Summary
Vi presentiamo un elevato throughput saggio citometria a flusso per determinare l'attività fagocitaria dei antigene-anticorpi specifici da campioni clinici, utilizzando l'antigene fluorescenti rivestite perline e una linea cellulare monocitica esprimono più recettori Fc, fornendo utilizzo del recettore e determinazioni attività fagocitaria in una forma standardizzata e moda riproducibile per qualsiasi antigene di interesse.
Abstract
Anticorpo-driven fagocitosi è indotta attraverso il coinvolgimento dei recettori Fc sulle fagociti professionali, e può contribuire sia spazio così come patologia della malattia. Mentre la proprietà dei domini variabile di anticorpi sono state a lungo considerate critiche per funzione in vivo, la capacità degli anticorpi di reclutare innata cellule immunitarie attraverso i loro domini Fc è diventato sempre più apprezzato come un fattore importante nella loro efficacia, sia nel contesto di ricombinanti La terapia di anticorpi monoclonali, come pure nel corso di infezione naturale o la vaccinazione 1-3.
È importante sottolineare che, nonostante la sua nomenclatura, un dominio costante, il dominio anticorpale Fc non ha funzione costante, ed è fortemente modulata dalla sottoclasse di IgG (IgG1-4) e glicosilazione di asparagina 297 4-6. Quindi, questo metodo per studiare le differenze funzionali di antigene-anticorpi specifici in campioni clinici faciliterà la correlazione del piatto fagocitariaziale di anticorpi stato di malattia, suscettibilità alle infezioni, la progressione, o risultato clinico.
Inoltre, questa funzione effettrice è particolarmente importante alla luce della documentata capacità degli anticorpi di migliorare l'infezione tramite l'accesso agenti patogeni nelle cellule ospiti attraverso recettore Fc-driven fagocitosi 7. Inoltre, vi sono alcune evidenze che l'assorbimento fagocitaria dei complessi immuni possono influenzare la polarizzazione Th1/Th2 della risposta immunitaria 8.
Qui, descriviamo un test progettati per rilevare le differenze di anticorpi indotta fagocitosi, che può essere causato da differenziale sottoclasse IgG, struttura glycan a Asn297, così come la capacità di formare complessi immuni di antigene-specifici anticorpi in un high-throughput di moda . A tal fine, 1 micron perline fluorescenti sono rivestiti con l'antigene, poi incubati con campioni di anticorpi clinici, generando fluorescenti complessi antigene immunitaria specifica. Queste Antibody-opsonizzati perline vengono poi incubate con una linea cellulare monocitica esprimere FcγRs multipli, inclusi sia inibitorio e l'attivazione. Uscita test possono includere attività fagocitaria, la secrezione di citochine, e modelli di utilizzo FcγRs, e sono determinati in modo standardizzato, rendendo questo un sistema molto utile per le differenze di analisi in questo anticorpo-dipendente funzione effettrice in entrambe le infezioni e vaccini-mediata protezione 9.
Protocol
1. Cellule cultura fagocitiche
- Cultura cellule THP-1 10 in RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino come una sospensione stazionario in fiasche T. Densità cellulare deve essere mantenuta al di sotto 0.5x10 6 / ml al fine di mantenere livelli coerenti di espressione FcγR e performance test.
2. Preparare Antigen biotinilato
- Calcolare la quantità di solfo-NHS reagente kit LC biotina necessario biotinylate l'antigene bersaglio di interesse secondo le istruzioni del produttore.
- Sciogliere il reagente biotinilazione in acqua e aggiungere immediatamente l'importo calcolato per l'antigene in un buffer che non contiene ammine primarie. Lasciare che la reazione di procedere per 1 ora a temperatura ambiente, mescolando di tanto in tanto.
- Rimuovere i residui, biotina coniugata con uno scambio di buffer in un reparto di centrifuga concentrazione Amicon di un taglio appropriato peso molecolare per mantenere la Targeantigene t. Aggiungere campione alla camera superiore dell'unità concentrazione e aggiungere PBS per portare il volume totale di 15 ml linea di riempimento. Centrifugare a 4000 xg per portare il volume fino a circa 1,5 ml. Ripetendo questo processo due volte elimina il 99% della biotina gratuiti che assicurano la massima rivestimento di antigene di perline.
3. Preparare Perline Antigen saturi
- Lavare 100 l di 1 millimetro neutravidin perline fluorescenti due volte in 1 ml 0,1% PBS-BSA dopo riducendo la velocità in una microcentrifuga ad alta velocità. Risospendere lavato perle in 100 l di PBS-BSA, e aliquote in 10 tubi.
- Per determinare il rivestimento in condizioni antigene che saturano le perline, unire 10 ul della sospensione lavato tallone con diverse concentrazioni di antigene biotinilato in duplice passi. Incubare per una notte a 4 ° C in una provetta su un rotatore.
NOTA: saturazione di perline devono essere determinati sperimentalmente. Questo può essere realizzatoidentificando bead-coating condizioni che producono la fagocitosi massima quando perline vengono successivamente opsonizzati con un anticorpo monoclonale di controllo.
- Rimuovere l'antigene non legato da un lavaggio con 1 ml di PBS-BSA e centrifuga ad alta velocità fino perle sono pellet. Rimuovere PBS-BSA e ripetere.
- Risospendere antigene perle rivestite in un volume finale di 1 ml in PBS-BSA. Perle possono essere conservati per un massimo di una settimana a 4 ° C prima dell'uso.
4. Preparare i campioni anticorpo
- Campioni di anticorpi clinici può essere purificato dal plasma utilizzando un gel kit Melone IgG purificazione secondo le istruzioni del produttore. IgG purificate possono essere conservati a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo.
NOTA: le opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione di campioni umani devono sempre stata presa.
- Determinare la concentrazione di anticorpi purificati mediante assorbimento a A280, e diluire i campioni di 1 mg / ml in PBS.
- Preparare postulareive e negativo anticorpi monoclonali di controllo per diluizione di 1 mg / ml in PBS.
5. Placcatura l'esperimento
- Risospendere il lavato, soluzione satura di antigene tallone preparato in precedenza con il vortex, e trasferire 10 microlitri in ogni pozzetto di un fondo rotondo 96 pozzetti. Bisogna fare attenzione ad agitare continuamente la sospensione tallone per assicurare un numero uguale di perline fluorescenti sono aggiunti a ciascun pozzetto.
- Aggiungi concentrazioni variabili degli anticorpi di interesse in ogni pozzetto, creando una curva dose-risposta per ogni anticorpo. Concentrazioni ottimali variano tra i campioni a seconda del titolo di anticorpi presenti, ma una gamma di 0,01-100 mcg / ml concentrazione finale fornirà una buona copertura e permettere di identificare l'intervallo di concentrazione di interesse. Assicurarsi che gli anticorpi sono aggiunti in quantità non superiori a 20 l.
- Perle di incubare e campioni di anticorpi per 2 ore a 37 ° C per consentire al anticorpi opsonize le perline. </ Li>
- Preparare una sospensione di cellule THP-1 a 2,5 x 10 5 cellule / ml e aggiungere 200 ml di questa sospensione in ogni pozzetto, per un totale di 5 x 10 4 cellule THP-1 in ciascun pozzetto.
- Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2, in un incubatore stazionario, le cellule permettendo e perline di pellet per gravità.
NOTA: segnale al rumore può essere migliorata attraverso la determinazione del tallone ottimale: anticorpo: THP-1 rapporti di cella per una determinata sorgente antigeni e anticorpi.
6. Analisi in citometria a flusso
- Togliere 100 l di surnatante da ogni pozzetto facendo attenzione a non disturbare il pellet. Surnatante può essere salvato se determinazioni secrezione di citochine o altre analisi sono volute.
- Per il fissaggio, aggiungere 100 ml di paraformaldeide 4% in ogni pozzetto e pipetta per risospendere e mescolare cellule.
- Analisi dei flussi ad alta velocità citometria può essere eseguito utilizzando un BD LSR II dotato di un lettore di piastre HTS.
- Programma software per mixare ogni ben tre volte (100 volumi mix microlitri) e analizzare 30 microlitri, o almeno 2000 eventi cellula, di ogni campione.
- I dati raccolti possono essere analizzati in FlowJo o software equivalente. Metriche utili sono la percentuale di + tallone, o cellule fluorescenti, che fornisce una misura del numero dei fagociti presenti, così come l'intensità di fluorescenza delle cellule fagocitarie, che fornisce una misura del numero di perline fagocitati. Moltiplicando questi valori genera un sistema integrato di media intensità fluorescente, o iMFI.
- Il numero medio di perline fagocitati da ogni cellula fagocitica può essere calcolato dividendo il iMFI dalla fluorescenza media di 1 perlina.
7. Rappresentante Risultati
Ci dovrebbe essere una chiara differenziazione dei campioni di anticorpi da parte di soggetti affetti e non. Figura 1A presenta gli istogrammi FACS di un campione di anticorpi da HIV negativozione (traccia nera) e un soggetto sieropositivo (traccia grigia), e dimostra la fagocitosi aumentato guidato dalla presenza di antigene-specifici anticorpi.
Sensibilità ottimale del test dipende dalla saturazione delle perle con l'antigene biotinilato. Figura 1B presenta la fagocitosi osservata quando perle rivestite con differenti quantità di antigene sono stati opsonizzati con 3 anticorpi monoclonali di controllo (tra cui un non-legame degli anticorpi, triangoli), e stabilisce 2μg antigene / mL come perle di una concentrazione di saturazione per questo antigene.
Una curva dose-risposta è illustrato nella figura 2, e dimostra la capacità differenziale di campioni anticorpo soggetti a indurre la fagocitosi su una gamma di anticorpi concentrazione di 0,05-5 mg / ml. Questo fagocitosi differenziale può essere guidata da due differenze di titolo o di proprietà del dominio Fc come sottoclassi di IgG e lo stato di glicosilazione.
Quando cellule THP-1 sono iMaged al microscopio a fluorescenza, non c'è chiara evidenza di fagocitosi tallone. La figura 3 presenta due 63x immagini di cellule THP-1, dopo incubazione con anticorpi opsonizzati (verde) e non opsonizzati (rosso) perline, dimostrando la mancanza di assorbimento fagocitaria in assenza di anticorpi. Quando lasso microscopia volta che viene eseguito, l'anticorpo specifico per l'assorbimento fagocitica di perline fluorescenti è ancora più evidente (Movie 1, ingrandimento 20x).
Il lavoro precedente ha confermato l'interiorizzazione delle perline associati con le cellule, e gli esperimenti con i monociti primari hanno concordato anche con punteggi fagocitica (valori iMFI) in questo saggio un throughput elevato (dati non riportati).
Figura 1. Controllo Qualità di analisi. 1A, citometria a flusso istogrammi di fagocitosi per un campione di anticorpi di un soggetto HIV negativo (nero tracce) e un soggetto sieropositivo (traccia grigia).1B: Determinazione sperimentale delle condizioni ottimali di rivestimento tallone per un antigene del campione. Antigene-specifici anticorpi monoclonali (cerchio, quadrato) dimostrano fagocitosi massima di perle rivestite con> 2 mg antigene / l di perline, mentre un anticorpo di controllo (triangolo) dimostra nessuna attività fagocitaria.
Figura 2. Fagocitosi curva dose-risposta. Campioni clinici degli anticorpi di HIV positivi (trattati, non trattati, e esibendo il controllo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale) e HIV negativi fagocitosi guidare soggetti di gp120 (busta HIV) perle di rivestimento differenziato.
Figura 3. Internalizzazione efficiente. Microscopia conferma l'internalizzazione di anticorpi opsonizzati perline (verde), mentre non opsonizzati perle rimangono in soldistribuzione pesi (ingrandimento 63x).
Movie 1. Time-lapse microscopia di anticorpi-driven fagocitosi è stata eseguita nel corso di 14 ore e permette di visualizzare l'attività fagocitaria del THP-1 le cellule utilizzate nel settore high-throughput test. Verde perline fluorescenti sono anticorpi opsonizzati, rosso perline fluorescenti forniscono un controllo negativo. Clicca qui per guardare il film.
Discussion
Il test qui descritto consente di high-throughput analisi dell'attività fagocitaria dei campioni di anticorpi clinici utilizzando una linea cellulare monocitica lungo utilizzato per studiare i processi di fagocitosi 10 e piastra di citometria a flusso basato automatizzato. Questo test è vantaggioso rispetto ad altri nella sua capacità di caratterizzare con precisione antigene-anticorpi specifici sottoinsiemi, consentendo non solo per lo studio delle differenze di fagocitosi guidato da anticorpi specifici per la malattia da soggetti diversi, ma anche lo studio delle specificità antigeni multipli all'interno della stessa materia. Perché il reclutamento di anticorpi innata cellule effettrici, tra cui monociti e le cellule che presentano l'antigene altri impatti fortemente esito della malattia 11-13, ed è biologicamente geometria variabile a seconda degli anticorpi, sottoclassi di IgG, e glicosilazione a Asparagine297 del dominio Fc 14-16, questo metodo prevede valutazione di un meccanismo di azione degli anticorpi critica. Inoltre, poiché anticorpo-medifagocitosi ated è sfruttata da alcuni agenti patogeni nel corso di infezione da 7,17,18, questo saggio promette nella valutazione del processo di valorizzazione anticorpo-dipendente, e mette in evidenza la duplice natura della fagocitosi come potenzialmente protettivi, così come potenzialmente dannoso l'attività degli anticorpi.
Il test descritto può essere utilizzato per analizzare gli anticorpi da campioni clinici di popolazioni di pazienti, ma anche dei vaccinati, e può essere adattato ad utilizzare siero piuttosto che IgG purificata. Inoltre, la secrezione di citochine in risposta alla fagocitosi può essere analizzato dal supernatante della coltura, e l'influenza di FCR specifico può essere determinato utilizzando FCR-bloccanti gli anticorpi, che consente non solo le differenze in potenza fagocitaria da definire, ma a valle di segnalazione eventi, con acume nel meccanismo, e possono aiutare a risolvere e perfezionare la comprensione di questo meccanismo immunitario.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare per i finanziamenti dal NIH 3R01AI080289-02S1, e un Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship in NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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