Summary
Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.
Abstract
Antikörper-driven Phagozytose über das Engagement von Fc-Rezeptoren auf professionelle Phagozyten induziert und kann sowohl Freiraum als auch Pathologie der Krankheit beitragen. Während die Eigenschaften der variablen Domänen von Antikörpern lange gegolten haben entscheidend für in vivo-Funktion hat die Fähigkeit von Antikörpern, angeborene Immunsystem-Zellen über ihre Fc-Domänen rekrutieren zunehmend geschätzt als ein wichtiger Faktor in ihrer Wirksamkeit, sowohl in der Einstellung des rekombinanten Therapie mit monoklonalen Antikörpern, sowie im Zuge der natürlichen Infektion oder Impfung 1-3.
Wichtig ist, dass trotz seiner Nomenklatur als eine konstante Domäne, wird die Antikörper-Fc-Domäne nicht konstante Funktion, und ist stark moduliert durch IgG-Subklassen (IgG1-4) und Glycosylierung an Asparagin 297 4-6. So, diese Methode zu studieren funktionelle Unterschiede von Antigen-spezifischen Antikörpern in klinischen Proben wird Korrelation der phagocytic Topf erleichternential von Antikörpern gegen Krankheitszustand, Infektanfälligkeit, Progression oder klinische Ergebnis.
Darüber hinaus ist dieser Effektor-Funktion besonders wichtig im Hinblick auf den dokumentierten Fähigkeit von Antikörpern gegen Infektionen durch Erreger Zugang in die Wirtszellen via Fc-Rezeptor-driven Phagozytose 7 zu erhöhen. Darüber hinaus gibt es einige Hinweise, dass Phagozytose von Immunkomplexen können die Th1/Th2 Polarisierung der Immunantwort 8 Auswirkungen.
Hier beschreiben wir einen Test entwickelt, um Unterschiede in der Antikörper-induzierte Phagozytose, die durch unterschiedliche IgG Unterklasse Glykanstruktur bei Asn297 sowie die Fähigkeit, Immunkomplexe von Antigen-spezifischen Antikörpern in einem High-Throughput-fashion Form verursacht werden können, erkennen . Zu diesem Zweck sind 1 um fluoreszierende Kügelchen mit Antigen beschichtet und dann mit klinischen Proben Antikörper inkubiert, erzeugen fluoreszierendes Antigen-spezifische Immunkomplexe. Diese Antikörperndy-opsonierten Kügelchen werden dann mit einer Monozyten-Zelllinie, die mehrere FcγRs, darunter sowohl hemmende und aktivierende inkubiert. Assay-Ausgang kann auch Phagozytoseaktivität, Zytokinsekretion und Muster der FcγRs Nutzung, und in einer standardisierten Art und Weise bestimmt, so dass dies ein sehr nützliches System für das Parsen von Differenzen in dieser Antikörper-abhängigen Effektor-Funktion in beide Infektion und Impfung vermittelte Schutz 9.
Protocol
1. Kultur Phagozytenzellen
- Kultur THP-1 Zellen 10 in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum als stationäre Suspension in T-Kolben ergänzt. Die Zelldichte sollte unter 0.5x10 6 / mL gehalten werden, um ein einheitliches Niveau des FcyR Ausdruck und Assay-Leistung aufrecht zu erhalten.
2. Bereiten biotinylierten Antigen
- Berechnen Sie den Betrag von Sulfo-NHS-LC Biotin Reagenzienkit notwendig, um das Ziel-Antigen von Interesse nach den Anweisungen des Herstellers Biotinylierung.
- Lösen Sie die Biotinylierungsreagenz in Wasser und sofort die berechnete Menge an Antigen in einem Puffer, der keine primären Amine. Lassen Sie die Reaktion für 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen, Mischen gelegentlich.
- Entfernen Sie das überschüssige, nicht konjugierte Biotin durch Puffer Austausch in einer Amicon Zentrifugalkraft Konzentration Einheit eines geeigneten Molekulargewichtsschnitt die targe behaltent-Antigen. Probe in die obere Kammer des Konzentrationslagers Einheit und fügen PBS auf das Gesamtvolumen von bis zu 15 mL füllen Einklang zu bringen. Zentrifuge bei 4000 xg, um die Lautstärke zu senken, um etwa 1,5 mls. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal löscht 99% der freien Biotin, um eine maximale Beschichtung von Antigen, um Perlen zu sichern.
3. Bereiten Antigen Gesättigte Beads
- Wash 100 ul 1 mm fluoreszierende Neutravidin Perlen zweimal in 1 ml 0,1% PBS-BSA nach dem Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit. Resuspendieren gewaschenen Beads in 100 ul PBS-BSA und Aliquot in 10 Röhren.
- Um zu bestimmen, Antigen-Beschichtung Bedingungen, die die Perlen zu sättigen, kombinieren 10 ul der gewaschenen Bead-Suspension mit variierenden Konzentrationen von biotinylierten Antigen in zweifacher Schritte. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Rotator.
HINWEIS: Die Sättigung der Perlen muss experimentell ermittelt werden. Dies kann erreicht werden,durch die Identifizierung Bead-Beschichtung Bedingungen, die eine maximale Ausbeute bei Phagozytose Perlen anschließend mit einer Kontrollgruppe monoklonaler Antikörper opsonierten sind.
- Entfernen ungebundenen Antigen durch Waschen mit 1 ml PBS-BSA und Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, bis Kügelchen pelletiert werden. Entfernen Sie PBS-BSA und wiederholen.
- Resuspendieren Antigen-beschichteten Kügelchen in einem Endvolumen von 1 ml in PBS-BSA. Beads können gespeichert werden bis zu einer Woche bei 4 ° C vor dem Gebrauch.
4. Bereiten Antikörper Proben
- Klinische Antikörper Proben aus dem Plasma mit einer Melone Gel IgG Reinigungskit nach Herstellerangaben gereinigt werden. Gereinigtes IgG bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
HINWEIS: Das richtige Vorsichtsmaßnahmen hinsichtlich der Umgang mit menschlichen Proben müssen immer getroffen.
- Bestimmen Sie die Konzentration der gereinigten Antikörper durch Absorption bei A280 und verdünnte Proben auf 1 mg / ml in PBS.
- Bereiten Sie postulierenive und negative monoklonalen Kontroll-Antikörper durch Verdünnen auf 1 mg / ml in PBS.
5. Plating das Experiment
- Resuspendieren gewaschen, Antigen gesättigt Beadlösung oben durch Vortexen vorbereitet und Transfer 10 ul in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. Es muss darauf geachtet, ständig rühren die Bead-Suspension zu gleichen Teilen aus fluoreszierende Kügelchen zu gewährleisten sind in jede Vertiefung gegeben.
- Add unterschiedlichen Konzentrationen der Antikörper von Interesse in jede Vertiefung, die Schaffung eines Dosis-Wirkungs-Kurve für jeden Antikörper. Optimale Konzentrationen zwischen den Proben in Abhängigkeit von der Titer der Antikörper vorhanden unterscheiden, aber eine Reihe von 0,01 bis 100 pg / ml Endkonzentration wird eine gute Abdeckung bieten und die Identifikation der interessierenden Konzentrationsbereich. Stellen Sie sicher, Antikörper werden in Mengen nicht größer als 20 ul aufgenommen.
- Inkubieren Perlen und Antikörper-Proben für 2 Stunden bei 37 ° C, damit der Antikörper an die Beads opsonisieren. </ Li>
- Eine Suspension von THP-1 Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml, und 200 ul dieser Suspension in jede Vertiefung, für eine Gesamtmenge von 5 x 10 4 THP-1 Zellen in jedem Well.
- Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2, in einer stationären Inkubator, so dass Zellen und Perlen Pellets durch Schwerkraft.
HINWEIS: Signal-Rausch kann durch die Bestimmung der optimalen Sicke verbessert werden: Antikörper: THP-1 Zellen Verhältnisse für ein bestimmtes Antigen und Antikörper Quelle.
6. Durchflusszytometrische Analyse
- Nehmen Sie 100 ul des Überstands aus jeder Vertiefung darauf achten, daß das Zellpellet zu stören. Überstand kann dann gespeichert, wenn Zytokinsekretion Bestimmungen oder anderen Analysen erwünscht sind.
- Zur Fixierung wird mit 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und Pipette resuspendieren und mischen Zellen.
- Hoher Durchsatz durchflusszytometrische Analyse kann unter Verwendung eines BD LSR II mit einem HTS-Reader ausgestattet werden.
- Program-Software zu mischen jedes Well dreimal (100 ul Mix Volumen) und analysieren 30 mu l oder mindestens 2000 Zellen Veranstaltungen jeder Probe.
- Die gesammelten Daten können in FlowJo oder gleichwertige Software analysiert werden. Nützliche Metriken sind die Prozent der Perle + oder fluoreszierende Zellen, die ein Maß für die Anzahl der Phagozytenzellen Gegenwart bietet, ebenso wie die Fluoreszenz-Intensität des Phagozytenzellen, die ein Maß für die Anzahl der phagozytiert Perlen bietet. Multipliziert man diese Werte erzeugt eine integrierte bedeuten Fluoreszenzintensität oder iMFI.
- Die durchschnittliche Zahl der Kugeln von jeder Fresszellen phagozytiert können, indem die iMFI durch die mittlere Fluoreszenz von 1 Perle berechnet werden.
7. Repräsentative Ergebnisse
Es sollten klare Differenzierung von Antikörper-Proben aus betroffenen und nicht betroffenen Probanden werden. Abbildung 1A zeigt die FACS-Histogramme eines Antikörpers Probe von einem HIV negativInitiative (schwarze Kurve) und eine HIV-positive (graue Kurve) unterliegen, und zeigt die erhöhte Phagozytose durch die Anwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern angetrieben.
Optimale Sensitivität des Tests ist abhängig von der Sättigung der Beads mit biotinylierten Antigen. Abbildung 1B zeigt die Phagozytose beobachtet, wenn Kugeln mit unterschiedlichen Mengen an Antigen beschichtet mit 3 Kontrolle monoklonalen Antikörpern (einschließlich einer unverbindlichen Antikörper, Dreiecke) opsonierten wurden, und stellt 2μg Antigen / ul Perlen als Sättigungskonzentration für dieses Antigen.
Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist in Abbildung 2 dargestellt und zeigt die Differenz Kapazität von Subjekt Antikörper Proben Phagozytose über einen Antikörper Konzentrationsbereich von 0,05-5 g / ml induzieren. Diese Differenz Phagozytose kann entweder durch Unterschiede in der Titer oder Fc-Domäne Eigenschaften wie IgG-Subklassen und Glykosylierung Zustand getrieben werden.
Als THP-1 Zellen sind iMaged durch Fluoreszenz-Mikroskopie, gibt es eindeutige Beweise für bead Phagozytose. Abbildung 3 zeigt zwei 63x Standbilder von THP-1 Zellen nach Inkubation mit dem Antikörper opsonierten (grün) und nicht-opsonierten (red) Kugeln, was die fehlende Phagozytose in Abwesenheit des Antikörpers. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie durchgeführt wird, ist der Antikörper-spezifische Phagozytose von fluoreszierenden Kügelchen noch auffälliger (Movie 1, 20-facher Vergrößerung).
Frühere Arbeiten haben Internalisierung der Perlen mit den Zellen verbunden bestätigt, und Experimente mit primären Monozyten haben gut mit phagocytic Scores (iMFI Werte) in diesem hohen Durchsatz-Test (Daten nicht gezeigt) vereinbart.
Abbildung 1. Assay Quality Control. 1A, Durchflusszytometrie Histogramme der Phagozytose für einen Antikörper Stichprobe aus einer HIV-negativ Thema (schwarze Kurve) und eine HIV-positive Subjekt (graue Kurve).1B: Experimentelle Bestimmung der optimalen Wulstbeschichtung Bedingungen für eine Probe-Antigen. Antigen-spezifische monoklonale Antikörper (Kreis, Quadrat) zu demonstrieren maximal Phagozytose von Kügelchen, die mit> 2 pg Antigen / ul von Perlen beschichtet, während ein Kontroll-Antikörper (Dreieck) zeigt keine Phagozytoseaktivität.
Abbildung 2. Phagozytose Dosis-Wirkungs-Kurve. Klinische Antikörper Proben von HIV-positiven (behandelt, unbehandelt, und Ausstellen Kontrolle der Virusreplikation in Abwesenheit von anti-retroviralen Therapie) und HIV-negativen Probanden Laufwerk Phagozytose von gp120 (HIV-Envelope) Kügelchen unterschiedlich.
Abbildung 3. Effiziente Internalisierung. Mikroskopie bestätigt die Internalisierung der Antikörper-opsonierten Perlen (grün), während die Nicht-opsonierten Perlen in sol bleibenution (63x Vergrößerung).
Movie 1. Zeitraffer-Mikroskopie von Antikörper-driven Phagozytose wurde im Laufe von 14 Stunden durchgeführt und erlaubt die Visualisierung der Phagozytoseaktivität der THP-1 Zellen in der High-Throughput-Assay verwendet. Grün fluoreszierende Kügelchen sind Antikörper opsonierten bieten rot fluoreszierende Kügelchen eine negative Kontrolle. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.
Discussion
Der Test hier beschriebenen ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse der Phagozytoseaktivität von klinischen Proben Antikörper durch die Verwendung einer monozytären Zelllinie lange genutzt werden, um phagocytic Prozesse 10 und Platte für automatisierte Durchflusszytometrie zu studieren. Dieser Assay ist vorteilhaft gegenüber anderen in seiner Fähigkeit, präzise zu charakterisieren Antigen-spezifischen Antikörper Teilmengen, so dass nicht nur für die Untersuchung von Unterschieden in Phagozytose durch krankheits-spezifischen Antikörpern aus verschiedenen Fächern angetrieben, sondern auch Studie mehrerer Antigenspezifitäten innerhalb der gleichen Thema. Da Antikörper Rekrutierung von angeborenen Effektor-Zellen, einschließlich Monozyten und anderen Antigen-präsentierenden Zellen einen starken Einfluss Krankheitsverlauf 11-13, und ist biologisch variabel je Antikörper Geometrie, IgG-Subklassen und Glycosylierung an Asparagine297 der Fc-Domäne 14-16, bietet diese Methode für Auswertung einer kritischen Antikörper Wirkmechanismus. Darüber hinaus, weil Antikörper-vermittelteEINZELNEN SEKTOREN Phagozytose durch bestimmte Erreger ist im Verlauf der Infektion 7,17,18 ausgenutzt, hält diesen Test Versprechen bei der Bewertung des Prozesses der Antikörper-abhängigen Verstärkung, und unterstreicht die duale Natur der Phagozytose als potenziell schützende, sowie potenziell schädliche Antikörper-Aktivität.
Der beschriebene Assay genutzt werden, um Antikörper, die aus klinischen Proben von Patientengruppen zu analysieren, sondern auch der Impflinge und kann angepasst zu nutzen Serum als gereinigtes IgG werden. Darüber hinaus können Zytokinsekretion in Reaktion auf die Phagozytose aus dem Kulturüberstand analysiert werden, und der Einfluss der spezifischen FcR kann durch die Verwendung FcR-blockierende Antikörper, so dass nicht nur Unterschiede in phagocytic Potenz zu bestimmen bestimmt werden, sondern nachgeschalteten Signalwege, mit Einblick in-Mechanismus, können und helfen zu lösen und zu verfeinern Verständnis dieses Immunsystems.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Finanzierung von NIH 3R01AI080289-02S1, und ein Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship unter NIH / NIAID 2P30AI060354-07 bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
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