Summary
We presenteren een high-throughput flowcytometrische analyse naar de fagocytaire activiteit van antigeen-specifieke antilichamen uit klinische monsters te bepalen, met behulp van fluorescerende antigeen-gecoate kralen en een monocytische cellijn die meerdere Fc-receptoren, die receptor gebruik en de fagocytische activiteit bepalingen in een gestandaardiseerd en reproduceerbare mode voor elk antigeen van belang.
Abstract
Antilichaam-driven fagocytose is opgewekt via de betrokkenheid van Fc-receptoren op professionele fagocyten, en kan bijdragen aan zowel de klaring als pathologie van de ziekte. Terwijl de eigenschappen van de variabele domeinen van antilichamen zijn lange tijd beschouwd als cruciaal voor in vivo-functie, heeft de mogelijkheid van antilichamen tegen aangeboren immuuncellen via hun Fc-domeinen werven steeds meer gewaardeerd als een belangrijke factor in hun effectiviteit, zowel in de setting van recombinant monoklonaal antilichaam therapie, evenals in de loop van de natuurlijke infectie of vaccinatie 1-3.
Belangrijk is dat ondanks de nomenclatuur als een constant domein, is het antilichaam Fc-domein geen constante functie, en is sterk gemoduleerd door IgG subklassen (IgG1-4) en glycosylatie op Asparagine 297 4-6. Dus, om deze methode bestuderen functionele verschillen van antigeen-specifieke antilichamen in klinische monsters zal correlatie van de fagocytische pot te vergemakkelijkentemperatuurverschil van antilichamen tegen de ziekte van de staat, vatbaarheid voor infecties, progressie, of klinische uitkomst.
Bovendien is dit effector functie is vooral belangrijk in het licht van de gedocumenteerde vermogen van antilichamen tegen infectie te verbeteren door pathogenen toegang tot gastheer cellen via Fc-receptor-driven fagocytose 7. Daarnaast is er enig bewijs dat fagocytische opname van immuuncomplexen kan de Th1/Th2 polarisatie van de immuunrespons 8 impact.
We beschrijven hier een test ontworpen om verschillen in antilichaam-geïnduceerde fagocytose, die kan worden veroorzaakt door differentiële IgG subklassen, glycan structuur aan Asn297, evenals de mogelijkheid om immuuncomplexen van antigeen-specifieke antilichamen vormen in een high-throughput manier te detecteren . Daartoe zijn een urn fluorescerende bolletjes gecoat met antigeen, vervolgens geïncubeerd met klinische antilichaammonsters, het genereren van tl-antigeen specifieke immuun-complexen. Deze antibody-opsonized parels worden vervolgens geïncubeerd met een monocytische cellijn die meerdere FcγRs, met inbegrip van zowel remmende en activeren. Test-uitgang kunnen zijn fagocytose activiteit, cytokine secretie, en patronen van FcγRs gebruik en worden bepaald in een gestandaardiseerde wijze, waardoor dit een zeer nuttig systeem voor het ontleden van de verschillen in dit antilichaam-afhankelijke effector functie in zowel de infectie en vaccin-gemedieerde bescherming 9.
Protocol
1. Cultuur fagocyterende cellen
- Cultuur THP-1-cellen 10 in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum als een stationaire suspensie in T kolven. Celdichtheid dient te worden gehandhaafd onder de 0.5x10 6 / mL om samenhangende niveaus van FcγR expressie en de bepaling te handhaven.
2. Bereid gebiotinyleerd antigeen
- Bereken de hoeveelheid sulfo-NHS LC biotine reagens set nodig om de doelstelling antigeen van belang biotinylate volgens de instructies van de fabrikant.
- Los de biotinylatie reagens in water en onmiddellijk de berekende hoeveelheid toe te voegen aan antigeen in een buffer die niet bevat primaire amines. Laat de reactie om door te gaan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, mixen af en toe.
- Verwijder overtollig, niet-geconjugeerd biotine door de buffer-uitwisseling in een Amicon centrifugale concentratie-eenheid van een geschikt molecuulgewicht cutoff naar de targe te behoudent antigeen. Voeg het monster naar de bovenste kamer van de concentratie-eenheid en voeg PBS om het totale volume tot 15 ml vullijn. Centrifugeer bij 4000 xg om het volume omlaag te brengen tot ongeveer 1,5 ml. Herhaling van dit proces twee keer zal verwijderen 99% van de vrije biotine tot de maximale coating van antigeen ervoor te zorgen dat kralen.
3. Bereid Antigen Verzadigde Beads
- Was de 100 ul van 1 mm TL neutravidin kralen twee keer in 1 ml 0,1% PBS-BSA na het stoppen met draaien in een microcentrifuge op hoge snelheid. Resuspendeer gewassen kralen in 100 pi PBS-BSA, en aliquot in 10 buizen.
- Om te bepalen antigeen coating voorwaarden die de kralen verzadigen, combineren 10 ul van de gewassen kraal ophanging met verschillende concentraties van gebiotinyleerd antigeen in twee-voudige stappen. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een microcentrifugebuis op een rotator.
LET OP: De verzadiging van de kralen proefondervindelijk te worden bepaald. Dit kan worden bereiktdoor het identificeren van kraal-coating voorwaarden dat de maximale opbrengst fagocytose wanneer beads worden vervolgens opsonized met een controle monoklonaal antilichaam.
- Verwijder de niet-gebonden antigeen door te wassen met 1 ml PBS-BSA en centrifuge op hoge snelheid tot de kralen zijn pellets. Verwijder de PBS-BSA en herhaal.
- Resuspendeer antigen gecoate kralen in een eindvolume van 1 ml in PBS-BSA. Kralen kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week bij 4 ° C vóór gebruik.
4. Bereid antilichaammonsters
- Klinische antilichaammonsters kan worden gezuiverd uit plasma met behulp van een meloen gel IgG zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Gezuiverd IgG kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
LET OP: Juiste voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de verwerking van menselijke monsters moet altijd genomen.
- Bepaal de concentratie van gezuiverde antilichamen door absorptie bij A280 en verdun monsters naar 1 mg / ml in PBS.
- Bereid ponerenIve en negatieve monoklonale antilichamen controle door verdunning tot 1 mg / ml in PBS.
5. Plating het Experiment
- Resuspendeer de gewassen, antigen verzadigde kraal bovenstaande oplossing bereid door vortexen, en overdracht 10 pi in elke well van een ronde bodem met 96 putjes plaat. Zorg moet worden genomen om voortdurend roeren de kraal schorsing gelijke aantallen fluorescerende kralen zorgen worden toegevoegd aan elk putje.
- Voeg verschillende concentraties van de antilichamen van belang aan elk putje, het creëren van een dosis-response curve voor elk antilichaam. Optimale concentraties zullen verschillen tussen de monsters afhankelijk van de titer van antilichamen aanwezig, maar een bereik van 0,01-100 ug / ml uiteindelijke concentratie zal een goede dekking te bieden en identificatie mogelijk maken van het concentratiebereik van belang. Zorg ervoor dat antilichamen worden toegevoegd in hoeveelheden niet groter dan 20 pl.
- Incubeer kralen en antilichaammonsters gedurende 2 uur bij 37 ° C zodat de antilichamen tegen de kralen opsonize. </ Li>
- Bereid een suspensie van THP-1 cellen op 2,5 x 10 5 cellen / ml, en 200 ul van deze suspensie aan elk putje toe te voegen, voor een totaal van 5 x 10 4 THP-1 cellen in elk putje.
- Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2, in een stationaire incubator, waardoor cellen en kralen om pellet via de zwaartekracht.
LET OP: Signaal-ruis kan worden verbeterd door het bepalen van de optimale kraal: antilichaam: THP-1 cel ratio's voor een bepaalde antigeen en antilichaam bron.
6. Flowcytometrische analyse
- Verwijder de 100 pi van supernatant uit elk putje en let niet naar de cel pellet te verstoren. Supernatant kan worden bespaard als cytokine secretie bepalingen of andere analyses gewenst zijn.
- Voor bevestiging, voeg 100 ul van 4% paraformaldehyde aan elk putje en pipet te resuspendeer en meng cellen.
- Hoge doorvoer flowcytometrische analyse kan worden uitgevoerd met behulp van een BD-LSR II uitgerust met een HTS-plaat lezer.
- Programma-software aan elk putje drie keer (100 pi mix volume) mix en analyseren 30 ul, of ten minste 2000 cellen evenementen, van elk monster.
- De verzamelde gegevens kunnen worden geanalyseerd in FlowJo of gelijkwaardig software. Nuttige statistieken onder meer het percentage van de kraal +, of fluorescerende cellen, die een maat voor het aantal van de fagocyterende cellen aanwezig is zorgt, evenals de fluorescentie-intensiteit van de fagocyterende cellen, die een maat voor het aantal gefagocyteerd kralen biedt. Vermenigvuldiging van deze waarden genereert een geïntegreerde betekenen fluorescentie-intensiteit, of iMFI.
- Het gemiddelde aantal van kralen gefagocyteerd door elke fagocyterende cel kan worden berekend door de iMFI door de gemiddelde fluorescentie van een kraal.
7. Representatieve resultaten
Er moet duidelijke differentiatie van antilichaammonsters van de getroffen en onaangetast onderwerpen worden. Figuur 1A toont de FACS histogrammen van een antilichaam monster van een HIV negatieftieve (zwart trace) en een HIV-positief (grijze spoor) onderwerp, en toont de verhoogde fagocytose gedreven door de aanwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen.
Optimale gevoeligheid van de test is afhankelijk van verzadiging van de kralen met gebiotinyleerd antigeen. Figuur 1B toont de fagocytose waargenomen wanneer kralen bedekt met verschillende hoeveelheden van antigeen werden opsonized met drie controle monoklonale antilichamen (met inbegrip van een niet-bindend antilichaam, driehoeken), en stelt 2μg antigeen / ul kralen als een verzadigende concentratie voor dit antigeen.
Een dosis-response curve is weergegeven in figuur 2, en toont het verschil in capaciteit van het onderwerp antilichaammonsters aan fagocytose veroorzaken meer dan een antilichaam concentratiebereik van 0,05 tot 5 ug / ml. Dit verschil fagocytose kan aangedreven worden door een van beide verschillen in de titer of Fc-domein eigenschappen, zoals IgG subklassen en glycosylatie staat.
Bij het THP-1 cellen zijn iMaged door fluorescentie microscopie, is er duidelijk bewijs van kraal fagocytose. Figuur 3 geeft twee 63x stilstaande beelden van THP-1 cellen na incubatie met antilichaam opsonized (groen) en niet-opsonized (rood) kralen, waaruit het gebrek aan fagocytische opname in de afwezigheid van antilichaam. Bij de time lapse microscopie wordt uitgevoerd, het antilichaam-specifieke fagocytische opname van fluorescerende beads is nog opvallender (Film 1, een vergroting van 20x).
Eerder werk heeft bevestigd internalisatie van de kralen in verband met de cellen, en experimenten met primaire monocyten hebben goed overeengekomen met fagocytaire score (iMFI waarden) in dit high throughput assay (gegevens niet getoond).
Figuur 1. Assay Quality Control. 1A, Flowcytometrie histogrammen van fagocytose voor een antilichaam monster van een HIV-negatieve onderwerp (zwart trace) en een HIV-positieve onderwerp (grijze spoor).1B: Experimentele bepaling van de optimale bead coating voorwaarden voor een sample antigeen. Antigeen-specifieke monoklonale antilichamen (cirkel, vierkant) aan te tonen maximale fagocytose van kralen bekleed met> 2 ug antigeen / ul van kralen, terwijl een controle antilichaam (driehoek) toont geen fagocytische activiteit.
Figuur 2. Fagocytose dosis-respons curve. Klinische antilichaam monsters van hiv-positief (behandeld, onbehandeld, en tentoonstellen controle van virale replicatie in de afwezigheid van anti-retrovirale therapie) en HIV-negatieve personen rijden fagocytose van gp120 (HIV enveloppe) gecoate kralen differentieel.
Figuur 3. Efficiënt Internalisatie. Microscopie bevestigt de internalisatie van antilichaam-opsonized kralen (groen), terwijl de niet-opsonized kralen blijven in solution (63x vergroting).
Film 1. Time-lapse microscopie van antilichaam-driven fagocytose werd uitgevoerd in de loop van 14 uur en maakt visualisatie van de fagocytische activiteit van de THP-1 cellen gebruikt in de high-throughput assay. Groen fluorescerende kralen antilichamen opsonized, rode fluorescente kralen zorgen voor een negatieve controle. Klik hier om de film te bekijken.
Discussion
De test die hier beschreven staat high-throughput analyse van de fagocytische activiteit van klinische antilichaammonsters door gebruik te maken van een monocytische cellijn lang gebruikt om fagocytische processen 10 en de plaat op basis van geautomatiseerde flowcytometrie te bestuderen. Deze test is gunstig ten opzichte van andere in zijn vermogen om precies te karakteriseren antigeen-specifiek antilichaam subgroepen, waardoor niet alleen voor de studie van de verschillen in de fagocytose gedreven door de ziekte-specifieke antilichamen van verschillende onderwerpen, maar ook studie van meerdere antigeen specificiteiten binnen hetzelfde onderwerp. Vanwege antilichaam rekrutering van aangeboren effector-cellen, met inbegrip van monocyten en andere antigeen presenterende cellen sterk gevolgen de ziekte uitkomst 11-13, en is biologisch met variabele geometrie afhankelijk van antistoffen, IgG subklassen, en glycosylatie bij Asparagine297 van de Fc-domein 14-16, deze methode voorziet in evaluatie van een kritische antilichaam werkingsmechanisme. Bovendien, omdat antilichaam-mediated fagocytose wordt geëxploiteerd door een aantal ziektekiemen in de loop van de infectie 7,17,18, deze test houdt belofte in de evaluatie van het proces van antilichaam-afhankelijke versterking, en wijst op het duale karakter van fagocytose als een potentieel beschermende, maar ook als potentieel schadelijk antilichaam activiteit.
De beschreven test kan worden gebruikt om antilichamen te analyseren uit klinische monsters van patiëntenpopulaties, maar ook van de gevaccineerden, en kunnen worden aangepast om gebruik te maken serum in plaats van gezuiverd IgG. Daarnaast kan cytokine secretie als respons op fagocytose worden geanalyseerd van de cultuur supernatant, en de invloed van specifieke FcR kan bepaald worden door gebruik te maken FcR-blokkerende antilichamen, waardoor niet alleen de verschillen in fagocyterende potentie te bepalen, maar stroomafwaarts signalering evenementen, met inzicht in mechanisme en kan helpen op te lossen en te verfijnen begrip van deze immuun mechanisme.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs financiering wensen te erkennen van de NIH 3R01AI080289-02S1, en een Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship onder NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
