Summary
Biz reseptörleri sağlayan birden fazla Fc ifade floresan antijen kaplı boncuklar ve monositik hücre hattı kullanan standart bir reseptör kullanımı ve fagositik aktivite tayinleri ve klinik örneklerde antijen-spesifik antikorların fagositik aktivitesini belirlemek için yüksek verimli bir akış sitometrik tahlil mevcut ilgi herhangi bir antijen için tekrarlanabilir moda.
Abstract
Antikor-odaklı fagositoz nişan profesyonel fagositler Fc reseptörleri aracılığıyla ortaya çıkar ve hastalığın yanı sıra her iki boşluk patoloji katkıda bulunabilir. Antikorların değişken etki özellikleri uzun in vivo fonksiyonu için kritik olarak kabul edilmiştir, antikor Fc etki alanları üzerinden doğuştan gelen bağışıklık hücreleri işe yeteneği hem rekombinant bir ortamda, önemli bir faktör olarak etkinliğini giderek takdir haline gelmiştir monoklonal antikor tedavisi yanı sıra, doğal enfeksiyon sırasında ya da 1-3 aşı .
Önemlisi, sürekli bir etki alanı olarak isimlendirilmesi rağmen, antikor Fc, etki alanı sabit fonksiyon ve IgG alt sınıf (IgG1-4) ve glikozilasyon 297 4-6 Asparagin az güçlü modüle değildir . Böylece, bu yöntem klinik örneklerde antijen-spesifik antikorların işlevsel farklılıklar çalışma fagositik pot korelasyon kolaylaştırmakantikorların hastalık durumu, enfeksiyona yatkınlık, ilerlemesi, ya da klinik sonuç ential.
Ayrıca, bu efektör fonksiyon Fc reseptör odaklı fagositoz 7 ile konak hücre içine patojenler erişim sağlayarak enfeksiyon antikor geliştirmek için belgelenmiş yeteneği ışığında özellikle önemlidir. Ayrıca, immün kompleksler fagositik alımı bağışıklık yanıtı 8 Th1/Th2 kutuplaşma etkisi dair bazı kanıtlar vardır.
Burada, biz, diferansiyel IgG alt, Asn297 glukanıdır yapısının yanı sıra, yüksek verimli bir biçimde bağışıklık spesifik antijen-antikor komplekslerini oluşturmak için yeteneği neden olabilir antikor-kaynaklı fagositoz farklılıklar tespit etmek için tasarlanmış bir test tarif . Bu amaçla, 1 mikron floresan boncuk sonra klinik antikor örnekleri ile inkübe floresan antijen spesifik immün kompleksler oluşturmak, antijen ile kaplanmıştır. Bu antibody-opsonized boncuk inhibitör ve etkinleştirme de dahil olmak üzere, birden fazla FcγRs ifade monositik hücre hattı ile inkübe edilir. Testi çıkış fagositik aktivitesi, sitokin sekresyon ve FcγRs kullanım alışkanlıkları, ve bu enfeksiyon ve aşı aracılı koruma 9 hem de bu antikor-bağımlı efektör fonksiyon ayrıştırma farklılıklar için oldukça yararlı bir sistem, standart bir şekilde belirlenir.
Protocol
1. Kültür fagositik hücreler
- Kültür THP-1 10 hücre RPMI 1640 T matara sabit bir süspansiyon olarak% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. FcγR ifade ve test performansı tutarlı düzeyde korumak için hücre yoğunluğu 0.5x10 6 / ml altında tutulmalıdır.
2. Biotinlenmiş Antijen hazırlayın
- Üreticinin talimatlarına göre faiz hedef antijen biotinylate için gerekli sulfo-NHS LC biotin reaktif kiti miktarını hesaplayın.
- Biyotinilasyon reaktif su içinde çözülür ve birincil aminler içermez bir tampon hemen antijen için hesaplanan miktar ekleyin. Reaksiyon, ara sıra karıştırarak, oda sıcaklığında 1 saat süreyle devam etmek için izin verin.
- Küçük kalkan korumak için uygun bir molekül ağırlığı kesme Amicon santrifüj konsantrasyon biriminde tampon döviz fazlalığı, indirekt biotin çıkarınt antijen. Konsantrasyon birimi üst odasına örnek ekleyin ve toplam hacmi 15 ml doldurma çizgisine getirmek için PBS ekleyin. Yaklaşık 1.5 ml hacim getirmek için 4000 xg'de santrifüjleyin. Bu işlemi tekrarlayarak boncuk antijen maksimum kaplama sağlamak için iki kez serbest biotin% 99 kaldıracaktır.
3. Antijen Doymuş Boncuk hazırlayın
- Iki kere 1, 1 mm floresan neutravidin boncuk 100 ul yıkayın ml% 0.1 PBS-BSA yüksek hızda bir mikrosantrifüj iplik sonra. Yeniden süspanse 10 tüp içine 100 ul PBS-BSA ve kısım boncuk yıkanır.
- Boncuklar doyurabilecek antijen kaplama koşulları belirlemek için, iki kat adımlar biotinlenmiş antijen konsantrasyonlarında değişen yıkanmış boncuk süspansiyonu ile 10 ul birleştirir. Rotator mikrosantrifüj tüp 4 ° C'de bir gece inkübe edin.
NOT: Doygunluk boncuk, deneysel olarak tespit edilmelidir. Bu yapılabilir, boncuk, sonradan kontrol monoklonal antikor ile opsonized zaman maksimum fagositozda verimi boncuk kaplama koşulları belirleyerek.
- Boncuk pelet kadar yüksek hızda 1 ml PBS-BSA ve santrifüj ile yıkanarak bağlanmamış antijen çıkarın. PBS-BSA kaldırın ve tekrar edin.
- Son hacim 1 ml PBS-BSA yeniden süspanse antijen kaplı boncuk. Boncuk 4 ° C kullanımdan önce bir hafta kadar saklanır olabilir.
4. Antikor Örnekleri hazırlayın
- Klinik antikor örnekleri, plazma, üretici talimatlarına göre bir Kavun jel IgG saflaştırma kiti kullanarak arındırılmalıdır. Saflaştırılmış IgG 4 ° C kullanıma hazır olana kadar saklanabilir.
NOT: Uygun önlemler işlenmesiyle ilgili insan numunelerinde her zaman alınmış gerekir.
- A280 absorbans antikorlar arıtılmış konsantrasyonu belirlemek ve örnekleri PBS içinde 1 mg / ml seyreltik.
- Varsaymak hazırlayın1 mg / ml PBS seyreltme ive ve negatif monoklonal kontrol antikorlar.
5. Deney Kaplama
- Vorteks yukarıda hazırlanan yıkanmış, antijen doymuş boncuk çözüm süspanse edin ve yuvarlak bir alt 96 plaka her kuyuya 10 ul aktarmak. Bakım, her bir kuyunun eklenir eşit sayıda floresan boncuk sağlamak için sürekli boncuk süspansiyonu ajitasyon alınmalıdır.
- Her antikor için bir doz-yanıt eğrisi oluşturma, her bir kuyunun ilgi antikorlar konsantrasyonları değişen ekleyin. Optimal konsantrasyonları mevcut antikor titresi bağlı örnekleri arasında farklılık gösterir, ancak 0.01-100 mikrogram / ml final konsantrasyonda bir dizi iyi kapsama sağlamak ve ilgi konsantrasyon aralığı belirlenmesini sağlayacaktır. 20 ul daha geniş hacimli olun antikorları eklenir.
- 37 2 saat inkübe boncuk ve antikor örnekleri ° C antikorları boncuk opsonize için izin vermek. </ Li>
- THP-1 hücrelerinin 2.5 x 10 5 hücre / ml süspansiyon hazırlamak, toplam 5 x, her bir kuyunun bu süspansiyon 200 ul 10 4 THP-1 hücreler her iyi.
- 37 ° gecede ° C'de,% 5 sabit bir inkübatör CO 2, yerçekimi üzerinden pelet izin hücreleri ve boncuk.
NOT: Sinyal gürültü optimal boncuk belirlenmesinde tarafından geliştirilmiş olabilir: antikoru: THP-1 hücre oranları belirli bir antijen ve antikor kaynağı için.
6. Akış sitometrik analizi
- Her hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak süpernatant 100 ul çıkarın. Sitokin salgılanması tespitler veya diğer analizler istendiğinde supernatant kaydedilebilir.
- Sabitlenmesi için, her bir kuyu ve pipetlemeyin hücreleri tekrar süspansiyon ve mix 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin.
- Yüksek verim akım sitometri analizi bir HTS plaka okuyucu ile donatılmış bir BD LSR II kullanılarak yapılabilir.
- Program yazılımı her iyi üç kez (100 ul karışımın hacmi) karıştırın ve her numunenin 30 ul, ya da en az 2000 hücre olaylar, analiz etmek.
- FlowJo veya eşdeğer yazılım toplanan veriler analiz edilebilir. Faydalı ölçümlerini boncuk + yüzde floresan hücreler, mevcut fagositik hücrelerin sayısının bir ölçüsüdür sağlar, fagosite boncuk sayısının bir ölçüsüdür sağlar fagositik hücrelerinin yanı sıra floresan içerir. Bu değerlerin çarpılması entegre bir ortalama floresan yoğunluğu, veya iMFI üretir.
- Her fagositik hücre tarafından fagosite boncuk ortalama sayısı 1 boncuk ortalama floresan iMFI bölünmesi ile hesaplanır.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Etkilenen ve etkilenmeyen konularda antikor örneklerinin açık bir farklılaşma mevcut olmalıdır. Şekil 1A, HIV negatif bir antikor örnek FACS histogramlartive (siyah eser) ve HIV pozitif (gri iz) konu ve antijen-spesifik antikorların varlığı ile tahrik artan fagositoz göstermektedir.
Optimum duyarlılık testinin biotinlenmiş antijen ile boncuk doygunluğu bağlıdır. Şekil 1B farklı miktarlarda antijen ile kaplı boncuklar (bağlayıcı olmayan bir antikor, üçgenler de dahil olmak üzere) 3 kontrol monoklonal antikorlar ile opsonized olduğu gözlenen fagositoz sunar ve bir doyurarak konsantrasyon olarak bu antijeni 2μg antijen / ml boncuk kurar.
Bir doz-yanıt eğrisi Şekil 2'de sunulan ve 0,05-5 mg / ml antikor konsantrasyon aralığında fagositoz ikna etmek için tabi antikor örneklerinin diferansiyel kapasitesini gösteriyor. Bu diferansiyel fagositoz titresi veya IgG alt ve glikozilasyon devlet olarak Fc etki alanı özellikleri farklılıklar ya da tahrik olabilir.
THP-1 hücreleri i zamanMaged floresan mikroskobu ile, boncuk fagositoz açık bir kanıt yoktur. Şekil 3, antikor opsonized (yeşil) ve non-opsonized (kırmızı) boncuk ile inkübasyon sonra antikor yokluğunda fagositik alımı eksikliği gösteren THP-1 hücreleri hala görüntüleri iki 63x sunar. Zaman atlamalı mikroskopi yapıldığında, floresan boncuk antikor özel fagositik alımı daha da çarpıcıdır (Film 1, 20x büyütme).
Önceki iş hücreleri ile ilişkili boncuk içselleştirilmesi onaylamıştır ve birincil monositler ile ilgili deneyler, bu yüksek verim assay (veriler gösterilmemiştir) fagositik puanları (iMFI değerler) ile mutabık kalmışlardır.
Şekil 1 Kalite Kontrol Testi. 1A, bir antikor örnek için HIV negatif bir konu (siyah iz) ve HIV pozitif bir konuda (gri iz) fagositoz Flow sitometri histogramlar.1B: Deneysel örnek bir antijen için en uygun boncuk kaplama koşullarının belirlenmesi. Bir kontrol antikor (üçgen) fagositik aktivite gösterir antijen-spesifik monoklonal antikorlar (daire, kare), boncuk antijen / ul> 2 mg ile kaplı boncuk maksimum fagositoz göstermektedir.
Şekil 2 Fagositoz doz-yanıt eğrisi. Farklı HIV pozitif (tedavi edilen, işlenmemiş, viral replikasyon kontrolü ve anti-retroviral tedavi yokluğunda sergileyen) ve gp120 HIV negatif konular sürücü fagositoz (HIV zarf) kaplı boncuk Klinik antikor örnekleri.
Şekil 3. Verimli İçselleştirme. Mikroskopi, non-opsonized boncuk sol kalırken antikor opsonized boncuk (yeşil) içselleştirilmesi teyitution (63x büyütme).
Movie 1, antikor-odaklı fagositoz Time-lapse mikroskopi 14 saat boyunca yüksek verim tayininde kullanılan THP-1 hücrelerinin fagositik aktivite görselleştirme yapılır ve izin verir oldu . Yeşil floresan boncuk antikor opsonized, kırmızı floresan boncuk olumsuz bir kontrol sağlar. film izlemek için buraya tıklayın.
Discussion
Burada açıklanan tahlil fagositik süreçleri 10 ve plaka bazlı otomatik flow sitometri uzun çalışma için kullanılan bir monositik hücre hattı kullanılarak klinik antikor örneklerinin fagositik aktivitesi yüksek verimlilik analizi sağlar. Bu testte sadece farklı konularda hastalığa özgü antikorlar tarafından tahrik fagositoz farklılıklar çalışma için izin, antijen-antikor altkümelerini tam olarak karakterize etmek için kendi yeteneği diğerleri üzerinde avantajlı değil, aynı zamanda, aynı konuda içinde birden fazla antijen özgüllükleri çalışma. Antikor işe doğuştan efektör hücreleri, monositler ve diğer antijen sunan hücreler de dahil olmak üzere güçlü bir hastalık sonucu 11-13 etkileri ve Fc etki alanı 14-16 Asparagine297 antikor geometri, IgG alt ve glikozilasyon bağlı olarak biyolojik değişken olduğu için, bu yöntem sağlar. kritik bir eylem antikor mekanizmasının değerlendirilmesi. Ayrıca, antikor-medi çünküated fagositoz 7,17,18 enfeksiyonu seyri sırasında bazı patojenler tarafından sömürüldü, bu testte antikor-bağımlı geliştirme sürecinin değerlendirilmesi söz tutan ve potansiyel koruyucu, hem de potansiyel olarak zararlı olarak fagositoz ikili doğasını vurgular antikor aktivitesi.
Açıklanan test hasta popülasyonları klinik örneklerinden antikorlar analiz etmek için kullanılan, aynı zamanda aşılananların ve saflaştırılmış IgG yerine serum kullanmak için adapte edilebilir olabilir. Ayrıca, kültür süpernatant fagositoz yanıt sitokin salgılanması analiz edilecek ve özel FCR etkisi belirlenecek fagositik potens tek fark sağlayan, FCR-bloke edici antikorlar kullanarak tespit edilebilir, ancak aşağı akım anlayışı ile, olaylar sinyalizasyon mekanizmasını çözmek ve bu bağışıklık mekanizmasının anlaşılmasını ve rafine yardımcı olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar NIH 3R01AI080289-02S1 ve Harvard Üniversitesi Center NIH / NIAID 2P30AI060354-07 altında AIDS Araştırma Görevlisi Bursu için bir fon kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
