Summary
Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.
Abstract
Muitos devastadoras doenças oculares hereditárias resultar em cegueira progressiva e irreversível, porque os seres humanos não podem se regenerar morrendo ou doentes neurônios da retina. Em contraste, a retina zebrafish adulto possui a capacidade robusta de espontaneamente regenerar qualquer classe neuronal que se perde em uma variedade de diferentes modelos de danos na retina, incluindo punção da retina, a ablação química, alta temperatura concentrada, e tratamento luz intensa 1-8. Nosso laboratório amplamente caracterizada a regeneração de fotorreceptores após o tratamento luz constante intensa e interior neurônios da retina após injeção intravítrea ouabaína 2, 5, 9. Em todos os casos, residente glia Müller re-entrar no ciclo celular para a produção de progenitores neuronais, que continuam a proliferar e migrar para a camada adequada da retina, onde se diferenciam em neurônios deficiente.
Nós caracterizada cinco estágios diferentes durante a regeneração da dama-luzged retina que foram destacados por respostas específicas celular. Foram identificados vários genes diferencialmente expressos em cada estágio de regeneração da retina através da análise mRNA microarray 10. Muitos destes genes também são críticos para o desenvolvimento ocular. Para testar o papel de cada gene candidato / proteína durante a regeneração da retina, precisávamos desenvolver um método para condicionalmente limitar a expressão de uma proteína único candidato, por vezes, durante a regeneração da retina adulta.
Oligos morfolino são amplamente utilizados para estudar a perda da função de proteínas específicas durante o desenvolvimento do peixe-zebra, Xenopus, pinto, mouse e tumores em xenoenxertos humanos 11-14. Estes pares de bases modificadas oligos com seqüência de RNA complementar, quer bloquear a emenda ou a tradução do RNA alvo. Morpholinos são estáveis na célula e pode eliminar ou "knockdown" a expressão da proteína por três a cinco dias 12.
Aqui,nós descrevemos um método eficiente para a expressão da proteína knockdown alvo na retina zebrafish adulto. Este método emprega lisamina marcadas morpholinos antisense que são injetadas no vítreo do olho zebrafish adulto. Utilizando uma pinça eletrodo, o morfolino é então electroporated em todos os tipos de células da retina dorsal e central. Lissamina fornece a carga na morfolino para eletroporação e podem ser visualizados para avaliar a presença do morfolino nas células da retina.
Knockdown condicional na retina pode ser usado para examinar o papel de proteínas específicas em momentos diferentes durante a regeneração. Além disso, esta abordagem pode ser usada para estudar o papel de proteínas específicas na retina não danificada, em processos como a transdução visual e processamento visual em neurônios de segunda ordem.
Protocol
1. Preparação morfolino:
- Todos os oligos morfolino devem ser personalizados e encomendados através GeneTools (Philomath, OR). Usamos a carregada positivamente lisamina marcadas morpholinos para conduzir o morpholinos electroporated para o eletrodo negativo. Tentamos, sem sucesso, alvo de carga negativa fluoresceína tag morpholinos para o eletrodo positivo usando esta técnica. Diluir 300 nmol de morfolino em 100 l de água livre de nuclease para produzir uma solução 3 mM. Alíquota do morfolino em vários tubos de parafina, selada microcentrífuga. Guarde longe da luz à temperatura ambiente.
- Determinar a concentração morfolino diluindo 5 mL de morfolino (ou água utilizada para diluir o morfolino como um espaço em branco) em 95 mL de 0,1 N HCl. Definir o comprimento de onda espectrofotômetro (λ) a 265 nm. Calcule a constante para o seu morfolino usando a seguinte equação:
= Peso molecular constante especial para o seu morpholino absorbância X 1000/molar. - Você vai encontrar o peso molecular e os dados de absorvância molar em "Propriedades Oligo" folha fornecida com cada morfolino. Analisar o espaço em branco para verificar as leituras de base e fazer leituras de cada morfolino diluída. Multiplicar a absorvância a 265 nm de cada morfolino pela sua constante e determinada pelo fator de diluição para obter a concentração em ng / mL. Divida este número pelo peso molecular para determinar a concentração em mM. Diluir o morfolino, se necessário, a uma concentração de trabalho.
2. Remover camada córnea exterior:
- Anestesiar de 6-12 meses de idade em zebrafish adulto tricaina ou 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml em zebrafish água do tanque.
- Embrulhe em um peixe-zebra umedecido pedaço de papel toalha, cobrindo as brânquias, mas deixando o olho exposto. O peixe embrulhado é colocado sob um estereoscópio ea ampliação é aumentada até o diâmetro do olho enche cerca de um terço doso campo visual (Figura 1).
- Usando Dumont # 5 pinças, pegue a córnea exterior perto da fissura óptica. Este tecido é colorido de vermelho e é rotulado de "OC" na Figura 1. Há uma leve protrusão ou lábio indicado pela seta rotulada "CL". Puxe em um ângulo baixo (ou seja, 10 graus) em todo o olho para remover a córnea exterior. Com a prática, este pode ser concluído em um movimento. Se o slip pinças, re-pegue o tecido e puxe novamente em um ângulo baixo até que sejam removidas. A córnea bem conectado pode causar o olho a ser desalojado da tomada quando puxado. Você pode manter o olho de cada vez desalojada por firmar com outro conjunto de pinças.
3. Incisão na córnea e injeção morfolino:
- Imediatamente após a remoção da córnea exterior, fazer uma pequena incisão na córnea onde o aluno encontra a íris (Figura 2). Isso é feito usando uma lâmina de bisturi de safira (Veja Materiais).
- Load 0,5 mL da solução 3,0 mM morfolino em um Hamiltna seringa equipada com um calibre 33 removíveis, agulha blunt-end (Veja Materiais). Pipeta para cima e para baixo para remover bolhas de ar na linha. Insira com cuidado a agulha no vítreo através da incisão (Figura 2). Não insira a agulha longe demais ou você vai perfurar a retina ou deslocar a lente.
- Injecte lentamente a solução morfolino no espaço vítrea. Dependendo da idade dos peixes, o espaço irá realizar vítrea ~ 0,5 mL. Você deve visualizar vítreo uncolored vazando da incisão, uma vez que é deslocado pela solução morfolino. Injetar até que uma pequena quantidade de solução de vazamentos morfolino fora da incisão. Você deve visualizar claramente as morfolino lisamina marcadas dentro do olho.
- Após a injeção, o retorno dos peixes ao tanque para se recuperar. Nós normalmente só injetar o olho esquerdo, usando o olho direito como um controle uninjected, mas eletroporação de ambos os olhos é possível.
4. Eletroporação:
- Seguintea injeção de cerca de 10 peixes, re-anestesiar um peixe injetado e envolvê-la em um pedaço de papel toalha umedecido, apenas cobrindo as brânquias, mas deixando o olho exposto. Transfira o peixe para um prato de Petri. Coloque em luvas de látex ou similares para evitar a exposição à anestesia. Enquanto gentilmente segurando o peixe para o fundo do prato, encher o prato com anestesia (Figura 3, painel esquerdo).
- A 3 mm de diâmetro do eletrodo placa de platina (Veja Materiais) localiza os pulsos de eletroporação para aproximadamente metade da retina. Normalmente, alvo da retina dorsal. Pressione suavemente o eletrodo positivo para baixo na metade ventral do olho. Com a córnea externa removida, o olho pode ser facilmente girada, expondo a porção dorsal do globo ocular.
- Ainda pressionando para baixo no lado ventral do olho, coloque o eletrodo negativo próximo (~ 1-2 mm) expostas a metade dorsal do olho. Tenha cuidado para não tocar no eletrodo negativo diretamente para o olho, o que irá resultar em danosa retina dorsal. Depois de determinar a distância adequada entre os eletrodos, use o parafuso de ajuste no punho dos eletrodos para manter que se espalham quando electroporating. Isso mantém o eletrodo negativo de uma distância ideal do olho quando o eletrodo positivo é pressionado para baixo na posição.
- Electroporate do olho usando um CUY21 Electroporator onda quadrada (Veja Materiais). Os parâmetros eletroporação deve ser ajustado para dois períodos consecutivos de 50 msec pulsos, a 75 V com uma pausa de 1 seg entre os pulsos.
- Retorno dos peixes ao tanque. Nós normalmente começam nosso protocolo para a degeneração induzida pela luz constante da retina imediatamente após eletroporação.
5. Resultados representativos:
- Por 3-5 dias após a eletroporação (dependendo da estabilidade do morfolino), o rótulo lisamina pode ser visualizado em todas as camadas da retina em um retina seccionado (Figura 4). Isto serve como uma confirmação para a presença deos rotulados morfolino.
- Podemos alcançar knockdown proteína completa até 3-5 dias após a eletroporação, dependendo da eficácia do morfolino (Figura 5). Normalmente, durante estudos de tratamento de luz, colhemos os olhos menos 3 ou 4 dias após a eletroporação morfolino. Isto é feito através da remoção de todo o olho com uma pinça Dumont 5B # com extremidades curvas (Figura 6; Materiais) e processamento de tecido para imunohistoquímica 15. Como acontece com qualquer técnica de knockdown, uma demonstração de knockdown eficiente deve ser mostrado, a fim de validar o fenótipo. Portanto, sugerimos a obtenção de anti-soros para a sua proteína de interesse. Alternativamente, se e anticorpo não está disponível e os morfolino é direcionado tanto ao receptor de splice ou local doador no pré-mRNA, ele irá bloquear splicing eficiente do mRNA. Neste caso, é possível a utilização da transcriptase reversa-PCR para amplificar as seqüências de acompanhamento no RNA morphant e determinar a eficiência do bloqueio da splic normaispadrão ing.
- Quando o retinas são seccionados de nasal para temporais no eixo dorsal ventral, as caixas de sombreado azul (Figura 6) representam as áreas da retina que são mais frequentemente danificados a partir do evento eletroporação em si. A caixa sombreada rosa representa a área que é alvo de morfolino introdução em células da retina pela eletroporação.
Figura 1. Esquemática representando a remoção das camadas epiteliais da córnea. O painel esquerdo mostra as principais características estruturais do olho, incluindo a lente (L), o vítreo (Vit), a retina (R), a córnea exterior (OC), a córnea interna (IC), e a saliência da córnea ( CL). A orientação do olho é mostrado no canto inferior direito do primeiro painel e é rotulado anterior (A), posterior (P) dorsal, (D) e ventral (V). A coloração vermelha indica a córnea exterior, que é removido. O pan segundo el mostra como as pinças são usadas para agarrar a saliência da córnea e para puxar a córnea exterior através do olho em um ângulo baixo (terceiro painel). O painel da direita mostra como um segundo par de fórceps pode ser usado para o olho da constante enquanto puxa a córnea.
Figura 2. Esquemática das etapas envolvidas na injeção intravítrea de morfolino. Uma pequena incisão é feita no olho, onde o aluno encontra a íris (painel esquerdo). A diferença resultante deve ser grande o suficiente para uma agulha de calibre 33, que é preenchido com a solução morfolino, para ser inserido (painel do meio). Injectar lentamente 0,5 ml de solução para o vítreo (painel direito). Você deve visualizar uma pequena quantidade de solução vítrea sair da incisão como o vítreo é parcialmente substituído por com-lisamina tag morfolino (painel direito).
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Figura 3. Esquemática do procedimento de eletroporação geral. Os peixes anestesiados, que foi injeção intravítrea injetado com o morfolino, é delicadamente envolto em papel toalha úmido (painel esquerdo). A toalha de papel deve cobrir as brânquias, mas não obstruir o olho (painel do meio). Pressione suavemente o eletrodo positivo para baixo na parte ventral do olho, permitindo a metade dorsal do olho para girar para fora do soquete. Coloque o eletrodo negativo de cerca de 1 milímetro a partir da metade dorsal do olho e começar a eletroporação (painel direito).
Figura 4. Confocal imagem comparando uma retina electroporated sem injeção intravítrea injeção de um morfolino lisamina-tagged (A), e uma retina intravítreo injetado e electroporated com o morfolino lisamina-marcados (B). A etiqueta lisamina é encontrado em todas as camadas da retina e tipos de células. ROS, de haste exteriorsegmentos; ONL, a camada externa nuclear; INL, camada nuclear interna; GCL, camada de células ganglionares.
Figura 5. Confocal imagens comparando imunolocalização PCNA em retinas electroporated com um controle de morfolino (painéis à esquerda) e retinas electroporated com um morfolino anti-PCNA (painéis à direita) antes da luz morte celular induzida por fotorreceptoras. De adaptação ao escuro zebrafish adulto albinos foram colocados em luz intensa constante para 1, 2 ou 3 dias após a eletroporação do morfolino. O controle de morfolino não para reprimir a expressão PCNA crescente no retinas de luz danificado. O morfolino anti-PCNA eficiente derrubado PCNA expressão da proteína por três dias de intensa danos luz constante.
Esquema Figura 6. (Painel esquerdo) mostrando enucleação do olho para pROCESSAMENTO e cryosectioning, que é feito ao longo do eixo dorsal ventral. A caixa cor de rosa sombreada (painel direito) mostra a região da retina com a maior quantidade de proteína knockdown usando esta técnica. As caixas azuis sombreadas representam as áreas que são mais frequentemente danificados pelo evento eletroporação. A orientação do olho é rotulado anterior (A), posterior (P) dorsal, (D) e ventral (V).
Discussion
Recentemente, duas análises microarray examinou as mudanças de expressão gênica que ocorreu durante a regeneração de qualquer retina a luz danificado ou um patch cirurgicamente extirpado da retina 10, 16. Ambos os estudos revelaram numerosos genes que apresentaram mudanças significativas na expressão, seja crescente ou decrescente, que provavelmente são necessários para diferentes eventos que ocorrem durante a regeneração da retina, como a re-entrada da glia Müller no ciclo celular, proliferação e migração contínua do progenitores neuronais para a camada da retina danificada, ea diferenciação dos progenitores neuronais para o tipo de célula neuronal correta. Embora uma comparação direta desses dois conjuntos de dados microarray revelam genes candidatos que possam estar envolvidos nestes eventos celulares, em última instância esses genes e suas proteínas codificadas devem ser testados para determinar se eles são necessários para a regeneração neuronal. Aqui, descrevemos uma abordagem de perda de função-poderoso a conditionalmente knockdown proteínas de interesse na retina zebrafish adulto. Esta técnica tem sido usada para estudar ambas as proteínas extracelular e intracelular, bem como moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição e proteínas necessárias para a replicação de DNA 17-19. Assim, este método tem ajudado muito a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a regeneração da retina adulta em zebrafish.
Testamos vários parâmetros eletroporação (número de tensão, de pulsos, o tempo entre os pulsos) antes de um protocolo bem sucedido foi alcançado. Um relatório anterior do electroporating morpholinos no fin regeneração caudal zebrafish utilizado 10 pulsos em uma baixa voltagem (15 V) 20. Porque a retina zebrafish adulto é rodeado por várias camadas de células e não é facilmente acessível a eletrodos pinça, os parâmetros utilizados na fin foram fracassadas de forma eficiente electroporating morpholinos na retina adulta. Por outro lado, uma alta voltagem (100 V), muitas vezes resulted na morte do peixe. Recentemente, 5 pulsos de 80 V foi descrito electroporate DNA plasmídeo na retina do rato recém-nascido filhote 21. Descobrimos que um pouco menos intensa 2 pulsos de 75 V resultou em eletroporação bem-sucedida do morpholinos na retina zebrafish adulto com a sobrevivência de 100% dos peixes tratados. Além disso, descobrimos que a remoção da maioria do exterior (ou externo-mais) componente da córnea aumentou muito a eficiência eletroporação. Aumentar o número de pulsos pode eliminar a necessidade de remoção deste tecido, mas também pode causar danos maiores tecido. Estudos de controle extensa demonstrou que estes parâmetros não causou morte celular significativa da retina ou alterar as respostas celulares específicas observadas durante a regeneração de fotorreceptores 19. Ganho de função de estudos não são atualmente possíveis usando esta técnica in vivo, devido à nossa incapacidade de forma consistente electroporate grandes ácidos ribonucléico em todos os retinal células. No entanto, o sucesso de electroporating plasmídeos na retina do rato in vivo e da retina zebrafish em explantes sugere ainda é uma possibilidade em zebrafish 21, 22.
Um dos pontos fortes desta técnica é a eletroporação parece eficiente introduzir o morfolino em todos os diferentes tipos de células da retina. No entanto, uma potencial fraqueza era que a eletroporação eficiente entregou o morfolino apenas nas regiões dorsal e central da retina. Um evento de eletroporação segunda para a metade ventral dos resultados retina no alvo bom para todas as camadas, mas muitas vezes resulta em danos. Esta restrição espacial foi provavelmente devido à forma e posicionamento dos eletrodos. O uso de eletrodos de design personalizado em forma de taça que poderia ser colocado ao redor do olho pode melhorar esta fraqueza. Esta restrição espacial da entrega morfolino limita o uso desta técnica e impede o uso de um ensaio de sucessoh como a análise ERG que exigiria uma avaliação global da retina. Deve-se notar que como em qualquer experimento morfolino, é aconselhável para confirmar seus resultados usando um segundo, não se sobrepõem morfolino ao mRNA alvo. Em alguns casos, é possível também electroporate dois morpholinos diferentes simultaneamente para knockdown da expressão de duas proteínas diferentes. Demonstramos isso derrubando a expressão de ambos os Pax6a e proteínas Pax6b, individualmente e em associação 18.
Embora tenhamos demonstrado o uso desta técnica com o nosso modelo de danos luz, poderia provavelmente ser usado para estudar a regeneração em modelos de outros danos 2-8 ou usado para examinar a função das proteínas na retina não danificada. Por exemplo, eletroporação de morpholinos poderia ser usado para knockdown da expressão de canais específicos ou moléculas de transdução de sinal no gânglio ou células amácrinas e depois estudar a função desses sinalizaçãocaminhos no processamento visual. No entanto, como morpholinos só afetam tradução da nova proteína, a pessoa teria que esperar até turnover de proteína endógena ocorre antes de um ensaio pode ser realizado. Em função da estabilidade da proteína, que pode variar de horas a dias 18.
Disclosures
Não temos nada a divulgar
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer à Vida Freimann Science Center e Center for Research Zebrafish pessoal para seu cuidado e manutenção do peixe-zebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
References
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