Summary
Vi presenterar en hög genomströmning flödescytometrisk analys för att bestämma fagocyterande förmåga av antigen-specifika antikroppar från kliniska prover, använder fluorescerande antigen-belagda pärlor och en monocytic cellinje som uttrycker flera Fc receptorer som tillhandahåller receptor användning och fagocytos bestämningar aktivitet på ett standardiserat och reproducerbar mode för alla antigen av intresse.
Abstract
Antikropp-driven fagocytos induceras via engagemang Fc receptorer på professionella fagocyter och kan bidra till både clearance och patologi sjukdom. Medan egenskaper av den rörliga domäner av antikroppar har länge ansetts vara avgörande för in vivo-funktionen, har förmågan av antikroppar att rekrytera medfödda immunceller via deras Fc-domäner blivit alltmer uppskattad som en viktig faktor för deras effektivitet, både i fastställandet av rekombinanta monoklonal antikropp terapi, liksom under naturlig infektion eller vaccination 1-3.
Viktigare, trots sin nomenklatur som en konstant domän har antikroppen Fc-domänen inte konstant funktion, och är starkt moduleras av IgG-subklass (IgG1-4) och glykosylering på asparagin 297 4-6. Således, för att denna metod studera funktionella skillnader av antigen-specifika antikroppar i kliniska prover kommer att underlätta korrelation av fagocytiska pottenential av antikroppar mot sjukdomen staten, infektionskänslighet, progression, eller kliniska resultat.
Dessutom är detta effektor funktion särskilt viktigt mot bakgrund av de dokumenterade förmåga antikroppar för att öka infektion genom att ge patogener tillgång i värdceller via Fc-receptorn driven fagocytos 7. Dessutom finns det vissa belägg för att fagocytos upptag av immunkomplex kan påverka Th1/Th2 polariseringen av immunsvaret 8.
Här beskriver vi ett test för att upptäcka skillnader i antikroppsinducerad fagocytos, vilket kan orsakas av differentiell IgG-subklass, glycan struktur på Asn297, liksom förmågan att bilda immunkomplex av antigen-specifika antikroppar i en hög genomströmning mode . För detta ändamål är 1 mikrometer fluorescerande pärlor belagda med antigen, inkuberas sedan med kliniska antikropp prover, genererar fluorescerande antigen specifika immunkomplex. Dessa antibody-opsonized pärlor inkuberas därefter med en monocytic cellinje som uttrycker flera FcγRs, både hämmande och aktiverande. Assay utgång kan innehålla fagocyterande förmåga, cytokin sekretion, och mönster för FcγRs användning, och avgörs på ett standardiserat sätt, vilket gör detta ett mycket användbart system för att analysera skillnader i detta antikroppsberoende effektor funktion i både infektioner och vaccin-medierade skydd 9.
Protocol
1. Kultur fagocytfunktionen
- Kultur THP-1 celler 10 i RPMI 1640 kompletterad med 10% fetalt bovint serum som en stationär suspension i T kolvar. Celltäthet skall hållas under 0.5x10 6 / ml för att upprätthålla konsekvent nivåer av FcγR uttryck och bestämning.
2. Förbered biotinylerad Antigen
- Beräkna mängden sulfo-NHS-LC biotin REAGENSFÖRPACKNINGEN nödvändigt att biotinylate målet antigen av intresse enligt tillverkarens anvisningar.
- Lös biotinylation reagens i vatten och omedelbart lägga till det beräknade beloppet till antigen i en buffert som inte innehåller primära aminer. Låt reaktionen fortsätta i 1 timme i rumstemperatur, blandning ibland.
- Ta bort överflödig, okonjugerat biotin av buffert utbyte i ett Amicon centrifugala koncentration enhet av en lämplig molekylvikt cutoff att behålla siktaT-antigen. Lägg prov till den övre kammaren av koncentrationen enheten och lägga till PBS för att få den totala volymen upp till 15 ml fylla linje. Centrifugera vid 4000 xg för att få ner volymen till ca 1,5 MLS. Upprepa denna process två gånger kommer att ta bort 99% av den fria biotin för att säkerställa maximal beläggning av antigener som pärlor.
3. Förbered Antigen Mättade Pärlor
- Tvätta 100 ìl av 1 mm lysrör neutravidin pärlor två gånger i 1 ml 0,1% PBS-BSA efter spinning i en mikrocentrifug i hög hastighet. Återsuspendera tvättas pärlor i 100 l PBS-BSA, och uppmätt till 10 rör.
- För att fastställa villkor antigen beläggning som mätta pärlor, kombinera 10 ul av tvättade pärla fjädring med olika koncentrationer av biotinylerad antigen i dubbel steg. Inkubera över natten vid 4 ° C i en mikrocentrifugrör på en rotator.
OBS: Mättnad av pärlor måste bestämmas experimentellt. Detta kan åstadkommasgenom att identifiera pärla-beläggning villkor som ger maximal fagocytos när kulorna därefter opsonized med en kontrollgrupp monoklonal antikropp.
- Ta bort obundna antigen genom att tvätta med 1 mL PBS-BSA och centrifugera vid hög hastighet tills pärlorna är pelleterat. Ta bort PBS-BSA och upprepa.
- Resuspendera antigen-belagda pärlor i en slutlig volym på 1 ml i PBS-BSA. Pärlor kan lagras i upp till en vecka vid 4 ° C före användning.
4. Förbered Antibody Prover
- Kliniska antikropp prover kan renas från plasma med en melon gel IgG-rening kit enligt tillverkarens anvisningar. Renat IgG kan förvaras vid 4 ° C tills redo att användas.
OBS: lämpliga försiktighetsåtgärder för hantering av prover från människa måste alltid tagits.
- Bestäm koncentrationen av renade antikroppar genom absorption vid A280, och späd proverna till 1 mg / ml i PBS.
- Förbered positIve och negativa monoklonala antikroppar kontroll genom utspädning till 1 mg / ml i PBS.
5. Plating experimentet
- Resuspendera tvättade, antigen mättad pärla lösning som framställts ovan genom att vortexa och överföra 10 ìl i varje brunn i en rundbottnad 96 brunnar. Försiktighet måste vidtas för att ständigt agitera den pärla fjädring för att säkerställa lika många fluorescerande pärlor tillsätts till varje brunn.
- Lägg varierande koncentrationer av antikroppar av intresse för varje brunn, vilket skapar en dos-respons-kurva för varje antikropp. Optimal koncentration kommer att skilja sig mellan prover beroende på titer av antikroppar närvarande, men en rad 0,01 till 100 mikrogram / ml slutkoncentration ger god täckning och tillåter identifiering av koncentrationsintervallet intresse. Se till att antikroppar tillsätts i volymer inte större än 20 l.
- Inkubera pärlor och prover antikroppar i 2 timmar vid 37 ° C så att antikroppar mot opsonize kulorna. </ Li>
- Bered en suspension av THP-1 celler på 2,5 x 10 5 celler / ml och tillsätt 200 l av denna suspension till varje brunn, för totalt 5 x 10 4 THP-1 celler i varje brunn.
- Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO 2, i ett stillastående inkubator, vilket gör att cellerna och pärlor till pellets via gravitation.
OBS: Signal till brus kan förbättras genom att bestämma den optimala pärla: antikropp: THP-1-cell-tal för en viss antigen och antikroppar källa.
6. Flödescytometrisk analys
- Ta bort 100 ìl av supernatanten från varje brunn försiktigt så att inte störa cellpelleten. Supernatanten kan sparas om cytokin sekretion bestämningar eller andra analyser önskas.
- För fixering, tillsätt 100 l 4% paraformaldehyd i varje brunn och pipett för att resuspendera och blanda celler.
- Hög genomströmning flödescytometrisk analys kan utföras med hjälp av en BD LSR II utrustad med en HTS plattläsaren.
- Programvaror att blanda varje brunn tre gånger (100 l mix volym) och analysera 30 l, eller minst 2000 händelser cell, i varje prov.
- Uppgifter som samlats in kan analyseras i FlowJo eller motsvarande programvara. Användbara mått inkluderar procent av pärla + eller fluorescerande celler, vilket ger ett mått på antalet fagocytiska celler närvarande, liksom fluorescens intensiteten i fagocytiska celler, som ger ett mått på antalet fagocyteras pärlor. Multiplicerar dessa värden skapar en integrerad menar fluorescerande intensitet eller iMFI.
- Det genomsnittliga antalet pärlor fagocyteras varje fagocytiska cell kan beräknas genom att dividera iMFI av medelvärdet fluorescens en pärla.
7. Representativa resultat
Det bör finnas tydlig differentiering av antikroppar prover från drabbade och opåverkad ämnen. Figur 1A presenterar FACS histogrammen för en antikropp prov från en hiv-negativtiva (svart spår) och en hiv-positiv (grå spår) ämne, och visar på ökad fagocytos drivs av närvaron av antigen-specifika antikroppar.
Optimal känslighet analysen är beroende av mättnad av pärlor med biotinylerad antigen. Figur 1B presenterar fagocytos iakttas vid kulor belagda med olika mängder antigen var opsonized med 3 kontroll monoklonala antikroppar (inklusive en icke-bindande antikroppar, trianglar) och fastställer 2μg antigen / l pärlor som mättar koncentration för denna antigen.
En dos-respons-kurvan presenteras i figur 2, och visar skillnaden kapacitet föremål antikroppar prover för att inducera fagocytos över en antikroppskoncentration utbud av 0,05-5 mikrog / ml. Denna skillnad fagocytos kan drivas av antingen skillnader i titer eller FC egenskaper domän som IgG subklass och glykosylering stat.
När THP-1 celler imaged av fluorescerande mikroskop, finns det klara belägg för pärla fagocytos. Figur 3 presenterar två 63x stillbilder av THP-1 celler efter inkubering med antikroppar opsonized (grön) och icke-opsonized (röd) pärlor, visar avsaknaden av fagocytiska upptag i frånvaro av antikroppen. När tiden förfaller mikroskopi utförs, är antikroppen-specifika fagocytiska upptag av fluorescerande pärlor än mer slående (Film 1, 20x förstoring).
Tidigare arbete har bekräftat internalisering av pärlorna i samband med celler, och experiment med primär monocyter har gått bra med fagocytos poäng (iMFI värden) i denna hög genomströmning analys (data visas inte).
Figur 1. Assay Kvalitetskontroll. 1A, Flödescytometri histogram för fagocytos för en antikropp prov från en hiv-negativa ämne (svarta spår) och en hiv-positiv ämne (grå spår).1B: Experimentell bestämning av optimala pärla beläggning förutsättningar för ett prov antigen. Antigenspecifika monoklonala antikroppar (cirkel, fyrkant) visar maximal fagocytos av pärlor belagda med> 2 mikrogram antigen / l av pärlor, medan en kontroll antikropp (triangeln) visar inga fagocyterande förmåga.
Figur 2. Fagocytos dos-respons-kurva. Kliniska antikroppar prov från HIV-positiva (behandlas, obehandlad, och uppvisar kontroll av viral replikation i avsaknad av antiretroviral behandling) och HIV-negativa patienter köra fagocytos av gp120 (hiv kuvert) belagda pärlor differentiellt.
Figur 3. Effektiv Internalization. Mikroskopi bekräftar internalisering av antikropp-opsonized pärlor (grön), medan icke-opsonized pärlor kvar i solution (63x förstoring).
Film 1. Time-lapse mikroskopi av antikropp-drivna fagocytos utfördes under loppet av 14 timmar och tillåter visualisering av fagocyterande förmåga av THP-1 celler utnyttjas i hög genomströmning analys. Grönt fluorescerande pärlor antikropp opsonized, röda fluorescerande pärlor ger en negativ kontroll. Klicka här för att se filmen.
Discussion
Analysen beskrivs här låter hög genomströmning analys av fagocyterande förmåga av kliniska antikroppar prov genom att använda en monocytic cellinje länge använts för att studera fagocytiska processer 10 och plattan baserade automatiserade flödescytometri. Denna analys är en fördel framför andra i sin förmåga att exakt beskriva antigen-specifik antikropp delmängder, vilket inte bara för studier av skillnader i fagocytos drivs av sjukdom antikroppar från olika ämnen, men också studier av flera antigen särdrag inom samma ämne. Eftersom antikroppar rekrytering av medfödda effektor celler, inklusive monocyter och andra antigenpresenterande celler starkt påverkar sjukdomen resultatet 11-13, och är biologiskt varierar beroende antikropp geometri, IgG subklass och glykosylering på Asparagine297 av Fc-domänen 14-16, ger denna metod för utvärdering av en kritisk antikropp verkningsmekanism. Dessutom, eftersom antikroppar-Mediated fagocytos utnyttjas av vissa patogener under infektionen 7,17,18, har denna analys löfte i utvärderingen av processen antikroppsberoende förbättring, och belyser den dubbla karaktären av fagocytos som ett potentiellt skyddande, liksom eventuellt kan skada antikropp aktivitet.
Analysen beskrivs kan användas för att analysera antikroppar från kliniska prover av patientgrupper, men också av de vaccinerade, och kan anpassas för att utnyttja serum snarare än renat IgG. Dessutom kan cytokin sekretion som svar på fagocytos analyseras från supernatant och påverkan av specifika FCR kan bestämmas med hjälp av FCR-blockerande antikroppar, vilket gör att inte bara skillnader i fagocytiska styrka som skall fastställas, men nedströms signalering händelser, med insikt in i mekanismen, och kan hjälpa till att lösa och förbättra förståelsen för detta immun mekanism.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna finansiering från NIH 3R01AI080289-02S1 och en Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship i NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
