Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow
Summary
Vi viser metoden for å utføre intravital mikroskopi av milten bruker GFP transgene malaria parasitter og kvantifisering av parasitt mobilitet og blodstrøm i dette organet.
Abstract
Ankomsten av intravital mikroskopi i eksperimentelle gnager malaria modeller har gjort store fremskritt til kunnskap om parasitt-vert interaksjoner 1,2. Dermed har in vivo avbildning av malaria parasitter under pre-erythrocytic stadier avslørte den aktive inngangen av parasitter i huden lymfeknuter 3, den fullstendige utviklingen av parasitten i huden 4, og dannelsen av en hepatocytter-avledet merosome å sikre migrasjon og utgivelsen av merozoites i blodet 5. Videre har utviklingen av de enkelte parasitter i erytrocytter nylig blitt dokumentert ved hjelp av 4D-avbilding og utfordret vårt nåværende syn på protein eksport i malaria 6. Dermed har intravital bildebehandling radikalt forandret vårt syn på viktige hendelser i Plasmodium utvikling. Dessverre studier av dynamiske passasje av malaria parasitter gjennom milten, en stor lymfoid organ utsøkt tilpasset for å fjerne infiserte røde blood celler mangler på grunn av tekniske begrensninger.
Bruke murine modell av malaria Plasmodium yoelii i BALB / c mus, har vi implementert intravital avbildning av milten og rapporterte en differensial ombygging av det og etterlevelse av parasitized røde blodceller (pRBCs) til barriere celler fibroblastic opprinnelse i den røde fruktkjøttet under infeksjon med ikke-dødelig parasitt linje P.yoelii 17x i motsetning til infeksjoner med P.yoelii 17XL dødelig parasitt linje 7. For å nå disse konklusjonene, ble en bestemt metodikk bruker ImageJ fri programvare utviklet for å muliggjøre karakterisering av den raske tre-dimensjonal bevegelse av single-pRBCs. Resultater oppnådd med denne protokollen tillater bestemme hastigheten, retningen og oppholdstid av parasitter i milten, alle parametere adressering tilslutning in vivo. I tillegg rapporterer vi metodikken for blodstrøm kvantifisering bruker intravital mikroskopi og bruk av DIFlige fargestoffer å få innsikt i de komplekse microcirculatory strukturen av milten.
Etikk uttalelse
Alle dyrestudier ble utført på dyr fasilitetene på University of Barcelona i samsvar med retningslinjer og protokoller godkjent av komité for forsøk med dyr av University of Barcelona CEEA-UB (protokoll DMAH: 5429). Kvinne BALB / c mus på 6-8 ukers alder ble hentet fra Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
Gjennomføringen av intravital mikroskopi av milten i dette gnager malaria Modellen åpnet muligheten for å undersøke dynamiske passasje av parasitter gjennom dette organet som hittil har vært ansett som en "black-box" på grunn av tekniske hensyn. Her ble det en stor innsats satt til å tilpasse seg en kvantitativ metode som tillater komparativ analyse av ulike parasitter linjer på singel og befolkningen nivåer. I motsetning til andre vev og celler som hadde blitt fotografert tidligere i malaria 3,5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er spesielt takknemlige for S. Graewe og V. Heussler for den innledende opplæring og kontinuerlig innspill i intravital mikroskopi av malaria parasitter, til J. Burns for å donere GFP transgene parasitter, til A. Bosch (confocal Unit, CCiT-UB, IDIBAPS) for bistand i bildeanalyse og kvantifisering og P. Astola for teknisk assistanse. Vi takker R. Tous og I. Caralt for videoproduksjon. MF er en mottaker av en utdannet fellesskap fra generalitet Catalonia. HAP er en ICREA forskning professor. Arbeidet i laboratoriet av HAP er finansiert av Det europeiske fellesskaps sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) under stipend avtale N ° 242 095, av private Foundation Cellex (Catalonia, Spania), og ved det spanske departementet for vitenskap og innovasjon ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
