硅探针行为大鼠慢性大型录音程序。来自生物(脑组织)和技术(硅棒)材料的​​脆弱性的关键步骤,以确保神经元活动的质量记录。应采取特别的照顾,同时处理的探头,以避免任何接触与任何远程的“硬”的表面(例如,柄将打破,如果试图在大脑中植入他们不删除硬脑膜)柄。同样,任何脑组织的损伤(同时准备植入大脑表面,或碰撞,一旦它被植入到探针或驱动器),会导致细胞破坏和危害的单位活动的记录。此外,电气接地路径应进行检查,如脑脊液,接地螺钉,铜线,铜网皮瓣和接地引脚之间上connecto任何电路中断R,会导致在一个大型的运动文物和/或线路噪声(50 Hz或60 Hz)。如果法拉第笼不够高,突出的微型驱动器可作为天线。天线的作用,可以防止接地的驱动器,以及(锡铜线之间的另一个驱动器和铜网)。参考信号路径应同样的检查。

我们说明了一个单一的硅探针植入,但可以很容易地完成一些练习后多个站点使用多个探针和驱动器的录音。此外,我们使用的是在老鼠大脑中植入硅探头相似,但规模较小的驱动器。市售的硅探针和探针柔性电缆连接器组件,随着多声道前​​置放大器体积小,大大简化了以往的技术相比,制备工艺。今天,它是那样容易,同时在行为灭鼠记录从64到128网站,从2个电极丝就在十年前。

硅探针技术正在迅速发展和广泛使用的17。前置放大器可以与探测器18,集成和规模较小的探头,多路复用器或遥测系统正在商业化生产,推动生理记录的限制,以进一步限制。

最近的理论和实验研究硅探针17,19表明,与正常成品的大型记录方法,结合新的数学洞察力和建模研究,一会是能够记录从1代表性的很大一部分,或者每一个神经元,大脑体积调查多重柄硅探针(成千上万的细胞在1微米3; 5-17)。然而,由于这些测量的相关性的性质,神经活动模式之间的因果关系仍难免含糊。透彻的了解如何协调合奏活动从它的神经元组件出现至少需要两个额外的步骤。第一个是多个神经细胞类型,其中每一个独特的贡献组装行为的识别 - 就像一个乐队的成员。第二,互补性的一步,是一个确定的细胞或细胞群体的扣球活动的原则操作,在方式的工程师询问电子电路20。最近开发的分子optogenetic工具可以用来操纵特定的细胞群,由当地光刺激20-22。硅探针23的高效结合大规模的录音和光学方法识别和选择性驾驶特定的细胞群,从而使大脑网络的因果关系提供了手段。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

居里夫人国际传出奖学金(欧盟的FP/2007-2013的赠款协定,#221834和254780),JD麦克唐纳基金会NSF资助SBE 0542013,国家格兰特NS034994卫生研究院,国家格兰特MH5467心理健康研究所和霍华德休斯医学研究所(Janelia农场研究校园补助金)。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Silicon probe Buzsaki32, 4 shanks x 8 sites. Packaging: flexible polyamide cable Material NeuroNexus Technologies Probe: buzsaki32 Packaging: HC32 Recording probe
Round Brass Screw, 00-90 x 1/2 Round Brass Screws Material JIMorris R0090B500 Drive part
Brass Hex Nut, 00-90 Material JIMorris N0090B Drive part
Brass C260 Strip, ASTM-B36 Thickness: 0.025", Length: 12", Width: 1/2" Material Small Parts, Inc. B000FMYU72 Drive part
Connector Header, pitch 2mm, male, single row, straigt, 36 positions Material Digi-Key 2163S-36-ND Drive part
2-part Sylgard silicon Elastomer Material World Precision Instruments, Inc. SYLG184 To extra-insulate the probe
Decon Contrad 70 Liquid Detergent Reagent Fisher Scientific 04-355 Decon Laboratories No.:1002 To clean the recording sites
Impedance Conditioning Module Equipment FHC, Inc. 55-70-0 Impedance meter
niPOD - 32 channels Equipment NeuroNexus Technologies niPOD -32 Impedance meter
Grip Cement Industrial Grade Material Caulk Dentsply 675571 (powder) 675572 (solvent) Grip cement
1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) Reagent Invitrogen D282 To stain the probe track in the brain
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head, Slotted Drive, #00-90, 1/8" Material Small Parts, Inc. MX-0090-02B Ground and reference screws
Magnet wire, 20G, nylon-polyurethane coating, MW80 Material Small Parts, Inc. B000IJYRP2 Ground and reference wire
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head Slotted Drive, #000-120, 1/16" Material Small Parts, Inc. MX-000120-01B Anchor screws
N-3 All purpose Flux Liquid Reagent La-Co (Markal) 23512 Allows to solder stainless-steel
MicroGrid Precision Expanded Copper Material Dexmet 3 CU6-050 FA Copper mesh for on-head Faraday cage
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dentin Activator Material Parkell S380
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dental cement Material Parkell S380
Sharp point tungsten needle and holder Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-6064 and RS-6061 To make the hook to lift the dura
Carbide Bur HP 1/4 Tool Henry Schein 9990013
Paraffin (Granules) Material Fisher Scientific P31-500
Mineral Oil, Light (NF/FCC) Material Fisher Scientific O121-1
GC ELECTRONICS 10-114 2-Part Epoxy Adhesive Material Newark Inc 00Z416
Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red Single Polyurethane-Nylon (MW80-C) TO 0.041"+/-0.002" OD Material New England Biolabs N28-36E-400-2 To make the cable between the headstage and the amplifier
32-channel Very Large Scale Integration headstage, 20x gain Equipment Plexon HST/32V-G20 Headstage

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References

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Vandecasteele, M., M., S., Royer, S., Belluscio, M., Berényi, A., Diba, K., Fujisawa, S., Grosmark, A., Mao, D., Mizuseki, K., Patel, J., Stark, E., Sullivan, D., Watson, B., Buzsáki, G. Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents. J. Vis. Exp. (61), e3568, doi:10.3791/3568 (2012).More

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