Summary
조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.
Abstract
인간 망막 뉴런을 죽음이나 질병 재생 수 없기 때문에 대부분의 치명적인 상속 안과 질환은 진취적이고 돌이킬 실명을 초래할. 반면, 성인 zebrafish의 망막은 저절로 망막 펑크, 화학 절제, 집중 고온 및 강한 빛 치료 1-8을 포함하여 서로 다른 망막 손상 모델의 다양한에서 분실되는의 연결 클래스를 생성하는 강력한 능력을 가지고 있습니다. 우리 연구실에서 광범위하게 intravitreal ouabain 주입 2, 5, 9 이후 지속적인 강한 조명 치료 및 내부 망막 뉴런 다음 photoreceptors의 재생을 특징. 모든 경우에, 뮐러의 glia을 거주하면 그들은 결함 뉴런으로 차별 적절한 망막 층에 분아 따위에 의해 중식 및 마이 그 레이션을 계속 progenitors의 연결을 생성하는 세포주기를 다시 입력하십시오.
우리는 가벼운 아줌 마야의 재생 중에 다섯 가지 단계를 특징특정 세포 반응에 의해 강조되었다 검정 고시 망막. 우리는 mRNA의 microarray 분석 10 망막 재생의 각 단계에서 여러 differentially 표현 유전자를 발견. 이러한 유전자의 대부분은 또한 안구 개발에 중요하다. 망막 재생하는 동안 각 후보 유전자 / 단백질의 역할을 테스트하려면, 우리는 조건부 성인 망막의 재생 동안에만 시간 후보 단백질의 표현을 제한하는 방법을 개발했습니다.
Morpholino의 oligos 널리 zebrafish, Xenopus, 병아리, 마우스의 개발 기간 동안 특정 단백질의 기능 상실을 연구하는 데 사용하고, 인간의 xenografts의 종양 11-14아르. 보완 RNA 시퀀스로 이러한 변경 oligos의 basepair 역시 목표 RNA의 splicing 또는 번역을 차단합니다. Morpholinos는 세포에 안정되고 제거 또는 3-5일 12 '최저'단백질 표현하실 수 있습니다.
여기,우리는 성인 zebrafish의 망막에 효율적으로 최저 목표 단백질 표현하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 성인 zebrafish의 눈 유리체에 주사 lissamine - 태그 안티 센스 morpholinos을 사용합니다. 전극 집게를 사용하여 morpholino은 다음 지느러미와 중앙 망막의 모든 세포 종류로 electroporated 있습니다. Lissamine은 electroporation에 대한 morpholino에 요금을 제공하고 망막 세포에 morpholino의 존재를 평가하기 위해 시각하실 수 있습니다.
망막의 조건부 최저는 재생하는 동안 다른 시간에 특정 단백질의 역할을 검토하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 Visual 도입 번째와 두 번째 주문 뉴런의 영상 처리와 같은 프로세스에서 손상되지 않은 망막에있는 특정 단백질의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. Morpholino 준비 :
- 모든 morpholino의 oligos은 (Philomath, OR) 맞춤 설계 GeneTools 통해 주문해야합니다. 우리는 음극쪽으로 electroporated morpholinos를 드라이브에 긍정적 - 충전 lissamine - 태그 morpholinos를 사용합니다. 우리는이 기술을 사용하여 긍정적인 전극에 부정적 - 부과 플루오레신 - 태그 morpholinos를 타겟으로, 실패, 시도. 3 MM 솔루션을 항복하는 nuclease없는 물 100 μl에 morpholino 300 nmol을 희석. 여러 파라핀 - 봉인 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 morpholino합니다. 상온에서 빛으로부터 멀리 보관하십시오.
- 0.1 N HCL의 95 μl에 morpholino 5 μl (또는 빈으로 morpholino를 희석하는 데 사용되는 물)을 diluting하여 morpholino 농도를 결정합니다. 분광 광도계의 파장 (λ) 265 nm의로 설정합니다. 다음 방정식을 사용하여 morpholino에 대한 상수를 계산 :
귀하의 morpholin 특정 상수 = 분자량O X 1000/molar 흡광도. - 당신은 각 morpholino와 함께 제공된 "Oligo 등록 정보"시트에있는 분자 무게와 어금니 흡광도 데이터를 찾을 수 있습니다. 기준 수치를 확인하고 각 희석 morpholino의 판독을 위해 공백으로 분석할 수 있습니다. NG / μl의 농도를 결정하기 위해 상수와 희석 요소를 기준으로 각 morpholino의 265 nm의 흡광도에서를 곱하면됩니다. MM의 농도를 결정하는 분자 무게로이 번호를 나누십시오. 작업 농도로 필요한 경우 morpholino을 희석.
2. 외부 각막 층을 제거합니다 :
- zebrafish 탱크 물 속에 1.0 밀리그램 / ML에 Tricaine 또는 2 phenoxyethanol에서 마취 6-12 개월 된 성인 zebrafish.
- 에 랩 zebrafish는 아가미를 덮고 있지만, 눈이 노출된 떠나, 종이 타월의 조각을 moistened. 눈의 직경은 약 3 중 채우고 때까지 싼 고기는 입체경 아래에 위치하고 있으며 배율은 증가시각 필드 (그림 1).
- 뒤몽 # 5 핀셋을 사용하여 광학 균열 (fissure) 근처의 외부 각막을 풉니다. 이 조직은 붉은 색이며 그림 1에서 "OC"로 표시됩니다. "CL"표시된 화살표 약간의 돌출부 또는 입술이있다. 외부 각막을 제거 눈에 걸쳐 낮은 앵글 (즉, 10도)에서 가져옵니다. 연습으로,이 하나의 동작을 완료할 수 있습니다. 핀셋의 슬립면, 조직을 다시 잡고 제거할 때까지 다시 낮은 각도로 당기십시오. 잘 연결된 각막은 구출할 때 눈이 소켓에서 dislodged 수가 발생할 수 있습니다. 당신은 핀셋 다른 세트로 당겨하여 dislodged되는에서 눈을 유지할 수 있습니다.
3. 각막 절개와 morpholino 주입 :
- 즉시 외부 각막의 제거 다음, 학생 그리고 홍채 (그림 2) '요건을 충족하고 각막에 작은 절개를합니다. 이것은 사파이어 블레이드 메스를 (자료 참조)를 사용하여 이루어집니다.
- Hamilt에 3.0 MM morpholino 솔루션의 0.5 μl를로드주사기에 33 게이지 이동식, 무딘 엔드 바늘 (자료 참조)을 갖춘. 라인에 공기 방울을 제거하는 위, 아래 피펫. 조심스럽게 절개 (그림 2)를 통해 유리체에 바늘을 삽입합니다. 너무 멀리하거나 소중히 망막을 것이다 바늘을 삽입하거나 렌즈를 치환하지 마십시오.
- 천천히 vitreal 공간으로 morpholino 솔루션을 주입. 물고기의 나이에 따라 vitreal 공간 ~ 0.5 μl를 개최합니다. 당신은 morpholino 솔루션에 의해 전이므로 절개 밖으로 새는 uncolored 유리 체액을 시각화한다. 절개 밖 morpholino 솔루션 누출을 소량 주입까지. 당신은 명확하게 눈 안에 lissamine - 태그 morpholino을 시각화한다.
- 사출 다음, 복구하기 위해 탱크에 물고기를 반환합니다. 우리는 일반적 uninjected 컨트롤로 오른쪽 눈을 사용하여, 왼쪽 눈이 투입하지만, 두 눈 electroporation이 가능합니다.
4. Electroporation :
- 다음의약 10 물고기의 주입이 아니라 아가미를 덮고 있지만, 눈이 노출된 떠나, 주입 물고기를 다시 마취 및 종이 타월의 moistened 조각에 포장. 페트리 접시에 생선을 전송합니다. 마취에 노출을 피하기 위해 라텍스 또는 이와 유사한 장갑을 끼다. 부드럽게 접시의 바닥에 물고기를 잡고 있지만, (그림 3, 왼쪽 패널) 마취와 함께 요리를 입력합니다.
- 3 - mm - 지름 플래티넘 플레이트 전극은 (자료 참조) 망막의 약 절반에 electroporation의 펄스를 localizes. 우리는 일반적으로 지느러미 망막을 대상. 부드럽게 눈 복부 이분의 일에 아래 긍정적인 전극을 누르십시오. 외부 각막 제거와 함께, 내 눈을 쉽게 안구의 지느러미 부분을 노출, 회전이다.
- 눈 노출 지느러미 하프 - 아직도 눈 복부 측면에 아래로 누르면서, 근처에 부정적인 전극 (2mm ~ 1) 장소. 손상을 초래할 수있는, 눈에 직접 부정적인 전극을 접촉하지 않도록주의지느러미 망막. 일단 전극 사이의 적절한 거리를 결정 electroporating 때 확산을 유지하기 위해 전극의 핸들에있는 조정 나사를 사용합니다. 이것은 음극에게 긍정적인 전극이 위치에 아래로 누르면 안구에서 최적의 거리를 유지합니다.
- CUY21 스퀘어 웨이브 Electroporator를 (자료 참조)를 사용하여 눈을 Electroporate. electroporation 매개 변수는 펄스 사이의 1 초 정지 75 V에서 두 개의 연속 50 밀리초 펄스로 설정해야합니다.
- 탱크에 물고기를 반환합니다. 우리는 일반적으로 즉시 electroporation 다음과 같은 일정한 빛을 유도된 망막 변성을위한 프로토콜을 시작합니다.
5. 대표 결과 :
- electroporation (morpholino의 안정성에 따라) 다음 3-5일 들어, lissamine 레이블은 sectioned 망막 (그림 4)에서 망막 레이어의 모든 시각하실 수 있습니다. 이것은 존재에 대한 확인 역할morpholino 표시.
- 우리는 morpholino의 효능 (그림 5)에 따라, electroporation 다음 최대 3-5일 전체 단백질 분해를 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 가벼운 치료 연구 기간 동안, 우리는 morpholino의 electroporation 후 3 ~ 4 일 동안 눈을 수확. 과 immunohistochemistry 15 조직을 처리,이 곡선 엔드 (자료 그림 6)와 뒤몽 #의 5B를 집게로 전체 눈을 제거하여 이루어집니다. 모든 분해 기술과 마찬가지로 효율적인 최저의 데모가 표현형를 확인하기 위해 표시해야합니다. 따라서, 우리는 관심의 단백질에 대한 취득 antisera을 제안한다. 또는, 그리고 항체를 사용할 수 없습니다 있으며 morpholino가 사전 mRNA의 스플 라이스 수용체 또는 기증자 사이트를하거나 이동하는 경우, 그것은 mRNA의 splicing을 효율적으로 차단합니다. 이 경우, 그것은 morphant RNA의 측면을 노릴 시퀀스를 증폭하고 정상 splic을 차단의 효율성을 결정하기 위해 리버스 transcriptase - PCR을 사용할 수 있습니다ING 패턴.
- 망막은 비강에서 지느러미 복부 축에 일시적으로 sectioned되면 음영 파란색 상자 (그림 6) 가장 많이 electroporation 이벤트 자체에서 손상되는 망막의 영역을 나타냅니다. 그늘진 분홍색 상자가 electroporation에 의해 망막 세포로 morpholino 도입을위한 대상이되는 영역을 나타냅니다.
그림 1. 도식은 각막의 상피 층의 제거를 묘사. 왼쪽 패널 렌즈 (L), 유리체 (Vit), 망막 (R), 외부 각막 (OC), 내부 각막 (IC)와 각막 돌출부 (를 포함하여 안구의 주요 구조적 특징을 보여줍니다 CL). 눈의 방향은 (V) 첫 번째 패널의 오른쪽 하단에 표시되며 앞쪽에 (A), 사후 (P), 등 지느러미 (D) 표시이며, 복부. 붉은 착색이 제거됩니다 바깥 각막을 나타냅니다. 두 번째 팬 엘은 포셉이 각막 돌출부를 파악하고 낮은 앵글 (3 패널)에서 눈에 걸쳐 외부 각막 당겨하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 각막을 당기는 동안 집게의 두 번째 쌍 안정 눈에하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
그림 2. morpholino의 intravitreal 주사에 관련된 단계를 도식. 작은 절개는 동공이 아이리스 (왼쪽 패널) '요건을 충족하고 눈에 이루어집니다. 그 결과 간격 삽입 morpholino 솔루션 (중앙 패널)으로 가득합니다 33 게이지 바늘, 충분한 단지 커야합니다. 천천히 유리체 (오른쪽 패널)에 솔루션의 0.5 μl를 주입. 당신은 유리체가 부분적으로 morpholino을 (오른쪽 패널) lissamine - 태그로 대체됩니다 절개로 나올 vitreal 솔루션의 작은 금액을 시각화한다.
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그림 3. 일반적인 electroporation 절차 도식. intravitreally morpholino과 함께 주입했던 anesthetized 생선, 부드럽게 축축한 종이 타월 (왼쪽 패널)에 싸여있다. 종이 타월이 아가미를 커버하지만, (중앙 패널) 시선을 방해해서는 안됩니다. 부드럽게 눈 지느러미 절반 소켓 밖으로 회전 수, 눈 복부 부분에 긍정적인 전극을 누르십시오. 눈 지느러미 이분의 일로부터 음극 약 1mm를 삽입하고 electroporation (오른쪽 패널)를 시작합니다.
그림 4. intravitreally intravitreally lissamine - 태그 morpholino (B)에 주입하고 electroporated lissamine - 태그 morpholino (A), 그리고 망막을 주입하지 않고 electroporated 망막을 비교 공촛점 이미지. lissamine 레이블이있는 모든 레이어와 망막 세포 유형에서 발견된다. ROS,로드 외부세그먼트, ONL, 바깥 핵 층, INL, 내면의 핵 계층, GCL, 신경절 세포 계층.
그림 5. 방지 PCNA morpholino (오른쪽 패널) 빛을 유도 photoreceptor 세포 사망하기 전에 함께 electroporated 제어 morpholino (왼쪽 패널)와 망막과 망막 electroporated에서 PCNA의 immunolocalization를 비교 공촛점 이미지. 어두운 적응 성인 흰둥이 zebrafish는 morpholino의 electroporation 후 1, 2, 3 일 동안 지속적인 강한 빛에 배치했다. 컨트롤 morpholino는 가벼운 손상 망막에서 증가 PCNA 표현을 주체할 수 없습니다. 안티 PCNA morpholino 효율적으로 지속적인 집중 조명 손상 3 일 통하여 PCNA 단백질 발현을 무너 뜨 렸어.
P에 대한 눈의 핵의 제거를 보여주는 그림 6. 도식 (왼쪽 패널)지느러미 복부 축을 따라 이루어집니다 rocessing 및 cryosectioning. 분홍색 음영 상자 (오른쪽 패널)은이 기술을 사용하여 단백질 분해의 가장 큰 금액으로 망막 영역을 보여줍니다. 파란색 음영 상자에서 가장 자주 electroporation 이벤트에 의해 손상된 영역을 나타냅니다. 눈의 방향은 앞의 (A), 사후 (P), 등 지느러미 (D)를 표시하고, 복부는 (V).
Discussion
최근 두 microarray 분석은 가벼운 손상 망막이나 수술 - excised 망막 패치 10, 16 중 하나의 재생 중에 발생한 유전자 발현 변화를 조사했다. 두 연구는 역시 가능성이 같은 세포주기에 뮐러의 glia의 재입국과 같은 망막 재생하는 동안 발생하는 다양한 이벤트에 필요한 즉, 증가 또는 감소, 표현에 상당한 변화를 전시 수많은 유전자를 밝혀 확산 및 마이 그 레이션을 계속 손상된 망막 층, 그리고 올바른 세포의 연결 유형에의 연결을 progenitors의 분화로의 연결을 progenitors. 이 두 microarray 데이터 세트의 직접적인 비교가 이러한 세포 행사에 관련되어있을 수도 후보 유전자를 밝혀 있지만, 궁극적으로 이러한 유전자와 그 인코딩된 단백질들은 중생의 연결에 필요한 있는지 확인하기 위해 테스트해야합니다. 여기, 우리는 conditio에 강력한 손실의 기능 방식을 설명성인 zebrafish의 망막에 관심 nally 최저 단백질. 이 기술은 DNA 복제에 필요한 세포 17-19과 세포내 단백질뿐만 아니라 신호 분자, 전사 인자와 단백질 모두를 연구하는 데 사용되었습니다. 따라서이 방법은 크게 zebrafish에서 성인 망막 재생을 기본 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 도와 주었있다.
우리는 성공적인 프로토콜이 달성되기 전에 (펄스의 전압, 수, 펄스 사이의 시간) 여러 electroporation 매개 변수를 테스트했습니다. 재생 zebrafish 꼬리 지느러미에 morpholinos를 electroporating의 이전 보고서는 낮은 전압 (15 V) 20 10 펄스를 사용합니다. 성인 zebrafish의 망막 세포가 여러 층으로 둘러싸여 있으며, 트위터 전극에 쉽게 액세스할 수 없기 때문에, 지느러미에 사용되는 매개 변수는 효율적으로 성인 망막에 morpholinos를 electroporating에 실패했다. 반대로, 높은 전압 (100 V)는 종종 RES물고기 죽음을 ulted. 최근, 80 5 펄스는 V는 신생아 마우스 망막 강아지 21에 플라스미드 DNA를 electroporate로 설명했다. 우리는 75 약간 덜 강렬한 두 펄스는 V가 취급 물고기의 100 %의 생존과 성인 zebrafish의 망막에 morpholinos의 성공적인 electroporation 결과 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 각막의 구성 요소 (또는 외부 - 대부분의) 외부 대부분의 제거가 크게 electroporation 효율을 증가 것을 발견했습니다. 펄스의 개수를 늘리면이 조직의 제거에 대한 필요성을 제거하는 수뿐 아니라 더 큰 조직 손상을 줄 수 있습니다. 광범위한 제어 연구는 이러한 매개 변수가 의미있는 망막 세포 사망의 원인이나 photoreceptor 재생 19 동안 관찰 특정 세포 응답을 변경하지 않았 것을 보여주었다. 이득의 기능 연구는 지속적으로 모든 연구에 큰 ribonucleic 산을 electroporate 우리의 무능력에 의한 생체내에이 기법을 사용하여 현재로서는 없습니다etinal 세포. 그러나, explants의 생체내 및 zebrafish 망막에 마우스 망막에 plasmids를 electroporating의 성공은 여전히 zebrafish 21, 22의 가능성이 제안합니다.
이 기법의 장점 중 하나는 electroporation 효율적으로 다른 망막 세포 유형의 모든에 morpholino 소개 나타납니다. 그러나 하나의 잠재적인 약점은 electroporation 효율적에만 지느러미 중앙 망막 지역에 morpholino를 전달 것이었습니다. 모든 레이어에 좋은 대상에서 망막 결과의 복부 이분의 일 향한 두 번째 electroporation 이벤트 손상지만 종종 발생합니다. 이 공간 제한 가능성이 전극의 형상과 배치에 의한했다. 눈 주위에 배치 될 수 맞춤 디자인 컵 모양의 전극의 사용이 약점을 향상시킬 수 있습니다. morpholino 전달의 공간적 제한이 기법의 사용을 제한 및 분석 suc의 사용 걸로망막의 글로벌 평가를 요구 에르그 분석과 같은 H. 그것은 어떤 morpholino 실험에서와 마찬가지로 그것은 목표 mRNA에 두 번째가 아닌 중복 morpholino를 사용하여 결과를 확인하는 것이 좋습니다 있다고 지적한다. 어떤 경우에는, 그것은 또한 최저 동시에 두 가지 단백질의 표현을 두 개의 서로 다른 morpholinos를 electroporate 수 있습니다. 우리는 개별적과 조합 18, Pax6a 및 Pax6b 단백질 모두의 표현을 쓰러뜨린하여이 문제를 보여주었다.
우리가 우리의 빛 손상 모델이 기술의 사용을 보여주지만, 그것은 가능성이 다른 손상 모델 2-8의 재생을 연구하는 데 사용하거나 손상 망막에서 단백질의 기능을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, morpholinos의 electroporation은 최저 신경절 또는 amacrine 세포에서 특정 채널이나 신호 전달 분자의 표현을 위해 사용하고 이러한 신호의 기능 연구를 수영상 처리 경로. 그러나, morpholinos는 새로운 단백질의 번역에 영향을 미치지으로 한 분석이 수행되기 전에 내생 단백질 회전율가 발생할 때까지 기다려야 할 것입니다. 단백질의 안정성에 따라, 그 시간부터 일 18 범위 수 있습니다.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어
Acknowledgments
저자는 zebrafish 그들의 관심과 유지 보수에 대한 Zebrafish 연구 직원 Freimann 생명 과학 센터와 센터를 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
References
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