Summary
En 3D-system for dyrking menneskelig artikulære chondrocytes i høye nivåer av synovial væske er beskrevet. Leddvæsken reflekterer den mest naturlige mikromiljøet for leddbrusk, og kan lett innhentes og lagres. Dette systemet kan dermed brukes til å studere brusk regenerering og for screening legemiddelselskap for behandling av leddgikt.
Abstract
Brusk ødeleggelse er et sentralt patologisk trekk ved slitasjegikt, en ledende årsak til uførhet i USA. Brusk i den voksne ikke regenerere ikke veldig effektivt in vivo, og som et resultat fører slitasjegikt til irreversible brusk tap og er ledsaget av kroniske smerter og immobilitet 1,2. Brusk tissue engineering tilbyr lovende potensial til å fornye og gjenopprette vev funksjon. Denne teknologien innebærer vanligvis seeding chondrocytes i naturlige eller syntetiske stillaser og dyrking den resulterende 3D konstruere en balansert medium over en tidsperiode med et mål av engineering en biokjemisk og biomekanisk modne vev som kan transplanteres inn i en defekt område in vivo 3-6 . Oppnå en optimal forutsetning for chondrocyttransplantasjon vekst og matrise deponering er avgjørende for å lykkes med brusk tissue engineering.
I de innfødte felles cavity, brusk på arktiskeular overflaten av benet er badet i synovialvæsken. Dette klar og tyktflytende væske gir næringsstoffer til avascular leddbrusk og inneholder vekstfaktorer, cytokiner og enzymer som er viktige for chondrocyttransplantasjon metabolisme 7,8. Videre letter synovialvæsken lav friksjon bevegelse mellom cartilaginous flater hovedsakelig gjennom sekresjon to viktige komponenter, hyaluronan og lubricin 9 10. I kontrast er vevet utviklet brusk oftest dyrket i kunstige medier. Mens disse mediene er trolig i stand til å gi mer definerte vilkår for å studere chondrocyttransplantasjon stoffskifte, synovialvæsken mest presist reflekterer naturen som artikulære chondrocytes bor i.
Har faktisk leddvæsken fordelen av å være lett å få tak og lagre, og kan ofte fornyes jevnlig av kroppen. Flere grupper har supplert den kulturen medium med synovialvæsken i voksende menneske, storfe, kanin og hund chondrocytes, men for det meste brukes kun lave nivåer av leddvæske (under 20%) 11-25. Mens kylling, hest og menneske chondrocytes har vært dyrket i medium med høyere prosentandel av synovialvæsken, ble disse kultur systemene todimensjonal 26-28. Her presenterer vi vår metode for dyrking menneskelig artikulære chondrocytes i et 3D-system med en høy andel av leddvæske (opp til 100%) over en periode på 21 dager. Ved å gjøre det, overvant vi et stort hinder presentert av den høye viskositeten på synovialvæsken. Dette systemet gir mulighet for å studere menneskelig chondrocytes i synovialvæsken i et 3D miljø, som kan videre kombineres med to andre viktige faktorer (oksygen spenninger og mekanisk belastning) 29,30 som utgjør det naturlige miljø for brusk å etterligne de naturlige miljø for brusk vekst. Videre kan dette systemet også brukes for å analysere synovialvæsken aktivitet på chondrocytes og gi en plattform for utviklingbrusk regenerering teknologier og behandlingsalternativer for leddgikt.
Protocol
En 3D-system for dyrking human artikulære chondrocytes i synovialvæsken
I dette arbeidet, innkapslet vi menneskelige artikulære chondrocytes i alginat perler ved hjelp av en modifisert produksjon-foreslo innkapsling protokoll (Lonza, og 31). Ved hjelp av disse 3D-konstruksjoner, har vi utviklet et system for dyrking celler i en kultur medium som inneholder varierte prosenter av menneskelig synovialvæsken og har vurdert disse 3D konstruksjoner for brusk genuttrykk.
1. Forbered human artikulære chondrocytes (HAC) for tredimensjonal (3D) innkapsling
- Tine et hetteglass (1 ml) av menneskelig artikulære chondrocytes (HAC) (Lonza) (Passage 2) i 37 ° C vannbad i 1 min.
- Bland med 1 ml chondrocyttransplantasjon vekstmedier (Lonza) og sentrifuger ved 3000 rpm i 3-5 min å samle cellene. Kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i chondrocyttransplantasjon vekstmedier (Lonza).
- Plate celler i en 10 cm vevkultur plate (BD biovitenskap), og kultur i chondrocyttransplantasjon vekstmedier (Lonza) til cellene er confluent. HACs bør brukes på en passasje tall ikke høyere enn 3 eller 4 (P3 eller P4).
- Vask HACs på tallerkenen med 155mm NaCl i stedet for standard PBS, etterfulgt av trypsinzation å samle celler for alginat perle innkapsling. Når cellene er frittliggende, spinn ned cellene ved 3000rpm for 5min. Cellene er nå klar for 3D innkapsling.
2. Kapsle HACs inn 3D-perler
Resuspender HACs i 1,2% alginat løsning (Sigma) ved en tetthet på 8x10 5 celler / ml. Cell tallene ble bestemt før innkapsling, ved hjelp av en standard celle teller. Det er veldig viktig å blande godt for å sikre jevn fordeling av cellene i perlene.
- Pipetter den HAC / Alginat løsning blandingen i en 12 ml sprøyte festet til en 22-gauge kanyle (Tyco Healthcare, Inc.).
- I mellomtiden forbereder en 50 mL begerglass med 102 mM CaCl 2 ved et volum 5 ganger at av HAC / aginate løsning. Plasser en røre bar inne i begerglasset og rør de 102 mM CaCl 2-løsning sakte (ca 150 rpm).
- Hold sprøyten tips om 6 inches over overflaten av CaCl 2 løsning og tilsett HAC / alginat blandingen i CaCl 2 løsningen dropwise. Generelt, den resulterende alginat perler er 2mm i diameter med en innkapsling tetthet på ca 10 4 celler / perle. Merk: Høyden på sprøyten over CaCl 2 løsningen er viktig. Kortere avstand vil resultere i rive-dråpeformede stedet for sfærisk formet perler, forårsaker ujevn mekanisk integritet og celle innkapsling.
- La perler røre i CaCl 2 løsningen for 20-25 min. Mens andre alginat innkapsling protokoller indikerer en mye kortere inkubasjonstid på 10min, fant vi at lengre inkubasjonstid med CaCl 2 løsningen forbedret integritet skalannonser.
- Fjern CaCl 2 løsning, vaske perlene 2-3 ganger på 2-3 volumer av NaCl, og deretter en gang i chondrocyttransplantasjon differensiering medium (Lonza). Mens andre alginat perle innkapsling protokoller innebære å bruke et filter for de ovennevnte vaskeprosedyrer, fant vi at alginat perler ofte blir fanget i filteret og tørke ut, og dermed redusere effektiviteten av innkapsling. Vi fant det mest effektivt å la perlene å bosette seg i bunnen av begeret før du kasserer løsningen.
- Bruk en standard stekespade til å overføre perlene inn i kulturen retter. Vi vanligvis kultur 12 perler per 3 cm godt for 2 dager i chondrocyttransplantasjon vekst medium å tillate chondrocytes å justere til innkapsling prosessen i medium de ble dyrket i før den settes i chondrocyttransplantasjon differensiering medium (Lonza) med leddvæske.
3. Kultur chondrocytes i synovialvæsken kultur medium
- Fresh synovialvæsken kan fås fra en outpatient klinikk (Vi innhentet synovialvæsken fra Tufts Medical Center). Synovialvæsken kan overføres i 15ml falk rør til laboratoriet, og umiddelbart sentrifugeres ved 3000 rpm for 15min for å fjerne celle avfall. Delmengde cell-free synovialvæsken inn 1,5 mL Mikrosentrifugerør, for å unngå gjentatte fryse-tining. Supernatant kan oppbevares ved -80 ° C til bruk.
- Før dyrking, bland synovialvæsken med chondrocyttransplantasjon differensiering medium (CDM, Lonza) ved varierende volumetrisk forholdstall, med en konstant konsentrasjon av 100mm askorbinsyre og 9 mM CaCl 2 (denne spore mengden av CaCl 2 er å sikre integriteten av alginat perler).
- Hold platen på en rocking plattform i en 37 ° C inkubator (rocking frekvens: ca 75 ganger / min) for å hjelpe næringsstoffer distribusjon innen alginat perler, og for å redusere klumping av perlene. Dette er spesielt viktig ettersom vi kulturen disse chondrocytes for en lengre periode (opptil 4 uker). Merk: Mens chondrocyttransplantasjon vekst og differensiering media (Lonza) inneholder to vanlige antibiotika Gentamycin og amfotericin, har vi ikke et supplement til noen antibiotika når vi brukt ulike prosentandel av leddvæske for chondrocyttransplantasjon dyrking. Ingen forurensing ble noensinne observert.
- Endre media blandinger hver 2-3 dag. Viskositeten synovialvæsken har vært et stort hinder i dyrking chondrocytes innkapslet i alginat perler under langsiktig kulturer. Vi fant det mest effektivt å fortynne synovialvæsken-supplert medium med 102mm CaCl 2 (50% V / V), som også styrker integriteten til alginat perler. På denne måten kan mediet sakte fjernes med en pipette, uten å skade perler.
Fire. Høste HACs i alginat perler for genekspresjonsanalyse
Spesielle hensyn må tas når høste HACs fra alginat perler for genekspresjonsanalyse.
- Vask alginat perler 3 TImes i 102 mM CaCl 2 for ca 5 min hver gang.
- Hent chondrocytes ved å legge 55 mm NaCitrate på et volum 4-5 ganger at av perler. Det er viktig at alginat perler er totalt oppslukt i NaCitrate løsningen. Rist eller rock i 20-30 min.
- Spin ned cellene og kast supernatanten.
- For RT-PCR-analyse, cellepelleten suspenderes i celle lysis buffer (Qiagen RNA isolering kit), og fortsett med RNA rensing.
5. Fix HACs i alginat perler for histologisk analyse
Spesiell forsiktighet må tas for å høste HACs fra 3D perler for histologisk analyse.
- Vask alginat perler 3 ganger i 102 mM CaCl 2 for ca 5 min hver gang. For fullstendig vaske bort tyktflytende synovialvæsken, fant vi det mest effektivt å vaske med chondrocyttransplantasjon differensiering medium (Lonza) over natten, rocking i en 37 ° C inkubator (rocking frekvens: ca 75 tidens / min). Den chondrocyttransplantasjon vekstmedium ble brukt til å sikre chondrocyttransplantasjon overlevelse i dette langvarig vaske og å tillate maksimal penetrasjon av fastsettelse agent.
- Fest perlene i 70% etanol over natten, og fortsett med histologiske analyse. For å utføre Dapi flekker, inkuber alginat perler med Dapi løsning (500ng/ml) for 1 time under lett rocking, og vask for 3 ganger med 102mm CaCl 2 for 15 min hver gang. Dapi bilder kan da sees under et fluorescerende mikroskop. Perlene kan også bli seksjonert for Alcian blå og H & E farging.
Seks. Representant Resultater
Våre 3D dyrking metode for menneskelig chondrocytes i høye prosenter av synovial væske er avbildet i skjematisk diagram vist i Fig.1. Etter human chondrocytes var innkapslet i alginat perler, fikk de lov til å vokse i medium supplert med varierende forholdstall av leddvæske. På grunn av viskositeten på synovial væske, er det viktig åkultur chondrocytes under konstant rocking forhold for å hindre klumping av brusk konstruerer og for å sikre jevn fordeling av næringsstoffer. Det er også viktig å vaske alginat perler utstrakt før henting av chondrocytes, slik at feste eller lysis buffer kan trenge perlene (Fig.1). Bright feltet (BF) bilder av chondrocytes i alginat perler er vist i Fig.2. Dapi farging ble utført for å bekrefte usniform distribusjon av celler i perler (Fig. 2). På slutten av 21-dagers kultur perioden var genekspresjonsanalyse utført av QRT-PCR. Referansen genet GAPDH ble brukt for normalisering for alle PCRs, som det var bestemt på å være en av de mest pålitelig referanse gener for qPCR analyse på chondrocytes 32. Et eksempel er vist i fig. 3, der vi analyserte resultatene fra menneskelig artikulære chondrocytes dyrket i synovialvæsken samlet fra seks pasienter med slitasjegikt. I samsvar med det faktum at chondrocytes fraLonza har blitt utvidet i 2D kulturer, noe som vil uunngåelig føre til de-differensiering 33, fant vi at Dag 0 chondrocytes uttrykt minimale nivåer av brusk matrise gener (fig 3). 3D dyrking av chondrocytes med chondrocyttransplantasjon differensiering medium (Lonza) eller medium supplert med leddvæsken betydelig økt brusk genekspresjon av kollagen, aggrecan og MMP13, noe som indikerer chondrocyttransplantasjon re-differensiering av Dag 21 (Fig.3) 34. Øke andelen av synovial væske i media resulterte i sammenlignbare nivåer av brusk matrix markører kollagen II og aggrecan mRNA uttrykket (Fig.3A og 3B). Videre chondrocytes dyrket i 100% synovialvæsken selv viste en reduksjon i brusk nedverdigende enzym MMP13 mRNA uttrykk sammenlignet med de som dyrkes i medium alene (Fig.3C). Interessant, uttrykket nivået av celledød indikator caspase 3 gradvis avtok med økende forholdstall av synovialvæsken, noe som tyder på at Synovial væske dyrking har ført til redusert apoptose nivåer (Fig. 3D). Derfor er våre resultater viser at dyrking menneskelig artikulære chondrocytes i høye nivåer av synovial væske i en 3D-innstillingen er en mulig teknologi.
Tabeller og tall
Figur 1. Skjematisk diagram av metoden til kultur menneskelig artikulære chondrocytes i høye prosenter av synovial væske i 3D alginat perler. Først er chondrocytes og alginat løsning blandet. Da gjaldt drop-klok til CaCl 2-løsning, er chondrocytes immobilisert innen krysskoblet Ca-alginat hydrogel perler. Disse 3D konstruerer blir deretter dyrket i chondrocyttransplantasjon differensiering medium (Lonza) med varierende forholdstall av menneskelig leddvæske. Etter 21 dager med dyrking under en rocking tilstand, alginat perler inneholder cellene vasket grundig etter som cellene er hentet for genetuttrykk analyse.
Figur 2. Bright feltet (BF) og Dapi bilder av menneskelig artikulære chondrocytes innkapslet kulturer med 0%, 30%, 50%, 70% og 100% leddvæske. Chondrocytes var sfærisk i formen i all kultur forhold. Bilder av lyse feltet (BF) og Dapi var kledde for å bekrefte plasseringen og distribusjon av chondrocytes. Innfellinger, forstørret bilder. Pilspisser, colocalization av chondrocytes i BF og Dapi flekker bilder.
Figur 3. QRT-PCR analyse av innkapslet human artikulære chondrocytes på dag 0 (D0) en etter 21 dager med dyrking (D21) i medium supplert med varierende forholdstall av leddvæske (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % og 100%). Resultater av fire uavhengige utvalg er vist her. GAPDH ble brukt som intern referanse for alle PCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten har vi utviklet en metode som gjør det mulig for kulturen av menneskelig artikulære chondrocytes i et 3D miljø i medium som inneholder høye konsentrasjoner av menneskelig leddvæske. Synovialvæsken er en av de viktigste komponentene som utgjør det naturlige miljøet i det felles hulrom, hvor artikulær chondrocytes bor. Imidlertid har viskositet synovialvæsken vært en stor utfordring for tredimensjonale langsiktig dyrking av chondrocytes. For å overvinne utfordringen med å opprettholde selv næringsstoff distribusjon i en 3D-konstruksjon i en tyktflytende miljø og for å hindre aggregering, plasserte vi brusk konstruksjoner under konstant bevegelse med forsiktig rocking. For å forbedre den strukturelle integriteten av brusk konstruerer, endret vi den tradisjonelle prosedyren for seeding chondrocytes inn en alginat hydrogel inkludert optimalisering av lengden av tid for perle dannelse og media skiftende prosedyre 31. Slike prosedyrer er avgjørende nårbrusk konstruerer håndteres i viskøs synovialvæsken under langsiktig kulturer.
Vi tror denne metoden vil gi oss mulighet å studere biologi av menneskelig artikulære chondrocytes i deres naturlige milleu, synovialvæsken. Et potensielt problem er at reagenset diffusjon ikke kan være ideelt for chondrocytes innkapslet i alginat perler og vokst i en tyktflytende miljø. Dermed for å studere effekten av visse reagenser på konstruert brusk, kan bedre spredning oppnås ved å redusere størrelsen på alginat perler, og ved å bruke perfusjon systemer for å lette reagens distribusjon i synovialvæsken. Mens vår representant Resultatet ble innhentet fra dyrking normal menneskelig chondrocytes i synovialvæsken avledet fra pasienter med slitasjegikt, tror vi at denne metoden kan ekstrapoleres til å bruke synovialvæsken fra en ellers frisk person eller en annen sunn virveldyr. Fordi synovialvæsken aktivitet kan være korrelert til kombinatorisk aktiviteterbånd av mange biokjemiske faktorer tilstede i væsken, kan nettoeffekten av synovialvæsken på chondrocyttransplantasjon genuttrykk i systemet vårt være korrelert med alvorlighetsgraden av sykdommen og til slutt vil hjelpe oss å forstå intraarticular miljøet før og etter behandlinger. Videre kan vår metode også føre til muligheten for å bruke pasientens egne synovialvæsken for dyrking autolog chondrocytes å regenerere leddbrusk som er individuelt tilpasset. For dette formål, kan dette systemet gi innsikt i å studere biomekaniske krefter gjennom leddvæsken på konstruert brusk samt 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura og Dana Cairns (Tufts University) for å gi hjelp til synovialvæsken lagring og sentrifugering. Dette arbeidet ble finansiert av NIH (1R01AR059106-01A1) for LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. 121, 107-118 (1976).
