Summary
Мы представляем высокой пропускной проточной цитометрии анализа для определения фагоцитарной активности антиген-специфические антитела из клинических образцов, используя флуоресцентные антиген покрытые бисером и моноцитов клеточной линии, выразив несколько Fc рецепторов, обеспечение использования рецепторов и фагоцитарную определения активности в стандартизированной и воспроизводимые мода на любой антиген интереса.
Abstract
Антитела управляемой фагоцитоз индуцирована с помощью участия Fc рецепторы на профессиональном фагоцитов, и может способствовать как клиренс, а также патологии заболевания. Хотя свойства вариабельных доменов антител уже давно считается критическим в естественных условиях функцию, способность антител к набору врожденных иммунных клеток через их области Fc становится все более ценится как главный фактор в их эффективность, как в настройке рекомбинантных моноклональных антител терапии, а также в ходе естественного заражения или вакцинации 1-3.
Важно отметить, что несмотря на свою номенклатуру, как константного домена, домен антител Fc не имеет постоянной функции, и сильно модулируется IgG подкласса (IgG1-4) и гликозилирования на Аспарагин 297 4-6. Таким образом, этот метод для исследования функциональных различий антиген-специфических антител в клинических образцов будет способствовать соотношение фагоцитарной горшокдифференциальных антител к болезни государства, восприимчивость к инфекции, прогрессирование или клинического исхода.
Кроме того, это эффекторные функция особенно важно в свете документально подтвержденной способности антител к повышению инфекции, предоставляя доступ в патогенные клетки хозяина через Fc рецепторов управляемой фагоцитоз 7. Кроме того, существуют некоторые доказательства, что фагоцитарная поглощение иммунных комплексов может повлиять Th1/Th2 поляризации иммунного ответа 8.
Здесь мы описываем анализа предназначен для обнаружения различий в антитело-индуцированного фагоцитоза, которые могут быть вызваны дифференциальной IgG подкласса гликана структуры на Asn297, а также способность к образованию иммунных комплексов антиген-специфических антител в высокой пропускной способности моды . С этой целью 1 мкм люминесцентные бусины покрыты антигеном, затем инкубировали с антителами клинических образцов, создавая флуоресцентные антиген специфических иммунных комплексов. Эти antiboду-опсонизированным бисер затем инкубировали с моноцитов клеточной линии выразить несколькими FcγRs, в том числе и тормозных и активации. Анализ выход может включать фагоцитарную активность, секрецию цитокинов, и модели использования FcγRs, и полны решимости в стандартизованной форме, что делает это очень полезная система для анализа различий в это антитело-зависимой эффекторной функции в обеих инфекций и вакцины-опосредованной защиты 9.
Protocol
1. Культура фагоциты
- Культура THP-1 клетках 10 в RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, как стационарные подвески в колбах T. Плотность клеток должна быть сохранена ниже 0.5x10 6 / мл, чтобы сохранить постоянный уровень выражения FcγR и анализа производительности.
2. Подготовка Биотинилированные антигена
- Рассчитайте количество сульфо-NHS LC биотин реагентов необходимо biotinylate антигена-мишени интересов в соответствии с инструкциями производителя.
- Растворите биотинилирование реагента в воду и сразу же добавить к расчетному количеству антигена в буфер, который не содержит первичные амины. Разрешить протекания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре, время от времени смешивания.
- Удалите излишки, неконъюгированного биотин от буфера обмена в Amicon центробежные единицу концентрацию соответствующего молекулярного веса обрезания сохранить маленький круглый щитт антигена. Добавить образца до верхней палаты концентрацией единицы и добавить PBS довести общий объем до 15 мл линии заполнения. Центрифуга при 4000 мкг довести объем до примерно 1,5 мл. Повторяя этот процесс дважды удалит 99% свободного биотина для обеспечения максимального покрытия антигена бисером.
3. Подготовка антигена Насыщенные бисер
- Вымойте 100 мкл 1 мм люминесцентные бусины neutravidin два раза в 1 мл 0,1% PBS-BSA после спиннинг вниз в микроцентрифужных на высокой скорости. Ресуспендируют мыть бусин в 100 мкл PBS-BSA, и аликвоту в 10 трубок.
- Для определения антигена покрытия условий, которые насыщают бусы, объединить 10 мкл мыть бусинка подвеска с различной концентрацией антигена биотинилированного в два раза шагов. Выдержите в течение ночи при 4 ° С в микроцентрифужных трубки на ротатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Насыщенность из бисера должны быть определены экспериментально. Это может быть достигнутопутем выявления бусинка покрытия условий, которые дают максимальный фагоцитоз, когда бисер впоследствии опсонизированным с контролем моноклональных антител.
- Удаление несвязанных антигенов при помощи промывки 1 мл PBS-BSA и центрифуге при высокой скорости до бисер гранулированный. Удалить PBS-BSA и повторите упражнение.
- Ресуспендируют антиген-покрытием бусин в конечном объеме 1 мл в PBS-BSA. Бисер может храниться до недели при температуре 4 ° C до использования.
4. Подготовка антител Образцы
- Клинические образцы антител может быть очищен от плазмы с помощью дыни гель IgG очистки комплект в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные IgG могут храниться при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
Примечание: соответствующие меры предосторожности по обращению человека образцы должны всегда было принято.
- Определение концентрации очищенных антител абсорбции при A280, и разбавленных образцах до 1 мг / мл в PBS.
- Подготовка постулироватьив и отрицательные моноклональных антител контроль путем разбавления до 1 мг / мл в PBS.
5. Покрытие эксперимент
- Ресуспендируют промывают, антиген насыщенный раствор, приготовленный шарик сверху вортексе и передачи 10 мкл в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы постоянно агитировать бусинка подвески для обеспечения равного количества флуоресцентного бисера добавляли в каждую лунку.
- Добавить различные концентрации антител, представляющих интерес для каждой скважины, создавая кривой доза-реакция для каждого антитела. Оптимальная концентрация будет отличаться от образцов в зависимости от титра антител, но диапазоне от 0,01-100 мкг / мл, конечная концентрация обеспечит хорошее покрытие и позволяет идентифицировать диапазоне концентраций интерес. Обеспечить антитела добавляются в объемах не более 20 мкл.
- Инкубируйте бисером и антител образцы в течение 2 часов при температуре 37 ° C, чтобы антитела к opsonize бисером. </ LI>
- Подготовка приостановлении THP-1 клетках на уровне 2,5 х 10 5 клеток / мл, и добавьте 200 мкл этой суспензии в каждую лунку, в общей сложности 5 х 10 4 ТНР-1 клеток в каждой лунке.
- Выдержите в течение ночи при 37 o C, 5% СО 2, в стационарных инкубатор, позволяющий клеткам и бусы для осаждения с помощью гравитации.
ПРИМЕЧАНИЕ: сигнал-шум может быть улучшено путем определения оптимального бусинка: антитела: THP-1 клетка отношения для данного источника антигена и антитела.
6. Проточной цитометрии
- Удалить 100 мкл супернатанта из каждой лунки стараясь не нарушать клеточный осадок. Супернатант может быть сохранен, если секрецию цитокинов определений или другие анализы лучшего.
- Для фиксации, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку и пипетки для ресуспендирования и смешать клетки.
- Высокая пропускная способность проточной цитометрии можно выполнить с помощью BD LSR II оснащен читателя пластины HTS.
- Программа программное обеспечение, чтобы смешивать каждую лунку три раза (100 мкл смеси) и анализ 30 мкл, или по крайней мере 2000 событий клетки, каждого образца.
- Данные, собранные могут быть проанализированы в FlowJo или эквивалент программного обеспечения. Полезные метрики включают процентов из бисера +, или флуоресцентные клетки, которая обеспечивает показатель количества фагоцитирующих клеток, присутствующих, а также интенсивности флуоресценции фагоциты, который позволяет определить число фагоцитированы бисером. Умножив эти значения создает интегрированные люминесцентные означает интенсивность, или iMFI.
- Среднее количество бусин фагоцитированы каждым фагоцитарной клетки может быть вычислена путем деления iMFI на среднее флуоресценции 1 шарик.
7. Представитель Результаты
Там должно быть четкое разграничение антител образцов из пораженных и здоровых субъектов. Рисунок 1А представляет FACS гистограммы антител выборки из ВИЧ-отрицательныйTIVE (черная линия) и ВИЧ-инфицированных (серый след) предмета, и демонстрирует, увеличилось фагоцитоз обусловлен наличием антиген-специфических антител.
Оптимальная чувствительность теста зависит от насыщенности бусины с биотинилированного антигена. На рисунке 1б представлена фагоцитоза наблюдалась при бисером покрытием с различными количество антигена были опсонизированным с 3 контроль моноклональных антител (в том числе необязательных антител, треугольники), и устанавливает 2μg антиген / мкл бисером, как насыщающей концентрации этого антигена.
Кривой доза-реакция представлена на рисунке 2, а также демонстрирует способность дифференциальных субъекта образцы антител вызывать фагоцитоз за диапазон антител концентрации 0,05-5 мкг / мл. Этот дифференциал фагоцитоза может быть вызвано либо различия в титра или Fc домен свойств, таких как IgG подкласса и гликозилирование государства.
Когда THP-1 клетках яМагед методом флуоресцентной микроскопии, существует явное свидетельство из бисера фагоцитоза. На рисунке 3 представлены два 63x неподвижные изображения ТНР-1 клеток после инкубации с антителом опсонизированным (зеленый) и не опсонизированным (красный) бусы, демонстрируя отсутствие фагоцитарной поглощения при отсутствии антител. При микроскопии промежуток времени выполнен, антитело-специфический фагоцитарной поглощения флуоресцентного бисера еще более разительна (фильм 1, 20-кратным увеличением).
Предыдущая работа подтвердила интернализации бисером связанных с клетками, и эксперименты с первичной моноцитов согласились также с фагоцитарной баллов (iMFI значения) в этой высокой анализа пропускной способности (данные не представлены).
Рисунок 1. Пробирного управления качеством. 1А, Проточная цитометрия гистограммы фагоцитоза для антител выборки из ВИЧ-отрицательных субъекта (черный луч) и ВИЧ-инфицированных субъекта (серый след).1B: Экспериментальное определение оптимальных условий бусинка покрытие для образца антигена. Антиген-специфические моноклональные антитела (круг, квадрат) демонстрируют максимальное фагоцитоз из бисера покрытые> 2 мкг антигена / мкл из бисера, в то время как контроль антител (треугольник) демонстрирует не фагоцитарной активности.
Рисунок 2. Фагоцитоз кривой доза-реакция. Клинические образцы антител от ВИЧ-инфицированных (лечить, лечить, и экспонирования контроль репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии) и ВИЧ-отрицательные диск субъектов фагоцитоз gp120 (ВИЧ конверте), покрытых бисером дифференцированно.
Рисунок 3. Эффективное интернализации. Микроскопия подтверждает интернализация антител опсонизированным шариков (зеленый), в то время как не-опсонизированным бисером оставаться в зольution (63x увеличение).
Фильм 1. Покадровый микроскопии антител управляемой фагоцитоз был выполнен в течение 14 часов и позволяет визуализировать фагоцитарной активности THP-1 клетках, используемых в высокой пропускной способности анализа. Зеленый флуоресцентный бисер антител опсонизированным, красного флуоресцентного бисера обеспечить отрицательного контроля. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.
Discussion
Анализа, описанного здесь, позволяет с высокой пропускной анализ фагоцитарной активности клинических образцов антител с использованием клеточной линии моноцитов давно используются для исследования фагоцитарной процессы 10 и тарелка основана автоматизированной проточной цитометрии. Этот анализ является преимуществом по сравнению с другими в своей способности точно характеризуют антиген-специфических антител подмножества, позволяющая не только для изучения различий в фагоцитоз обусловлен конкретных заболеваний антитела от различных предметов, но и изучение нескольких особенностей антигена в пределах одного субъекта. Поскольку антитела набора врожденных эффекторных клеток, включая моноциты и другие антиген представляющих клеток сильно воздействие исход заболевания 11-13, и является биологически переменной геометрией в зависимости антител, IgG подкласса и гликозилирования на Asparagine297 из Fc домен 14-16, этот метод обеспечивает оценка важнейший механизм действия антител. Кроме того, поскольку антитела-МЕДИated фагоцитоз эксплуатируется некоторыми патогенными в ходе инфекции 7,17,18, этот анализ перспективным в оценке процесса антитело-зависимой аксессуар и подчеркивает двойственную природу фагоцитоза как потенциально защитные, а также потенциально вредное активности антител.
Анализа, описанного могут быть использованы для анализа антител из клинических образцов от пациентов населения, но и привитых, а также может быть адаптирована для использования сыворотки, а не очищенным IgG. Кроме того, секрецию цитокинов в ответ на фагоцитоз могут быть проанализированы с супернатанта культуры и влияния конкретных FcR может быть определена с помощью FCR-блокирующих антител, что позволяет не только различия в фагоцитарной потенции, которые будут определены, но ниже по течению сигнальных событий, с пониманием в механизм, и возможно, поможет вам и уточнить понимание этого иммунный механизм.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы признают, финансирование от NIH 3R01AI080289-02S1 и Гарвардского университета Центра исследований СПИДа ученый стипендий под NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
