Summary
نقدم مقايسة تدفق عالية الإنتاجية cytometric لتحديد النشاط من أكلة مستضد محددة الأجسام المضادة من العينات السريرية ، وذلك باستخدام الفلورية مستضد المغلفة الخرز وخط خلية الوحيدات التعبير عن مستقبلات القطعة Fc متعددة الاستخدام توفير مستقبل والقرارات في النشاط أكلة موحدة و أزياء استنساخه عن أي مستضد من الفائدة.
Abstract
وبفعل الضد يحركها البلعمة عبر إشراك مستقبلات القطعة Fc على البالعات المهنية ، ويمكن أن تساهم في إزالة الألغام على حد سواء فضلا عن باثولوجيا المرض. بينما منذ فترة طويلة من خصائص المجالات متغير من الأجسام المضادة تعتبر حاسمة لفي وظائف الجسم الحي ، أصبح من قدرة الأجسام المضادة لتجنيد الخلايا المناعية الفطرية عبر عن تقديره لهم مجالات التيسير على نحو متزايد باعتباره عاملا رئيسيا في مدى فعاليتها ، سواء في تحديد المؤتلف وحيدة النسيلة العلاج الأضداد ، وكذلك في سياق العدوى الطبيعية أو التطعيم 1-3.
الأهم من ذلك ، على الرغم من التسميات على النحو مجال المستمر ، ومجال التيسير الضد لا يملك وظيفة ثابتة ، وغير منظم بقوة فرعية مفتش (IgG1 - 4) ، وارتباط بالغليكوزيل في الهليونين 297 4-6. وبالتالي ، فإن هذا الأسلوب لدراسة الفروق الفنية للمستضد محددة الأجسام المضادة في عينات سريرية سيسهل العلاقة من وعاء أكلةential من الأجسام المضادة لحساسية المرض ، والدولة للعدوى ، والتقدم ، أو نتيجة سريرية.
علاوة على ذلك ، هذه الوظيفة المستجيب له أهمية خاصة في ضوء قدرة موثقة من الأجسام المضادة لتعزيز العدوى عن طريق توفير وصول الممرضات الى خلايا البلعمة المضيف عبر مستقبلات القطعة Fc يحركها 7. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بعض الأدلة على أن امتصاص أكلة في مأمن من المجمعات يمكن أن تؤثر على الاستقطاب Th1/Th2 للاستجابة المناعية 8.
هنا ، نحن تصف مقايسة مصممة للكشف عن الاختلافات في البلعمة الضد التي يسببها ، والتي قد يكون سببها فرعية مفتش التفاضلية ، في هيكل غليكان Asn297 ، فضلا عن القدرة على تكوين أجسام مضادة مناعية مجمعات محددة المستضد بطريقة عالية الإنتاجية . ولهذه الغاية ، والمغلفة 1 ميكرومتر مع حبات الفلورسنت مستضد ، ثم حضنت مع عينات سريرية الأضداد ، وتوليد المستضدات محددة الفلورسنت مجمعات المناعي. هذه antiboثم يتم تحضين DY - opsonized الخرز مع خط خلية الوحيدات معربا عن FcγRs متعددة ، بما في ذلك تفعيل والمثبطة. يمكن إخراج مقايسة تشمل النشاط أكلة ، خلوى إفراز ، وأنماط استخدام FcγRs ، ونحن مصممون بطريقة موحدة ، مما يجعل هذا النظام مفيد للغاية لتحليل الاختلافات في هذه المهمة التي تعتمد على الضد المستجيب في كل من العدوى واللقاحات لحماية بوساطة 9.
Protocol
1. الخلايا البلعمية الثقافة
- ثقافة THP - 1 10 في الخلايا RPMI 1640 تستكمل مع مصل بقري جنيني 10 ٪ وتعليق ثابتة في قوارير تي. ينبغي الحفاظ على كثافة خلايا أدناه 0.5x10 6 / مليلتر من أجل الحفاظ على مستويات ثابتة من التعبير FcγR وأداء الفحص.
2. إعداد مستضد Biotinylated
- حساب كمية سلفو NHS - LC عدة كاشف البيوتين اللازمة لbiotinylate المستضد الهدف من الفائدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- حل كاشف biotinylation في الماء وعلى الفور إضافة إلى احتساب كمية المستضد في العازلة التي لا تحتوي على الأمينات الأولية. السماح للتفاعل والمضي قدما لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، والخلط في بعض الأحيان.
- إزالة الزائدة ، والبيوتين unconjugated عن طريق تبادل عازلة في تركيز وحدة Amicon الطرد المركزي لقطع الوزن الجزيئي المناسبة للاحتفاظ targeر مستضد. إضافة نموذج إلى الغرفة العليا من وحدة التركيز وإضافة إلى تقديم برنامج تلفزيوني إجمالي حجم ما يصل الى 15 مل خط التعبئة. الطرد المركزي في 4000 ليصل حجم XG وصولا الى ما يقرب من 1.5 ملل. تكرار هذه العملية مرتين سيزيل 99 ٪ من البيوتين مجانا لضمان أقصى قدر من طلاء مستضد إلى الخرز.
3. إعداد الخرز مستضد المشبعة
- تغسل حبات 100 ميكرولتر من 1 مم neutravidin الفلورسنت مرتين في 1 مل 0.1 ٪ PBS - BSA بعد الغزل في أسفل microcentrifuge بسرعة عالية. تغسل حبات Resuspend في 100 ميكروليتر PBS ، جيش صرب البوسنة ، وقسامة في 10 الأنابيب.
- لتحديد الظروف التي تشبع طلاء مستضد الخرز ، والجمع بين 10 ماي تعليق العمل في حبة غسلها مع تركيزات مختلفة من المستضد biotinylated في شقين الخطوات. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في أنبوب microcentrifuge على المدورة.
ملاحظة : يجب تحديد التشبع من الخرز تجريبيا. ويمكن تحقيق هذامن خلال تحديد حبة طلاء الظروف التي تسفر البلعمة القصوى عندما يتم لاحقا opsonized الخرز مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة السيطرة.
- إزالة المستضد غير منضم عن طريق الغسيل مع 1 مل PBS - BSA والطرد المركزي بسرعة عالية حتى حبات من مكعبات. إزالة برنامج تلفزيوني ، وكرر جيش صرب البوسنة.
- Resuspend مستضد المغلفة الخرز في الحجم النهائي من 1 مل في برنامج تلفزيوني ، جيش صرب البوسنة. ويمكن تخزين حبات لمدة تصل الى اسبوع على 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
4. تحضير عينات جسم
- يمكن تنقية العينات السريرية الضد من البلازما باستخدام البطيخ تنقية مفتش طقم جل وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ويمكن تخزين المنقى IgG في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
ملاحظة : يجب دائما الاحتياطات المناسبة بشأن التعامل مع العينات البشرية التي اتخذت.
- تحديد تركيز الأجسام المضادة التي المنقى الامتصاصية في A280 ، وتمييع عينات إلى 1 مغ / مل في برنامج تلفزيوني.
- إعداد يفترضإيف والسلبية الأضداد وحيدة النسيلة التي تحكم التخفيف إلى 1 مغ / مل في برنامج تلفزيوني.
5. الطلاء التجربة
- Resuspend وغسلها ، مستضد حل حبة المشبعة أعد vortexing أعلاه ، ونقل 10 ميكرولتر جيدا في كل لوحة من 96 جولة القاع أيضا. يجب توخي الحذر لتستنهض الهمم باستمرار تعليق حبة لضمان بأعداد متساوية من الخرز الفلورسنت تضاف إلى كل بئر.
- إضافة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة التي تهم كل بئر ، وخلق منحنى الجرعة والاستجابة لكل الأجسام المضادة. وسوف تختلف بين تركيزات الأمثل اعتمادا على عينات من عيار الأضداد الحاضر ، ولكن مجموعة من 0،01-100 ميكروغرام / مل تركيز النهائي سوف توفر تغطية جيدة وتسمح بتحديد نطاق تركيز الاهتمام. تضاف ضمان الأضداد في أحجام أكبر لا يتجاوز 20 ميكرولتر.
- الخرز واحتضان الضد عينات لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية للسماح للأضداد opsonize حبات </ لى>
- إعداد تعليق من الخلايا في THP 1 - 2.5 × 5 10 الخلايا / مل ، وإضافة 200 ميكروليتر من هذا التعليق على كل جانب ، ليصبح المجموع 5 × 10 4 - 1 THP الخلايا في كل بئر.
- احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 ، في حاضنة ثابتة ، والخرز الخلايا مما يسمح لتكوير عبر الجاذبية.
ملاحظة : قد يكون إشارة إلى تحسن الضوضاء عن طريق تحديد حبة الأمثل : الأضداد : THP - 1 نسب لمصدر خلية مستضد الضد ومعين.
6. تحليل تدفق Cytometric
- إزالة 100 ميكرولتر من طاف من كل رفاهية الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. يمكن حفظ إذا طاف المطلوب قرارات إفراز خلوى أو غيرها من التحليلات.
- للتثبيت ، إضافة 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4 ٪ لكل جيدا والماصة لresuspend ومزيج الخلايا.
- يمكن إجراء تحليل تدفق عالية الإنتاجية cytometric باستخدام LSR دينار بحريني الثاني مجهزا لوحة HTS القارئ.
- برنامج برنامج لخلط كل بئر ثلاث مرات (100 حجم مزيج ميكرولتر) وتحليل 30 ميكروليتر أو أحداث خلية على الأقل عام 2000 ، من كل عينة.
- ويمكن تحليل البيانات التي تم جمعها في FlowJo أو برامج مماثلة. قياسات مفيدة تشمل في المئة من + حبة ، أو خلايا فلوري ، الذي يوفر قدرا من عدد الخلايا البلعمية الحاضر ، فضلا عن كثافة مضان من الخلايا البلعمية ، والتي توفر مقياسا لعدد من الخرز phagocytosed. ضرب هذه القيم يولد متكامل يعني كثافة الفلورسنت ، أو iMFI.
- ويمكن حساب متوسط عدد حبات phagocytosed كل خلية بلعمية بقسمة iMFI من مضان يعني من 1 حبة.
7. ممثل النتائج
ينبغي أن يكون هناك تمايز واضح لعينات من المواد الضد المتضررة وغير المتضررة. الشكل 1A يعرض رسوم بيانية FACS عينة من الأجسام المضادة من فيروس نقص المناعة البشرية نيجاtive (تتبع الأسود) وموضوعا بفيروس نقص المناعة البشرية (تتبع الرمادي) ، ويدل على زيادة البلعمة يقودها وجود مستضد محددة الأجسام المضادة.
حساسية الأمثل للمقايسة يعتمد على التشبع من الخرز مع مستضد biotinylated. ويعرض الشكل 1B البلعمة احظ عندما كان opsonized حبات مغلفة مع كميات متفاوتة من المستضد مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التحكم 3 (بما في ذلك الأجسام المضادة غير ملزم ، مثلثات) ، ويؤسس 2μg مستضد / ميكروليتر الخرز بوصفها تركيز تشبع لهذا المستضد.
ويرد منحنى الجرعة والاستجابة في الشكل 2 ، ويدل على القدرة التفاضلية للعينات الخاضعة للحث على الضد البلعمة على جسم نطاق تركيز 0،05-5 ميكروغرام / مل. قد يكون الدافع وراء هذا الفرق البلعمة من قبل أي من الاختلافات في خصائص المجال أو عيار التيسير فرعية مثل مفتش الحكومة والدولة ارتباط بالغليكوزيل.
عندما THP - 1 الخلايا طماجد بواسطة المجهر الفلورسنت ، وهناك أدلة واضحة على البلعمة حبة. الشكل 3 يعرض two 63x تزال صور THP - 1 الخلايا بعد الحضانة مع opsonized الأضداد (الخضراء) وغير opsonized الخرز (الحمراء) ، مما يدل على عدم وجود امتصاص أكلة في غياب الأجسام المضادة. عندما يتم تنفيذ الوقت الفاصل المجهري ، وامتصاص الأجسام المضادة المحددة أكلة من الخرز فلوري هو أكثر إثارة للانتباه (فيلم 1 ، 20X التكبير).
وقد أكد العمل السابق استيعاب حبات المرتبطة الخلايا ، والتجارب الأولية مع حيدات اتفقت بشكل جيد مع عشرات أكلة (قيم iMFI) في هذا الاختبار إنتاجية عالية (لا تظهر البيانات).
الشكل 1. مراقبة جودة الفحص. 1A ، رسوم بيانية الخلوي تدفق البلعمة لعينة من الأجسام المضادة لموضوع فيروس نقص المناعة البشرية السلبية (تتبع الأسود) وموضوعا بفيروس نقص المناعة البشرية (تتبع الرمادي).1B : التصميم التجريبي من الشروط طلاء حبة الأمثل لمستضد العينة. مستضد محددة الاجسام المضادة (دائرة ، مربع) شرح البلعمة القصوى من الخرز مغطاة> 2 ميكروغرام مستضد / ميكروليتر من الخرز ، في حين أن الأجسام المضادة المكافحة (المثلث) يدل على أي نشاط البلعمة.
الشكل 2. البلعمة منحنى الاستجابة للجرعة. عينات من فيروس نقص المناعة السريرية الأضداد إيجابية (دون علاج ، والمعالجة ، واظهار السيطرة على تكاثر الفيروس في غياب العلاج المضاد للفيروس) وفيروس نقص المناعة البشرية محرك الموضوعات السلبية البلعمة من gp120 (فيروس نقص المناعة البشرية المغلف) حبات مغلفة بشكل مختلف.
الشكل 3. التطبع كفاءة. المجهري يؤكد استيعاب الأجسام المضادة opsonized الخرز (الأخضر) ، بينما غير opsonized الخرز البقاء في سولution (63x التكبير).
فيلم 1. أجري الزمن الفاصل بين الأضداد من المجهري يحركها البلعمة على مدار 14 ساعة ، ويسمح التصور من نشاط الخلايا البلعمية من THP - 1 تستخدم في فحص عالية الإنتاجية. الخرز الفلورية الخضراء هي الضد opsonized والخرز الحمراء الفلورسنت توفير الرقابة السلبية. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
Discussion
في مقايسة الموصوفة هنا يسمح عالية الإنتاجية تحليل عينات من أكلة النشاط الضد السريرية باستخدام خط خلية الوحيدات استخدمت طويلا لدراسة العمليات أكلة لوحة (10) ومقرها التدفق الخلوي الآلي. هذا الاختبار هو مفيد أكثر من غيرها في قدرتها على تميز بدقة مجموعات فرعية محددة مستضد الضد ، والسماح ليس فقط لدراسة الاختلافات في البلعمة مدفوعا أضداد محددة المرض من الموضوعات المختلفة ، ولكن أيضا دراسة خصوصيات مستضد متعددة داخل نفس الموضوع. لأن الأجسام المضادة لخلايا تجنيد المستجيب الفطرية ، بما في ذلك وحيدات الخلايا الأخرى تقديم المستضد الآثار بشدة نتيجة المرض 11-13 ، ومتغيرة تبعا بيولوجيا الهندسة الضد ، مفتش فرعية ، وارتباط بالغليكوزيل Asparagine297 في المجال التيسير 14-16 ، هذا الأسلوب يتيح لل تقييم آلية الضد الحاسمة للعمل. وعلاوة على ذلك ، لأن الأجسام المضادة ميدييتم استغلالها من قبل بعض البلعمة ated مسببات الأمراض أثناء العدوى 7،17،18 ، وهذا يبشر بالخير في مقايسة تقييم عملية من الأجسام المضادة التي تعتمد على تعزيز ، ويسلط الضوء على الطبيعة المزدوجة للبلعمة باعتبارها وقائية محتملة ، يحتمل أن تكون ضارة ، وكذلك الأضداد النشاط.
ويمكن الاستفادة من مقايسة وصف لتحليل الأجسام المضادة من العينات السريرية للسكان المريض ، ولكن أيضا من يتم تطعيمهم ، ويمكن تكييفها لاستخدام المصل بدلا من مفتش المنقى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل إفراز خلوى ردا على البلعمة من طاف والثقافة ، ويمكن تحديد تأثير FCR معينة باستخدام FCR حجب الأضداد ، والسماح ليس فقط الاختلافات في القدرة أكلة يتم تحديدها ، ولكن يشير الى المصب الأحداث ، مع إلقاء الضوء في الآلية ، ويمكن أن يساعد على حل وتحسين فهم هذه الآلية المناعية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب نود أن ننوه بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة 3R01AI080289 - 02S1 ، وجامعة هارفارد مركز باحث زمالة أبحاث الإيدز تحت المعاهد الوطنية للصحة / NIAID 2P30AI060354 - 07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
