Summary
우리는 - 수용체 제공 여러 FC의 표현 형광 항원 코팅 구슬과 monocytic 세포 라인을 활용하여 표준의 수용체 사용량과 phagocytic 활동 결정하고, 임상 샘플에서 항원에 특정한 항체의 phagocytic 활동을 결정하기 위해 높은 처리량 흐름 cytometric 분석을 제시 관심의 항원에 대한 재현할 패션.
Abstract
항체 기반의 phagocytosis는 전문 phagocytes에서 FC 수용체의 참여를 통해 유도하고, 질병의 모두 허가뿐만 아니라 병리에 기여할 수 있습니다. 항체의 변수 도메인의 속성이 긴 생체내 기능에 치명적인 것으로 간주되고있는 반면, 그들의 FC 도메인을 통해 타고난 면역 세포를 모집 항체의 능력은 모두 재조합의 설정에서, 그들의 효험의 주요 요소로 점점 더 높이 평가되고있다 단클론 항체 치료뿐만 아니라, 자연 감염이나 예방 접종 1-3의 과정 인치
중요한 것은 지속적인 도메인으로의 명칭에도 불구하고, 항체 FC 도메인 일정 기능을 가지고 있고, IgG의 하위 클래스 (IgG1 - 4) 및 아스파라긴에서 글리코 실화 297 4-6로 강하게 변조되지 않습니다. 따라서,이 방법은 phagocytic 냄비의 상관 관계를 촉진합니다 임상 샘플에서 항원 - 항체 특정의 기능 차이를 연구하기질병 상태, 감염에 자화율, 진행, 또는 임상 결과에 항체의 ential.
또한,이 이펙터 기능 FC 수용체 중심의 phagocytosis 7을 통해 호스트 세포에 병원균에 대한 액세스를 제공하여 감염을 향상시키기 위해 항체의 문서화 능력에 비추어 특히 중요합니다. 또한, 면역 단지의 phagocytic 이해가 면역 반응 8 Th1/Th2 분극에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 증거가있다.
여기, 우리는 차동 IgG의 하위 클래스, Asn297에서 glycan 구조뿐만 아니라, 높은 처리량 방식으로 항원 특정 항체의 면역 단지를 형성하는 능력으로 인해 발생할 수 있습니다 항체 유발 phagocytosis의 차이를 감지하기위한 분석을 설명 . 이를 위해, 1 μm의 형광 구슬은 다음 형광 항원 특정 면역 단지를 생성, 임상 항체 샘플 incubated, 항원과 코팅입니다. 이 antibo다이 - opsonized 구슬은 다음 억제와 활성화 모두를 포함하여 여러 FcγRs을 표현 monocytic 세포 라인 incubated 있습니다. 분석 출력 phagocytic 활동, 시토킨 분비 및 FcγRs 사용량 패턴을 포함할 수 있으며,이 감염 및 백신 - 중재 보호 구 모두에서이 항체 의존 이펙터 함수의 해석 차이에 대한 높은 유용한 시스템을 만들고, 표준 방식으로 결정됩니다.
Protocol
1. 문화 Phagocytic 셀
- 문화 THP - 1 RPMI 1640에서 10 세포는 T의 flasks에 고정 중지 10 % 태아 소 혈청과 보충. 세포 밀도가 FcγR 표현 및 분석 성능을 일관된 수준을 유지하기 위해서는 0.5x10 6 / ML 아래에 유지되어야합니다.
2. Biotinylated 항원을 준비
- 제조 업체의 지시에 따라 관심의 대상 항원을 biotinylate에 필요한 sulfo - 보건국 LC 비오틴 시약 키트의 양을 계산합니다.
- 물에 biotinylation 시약을 용해하고 즉시 기본 아민을 포함하지 않는 버퍼에 항원으로 계산된 금액을 추가합니다. 반응이 때때로 혼합, 상온에서 1 시간 동안 진행하실 수 있습니다.
- targe을 유지하기 위해 적절한 분자량의 컷오프의 Amicon 원심 농도 단위로 버퍼 교환에 의한 초과, unconjugated 비오틴을 제거t의 항원. 농도 단위의 상단 챔버에 샘플을 추가하고 최대 15 ML 채우기 라인에 전체 볼륨을 가지고 PBS를 추가합니다. 약 1.5 MLS에 볼륨을 가지고 4000 XG에 원심 분리기. 이 과정을 반복하면 두 번 구슬로 항원의 최대한의 코팅을 보장하기 위해 무료 비오틴의 99 %를 제거합니다.
3. 항원 포화 비즈 준비
- 두 번 1 1mm 형광 neutravidin 비즈 100 μl를 씻으 ML 0.1 % PBS - BSA 고속 microcentrifuge 아래로 회전 후. Resuspend 10 튜브에 100 μl PBS - BSA, 그리고 나누어지는의 구슬을 빨기도 했죠.
- 구슬을 포화 항원 코팅 조건을 확인하려면, 두 배 단계에 biotinylated 항원의 농도 변화로 씻은 비드 정지 10 UL을 결합. 회전에 microcentrifuge 튜브 4 ° C에서 밤새 품어.
참고 : 구슬의 채도가 실험적으로 결정되어야합니다. 이 수행할 수 있습니다구슬은 이후 컨트롤 단클론 항체와 opsonized 때 최대한의 phagocytosis를 얻을 비드 코팅 조건을 식별하여.
- 구슬이 pelleted 때까지 고속 1 ML PBS - BSA와 원심 분리기로 세척하여 언바운드 항원을 제거합니다. PBS - BSA를 제거하고 반복합니다.
- PBS - BSA 1 ML의 최종 볼륨 Resuspend 항원 코팅 비즈. 비즈는 4 ° C 이전에 사용시 일주일에 저장할 수 있습니다.
4. 항체 샘플을 준비
- 임상 항체 샘플 플라즈마는 제조 업체의 지침에 따라 멜론 젤 IgG 정화 키트를 사용하여 정화 수 있습니다. 정화 IgG는 4 ° C 사용을위한 준비까지 저장할 수 있습니다.
참고 : 인간의 샘플을 처리에 대한 적절한 예방 조치는 항상 촬영되어 있어야합니다.
- A280의 흡광도에 의한 항체를 정화의 농도를 결정하고, PBS 1 MG / ML에 샘플을 희석.
- 멋부리다 준비1 MG / PBS에서 ML에 희석하여 필자와 부정적인 단클론 항체 제어.
5. 실험을 도금
- vortexing에 의해 위에 준비한 씻어, 항원 포화 비드 솔루션을 Resuspend, 그리고 둥근 바닥 96 잘 플레이트의 각 우물에 10 μl를 전송합니다. 관리는 각 잘에 추가됩니다 지속적으로 형광 구슬의 같은 번호를 보장하기 위해 비드 중단을 선동로 이동합니다.
- 각 항체에 대한 투여 - 반응 곡선을 만들고, 각 잘 관심 항체의 농도 변화에 추가합니다. 최적의 농도는 현재 항체의 titer에 따라 샘플을 사이에 다를 것이지만 0.01-100 μg / ML 최종 농도의 범위는 좋은 혜택을 제공하고 관심의 농도 범위의 신분을하실 수 있습니다. 확인 항체는 20 μl 이하 큰 볼륨에 추가되었습니다.
- 37에서 2 시간 동안 품어 구슬과 항체 샘플 ° C 항체가 구슬을 opsonize 수 있도록. </ 리>
- 2.5 × 10 5 세포 / ML에서 THP - 1 세포 현탁액을 준비, 5 X의 총 각 잘이 정지 200 μl를 추가 10 4 THP - 1 각 우물에 세포.
- 37 밤새 품어 ° C 5 % 고정 인큐베이터에서 CO 2, 중력을 통해 펠렛 수 있도록 세포와 구슬.
참고 : 노이즈에 신호가 최적의 비드를 결정하여 향상시킬 수 있습니다 항체 : THP - 1 주어진 항원과 항체 소스에 대한 세포 비율.
6. 흐름 Cytometric 분석
- 각각 잘 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의되는 뜨는 100 μl를 제거합니다. 시토킨 분비의 결정이나 다른 분석이 필요한 경우에는 뜨는을 저장할 수 있습니다.
- 고정 들면, 세포를 resuspend과 섞어 각 잘하고 pipet에 4 % paraformaldehyde 100 μl를 추가합니다.
- 높은 처리량의 흐름 cytometric 분석 HTS 플레이트 리더를 갖춘 BD LSR II를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 프로그램 소프트웨어를 각각 잘 세 번 (100 μl 믹스 볼륨)를 혼합하고 각 시료 30 μl, 또는 적어도 2,000 셀 이벤트를 분석합니다.
- 데이터 수집은 FlowJo 또는 이와 동등한 소프트웨어의 분석하실 수 있습니다. 유용한 통계는 비드 +의 퍼센트, 또는 형광 세포, 현재 phagocytic 세포의 수를 측정을 제공뿐만 아니라 phagocytosed 구슬의 수를 측정을 제공하는 phagocytic 세포의 형광 강도를 포함합니다. 이러한 값을 곱한 것은 통합된 의미 형광 강도, 또는 iMFI를 생성합니다.
- 각 phagocytic 세포에 의해 phagocytosed 구슬의 평균 개수는 1 비드의 평균 형광하여 iMFI를 나누어 계산하실 수 있습니다.
7. 대표 결과
영향 및 영향을받지 과목에서 항체 샘플 명확한 차별이 있어야합니다. 그림 1A는 HIV nega에서 항체 샘플의 FACS histograms를 제공합니다tive (블랙 추적)와 HIV 양성 (회색 추적) 주제하고 항원에 특정한 항체의 존재에 의해 주도 증가 phagocytosis를 보여줍니다.
분석의 최적 감도 biotinylated 항원과 비즈의 채도에 따라 좌우됩니다. 그림 1B는 항원의 다양한 양의 코팅 구슬이 (구속력 항체, 삼각형 등) 3 제어 단클론 항체와 opsonized 때 관찰 phagocytosis을 제시,이 항원에 대한 포화 농도로 2μg 항원 / μl 구슬을 설정합니다.
선량 - 반응 곡선은 그림 2에 제시하고, 0.05-5 μg / ML의 항체 농도 범위 phagocytosis를 유도에 따라 항체 샘플 차등 용량을 보여줍니다. 이 차동 phagocytosis는 titer 또는 IgG의 하위 클래스와 글리코 실화 상태로 FC 도메인 속성의 차이에 의해 구동 수 있습니다.
THP - 1 세포가 나는 경우maged은 형광 현미경으로 비드 phagocytosis의 명백한 증거가있다. 그림 3은 항체의 부재에 phagocytic 이해의 부족을 보여주는, 항체 opsonized (녹색) 및 비 opsonized (적색) 구슬과 부화 후에도 THP - 1 세포의 이미지 두 63x를 제공합니다. 시간 경과 현미경을 수행할 때, 형광 구슬의 항체 특정 phagocytic 이해는 (영화 1, 20x 배율) 훨씬 더 강렬합니다.
이전 작품은 세포와 관련된 구슬의 내면화를 확인하고, 기본 monocytes와 실험이 높은 처리량 분석 (데이터가 표시되지 않음)에서 phagocytic 점수 (iMFI 값)과 잘 합의했다.
그림 1. 분석 품질 관리. 1A, HIV 부정적인 주제 (블랙 추적)와 HIV 양성 과목 (회색 추적)에서 항체 샘플에 대한 phagocytosis의 유동세포계측법의 histograms.1B : 샘플 항원에 대한 최적의 비드 코팅 조건의 실험적 결정. 제어 항체 (삼각형)이 더 phagocytic 활동을 보여주는없는 동안 항원 특정 단클론 항체 (원형, 사각형)는,> 2 μg 항원 / 구슬 μl로 코팅 구슬의 최대한의 phagocytosis를 보여줍니다.
그림 2. Phagocytosis 투여량 - 반응 곡선. differentially HIV 양성 (처리, 치료, 및 안티 retroviral 치료의 부재에서 바이러스 복제를 제어할 전시)와 gp120의 HIV 부정적인 과목 드라이브 phagocytosis (HIV 봉투) 코팅 비즈에서 임상 항체 샘플.
그림 3. 효율적인 국제화. 비 opsonized 구슬이 솔에 남아있는 동안 현미경은 항체 - opsonized 비즈 (녹색)의 국제화를 확인ution (63x 배율).
영화 1. 항체 주도 phagocytosis의 시간 경과 현미경은 높은 처리량 분석에 활용 THP - 1 세포의 phagocytic 활동의 시각화 14 시간 코스 이상을 수행하고 있습니다되었습니다. 녹색 형광 구슬이 항체 opsonized 있으며, 빨간색 형광 구슬은 부정적인 컨트롤을 제공합니다. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
검정 여기에서 설명한 오래 phagocytic 프로세스 10 판을 기반으로 자동 유동세포계측법 연구를 이용 monocytic 셀 라인을 이용하여 임상 항체 샘플의 phagocytic 활동의 높은 처리량 분석을 수 있습니다. 이 분석뿐만 아니라 다른 주제에서 질병 특정 항체에 의해 주도 phagocytosis의 차이 연구 있도록 정확하게 항원 특정 항체 하위 집합을 특성화하기 위해 능력 넘을 유익뿐만 아니라 동일한 주제 내에서 여러 항원 specificities의 연구. monocytes와 다른 항원 제시 세포를 포함하여 본래 효과기 세포의 항체 모집 강하게 질병 결과 11-13 영향을, 그리고 FC 도메인 14-16의 Asparagine297에서 항체 기하학, IgG의 하위 클래스, 그리고 글리코 실화에 따라 생물 학적 변수이기 때문에,이 방법에 대한 제공 행동의 중요한 항체 메커니즘 평가. 또한, 항체 - 메디 때문에ated phagocytosis가 감염 7,17,18 과정 중에 몇 가지 병원균에 의해 악용,이 분석은 항체에 의존 향상 과정의 평가에 약속을 보유하고, 잠재적으로 보호뿐만 아니라, 잠재적으로 해로운로 phagocytosis의 이중 성격을 강조 항체 활동.
설명한 분석은 환자 인구의 임상 샘플에서 항체를 분석 활용뿐만 아니라 vaccinees, 그리고 오히려 정화 IgG보다 혈청 활용 적응 수 있습니다. 또한, phagocytosis에 대한 응답으로 시토킨 분비는 문화 뜨는에서 분석 수 있으며, 특정 FcR의 영향은 결정 phagocytic 힘뿐만 아니라 차이를 수 있도록 FcR 차단 항체를 사용하여 결정 될 수 있지만, 하류 통찰력과 이벤트를 신호 메커니즘으로,이 면역 메커니즘의 이해를 해결하고 수정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 NIH 3R01AI080289 - 02S1, 그리고 NIH / NIAID 2P30AI060354 - 07에 따라 에이즈 연구 학술 반지 원정대 하버드 대학교 센터에서 자금을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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