Summary
نعرض طريقة لأداء intravital المجهري للطفيليات GFP به الطحال الملاريا المعدلة وراثيا والكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم داخل هذا الجهاز.
Abstract
وقد أتاح ظهور المجهري intravital في النماذج التجريبية الملاريا القوارض تقدما كبيرا في المعرفة 1،2 تفاعلات الطفيلي المضيف. وهكذا ، في مجال التصوير المجراة من طفيليات الملاريا خلال مراحل ما قبل الكريات الحمراء وكشفت مدخل نشطة من الطفيليات في الغدد الليمفاوية الجلد 3 ، والتنمية الكاملة للطفيل في الجلد 4 ، وتشكيل merosome الكبدية المستمدة من الهجرة ، وأؤكد الافراج عن merozoites في مجرى الدم 5. وعلاوة على ذلك ، فقد تم تطوير الطفيليات الفردية في كريات الدم الحمراء وثقت به مؤخرا 4D التصوير وتحدى وجهة نظرنا الحالية على التصدير البروتين في 6 الملاريا. وبالتالي ، قد تغيرت جذريا intravital التصوير رأينا في الأحداث الرئيسية في التنمية المتصورة. للأسف ، ودراسات للمرور الدينامية للطفيليات الملاريا من خلال الطحال ، وجهاز تكييف كبرى اللمفاوية المصابة بشكل رائع لمسح أحمر بخلايا lood تفتقر بسبب القيود التقنية.
باستخدام نموذج الفئران من الملاريا المنجلية yoelii في BALB / ج الفئران ، وقمنا بتنفيذ التصوير intravital في الطحال وذكرت إعادة تشكيل الفرق من ذلك وتمسك مطفول خلايا الدم الحمراء (pRBCs) لخلايا المنشأ حاجز ليفية في اللب الأحمر أثناء عدوى غير فتاكة الطفيلي 17X P.yoelii خط مقابل العدوى مع خط 17XL P.yoelii الطفيليات القاتلة 7. للوصول إلى هذه الاستنتاجات ، وضعت منهجية محددة باستخدام ImageJ البرمجيات الحرة لتمكين توصيف حركة ثلاثية الأبعاد من pRBCs سريع المفرد. النتائج التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول يتيح تحديد السرعة ، واتجاهها والإقامة وقت الطفيليات في الطحال ، والتصدي لجميع المعلمات التقيد في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا التقرير منهجية لتقدير حجم تدفق الدم باستخدام المجهر intravital واستخدام DIFferent التلوين وكلاء لاكتساب المعرفة في بنية معقدة من microcirculatory الطحال.
بيان الأخلاق
أجريت جميع الدراسات الحيوانية في مرافق الحيوانية من جامعة برشلونة ، وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات للتجارب على الحيوانات في جامعة برشلونة CEEA - UB (البروتوكول لا DMAH : 5429). وقد تم الحصول على الإناث BALB / ج الفئران من 6-8 أسابيع من العمر من مختبرات نهر تشارلز.
Protocol
وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في 7.
1. عدوى الطفيليات الحيوانية الخضراء مع بروتين فلوري المعدلة وراثيا (GFP)
- وكانت P. yoelii - GFP خطوط المعدلة وراثيا من 17XL 17X ولدت باستخدام نواقل نفسه ، وتستهدف الاستراتيجية وصفت في مكان آخر عن البروتوكولات P. berghei 8. وهي تعبر عن البديل من متحولة 3 9 GFP تحت المروج في كل مكان من P. berghei عامل استطالة 1 (Pbeef1a) ، والذي يوجه التعبير التأسيسية للGFP لطفيلي العصارة الخلوية خلال دورة داخل الكريات الحمر كلها التنموية.
- حقن الحيوانات intraperitoneally مطفول مع خلايا الدم الحمراء (pRBCs) من P. yoelii GFP المعدلة وراثيا ، وخطوط 17XL 17X الحصول عليها من الدم ذيل الفئران المانحة في تطفلن الدم 5-10 ٪ والمخففة في برنامج تلفزيوني. استخدام جرعة من pRBCs 5x10 5 / الماوس للتوصل الى تطفلن الدم المحيطي من 1 ٪ في 3 أيام بعد infectiعلى (بي).
- بي 3 في اليوم ، وتأكد من أن تطفلن الدم من الفئران المصابة مع كل من خطوط الطفيلي هو نفسه من خلال العمل مع مسحة الدم قطرة دم الذيل تليها تلطيخ بالغيمزا والمراقبة تحت المجهر الخفيفة مع هدف النفط 100X. ويقدر تطفلن الدم عن طريق حساب نسبة كرات الدم الحمراء أكثر من pRBCs الإجمالي في ثلاثة حقول بصرية حوالي 300 كرات الدم الحمراء.
- ويمكن استخدام الحيوانات السيطرة حقنوا FITC كرات الدم الحمراء التي تحمل علامات لتوصيف حركة هذه الخلايا في الطحال العادي.
2. وسم من خلايا الدم الحمراء مع FITC والحقن للتحكم في الحيوانات
- جمع 1 مل من الدم الكامل من خلال ثقب في القلب من ماوس BALB / ج في 200 ميكروليتر من PBS تحتوي على حامض الإيثيلين ديامين tetraacetic (EDTA) (100 غرام / لتر ، ودرجة الحموضة 7.4) ، ويغسل بيليه في برنامج تلفزيوني RBC / EDTA (0.1 غرام / L ، ودرجة الحموضة 7.4) عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
- Resuspend 200 ميكروليتر من بيليه في 300 و RBCمو ؛ لتر من PBS / EDTA (0.1 غرام / لتر ، ودرجة الحموضة 8) التي تحتوي على FITC (10 جم / لتر) ، واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع الإثارة لطيف. بعد ذلك الوقت ، تتم إزالة الخلايا طاف وتغسل خمس مرات (300 XG ، 5 دقائق ، RT) في برنامج تلفزيوني / EDTA (0.1 غرام / لتر ، ودرجة الحموضة 7.4).
- لفي التجارب المجراة ، تمييع 10 ميكرولتر من FITC المسمى RBC بيليه في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحقن في الوريد إلى ماوس BALB / ج من أجل التوصل إلى 1 ٪ ، FITC كرات الدم الحمراء في الدورة الدموية.
3. الإجراءات الجراحية
- إعداد حقن مخدر تتألف من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 5 ملغم / كغم من جرعة لكل الميدازولام وفقا لوزن الحيوان. حقن intraperitoneally الفأر مع جرعة واحدة من التخدير. Readminister نصف الجرعة كل 30 دقيقة للحفاظ على الماوس بدوام كامل تخدير.
- الحفاظ على الماوس دافئة والتحقق من أن الفأر هو تخدير تماما (عادة بعد 50-20 دقيقة) عن طريق لوحة معسر القدم قبل المتابعة.
- من أجلتيسير الوريد من المواد خلال التجربة ، يقني ؛ يدخل القنية السياق ذيل الماوس باستخدام قنية 27G. الاختيار الذي تم وضعه جيدا إبرة داخل الوريد عن طريق حقن 20-50 ميكرولتر من المياه المالحة وختم العازلة مع الشريط. إذا كان يعوق ، كرر إقناء ؛ إدخال القنية المنبع من الوريد. كن حذرا حتى لا أعرض فقاعات الهواء.
- يعرض الجزء السفلي من الطحال من خلال شق صغير في الجلد والعضلات في الجانب الأيسر من ظهري الحيوان. مكان الطحال حيث لوحظ أقل حركة التنفس وتطبيق برنامج تلفزيوني على السطح المعرض للحفاظ على نظافتها من الشعر الماوس ورطب.
- ختم غطاء للانزلاق من 60x24mm بمادة لاصقة cyanoacrylate (سوبر الغراء وكتايت - 3) على الجلد المحيطة الطحال للسماح التصور.
4. التصوير من الطفيليات التي تعيش في الطحال
- وأجريت التجارب المجهري Intravital في مجهر لايكا مبائر TCS - SP5 (لايكامايكروسيستمز ، هايدلبرغ ، ألمانيا) مجهزة بنظام الاحتضان مع التحكم في درجة الحرارة ، وهو APO الغمر الجلسرين 63x عدسة الهدف (NA 1.3) ، والماسح الضوئي مدوية في خطوط 8000 / ق والأرجون (488 نانومتر) وHeNe (594 نانومتر ، 633 نانومتر) الليزر. قد تكون هناك حاجة ليزر إضافية ، مثل ديود الزرقاء (405 نانومتر) والصمام الثنائي ضخ الصلبة الدولة (561 نانومتر) ، لإثارة تحقيقات المدرجة في الجدول 1.
- وضع الحيوان على مسرح المجهر مع تغطية تراجع الطحال أسفل إلى الهدف. يمكن أن يكون الرأي العام لهيكل microcirculatory في الطحال تصور اختياريا باستخدام الهدف 20X. وعلى النقيض انعكاس RBC تكون مفيدة لتحديد المناطق المختلفة التي تهم صورة في أعلى التكبير بعد ذلك.
- التركيز على مناطق مختارة من المصالح مع الجلسرين الغمر 63x عدسة الهدف تألق ذاتي باستخدام الأنسجة. ويلاحظ والطفيليات GFP مرورا مناطق مختلفة من الطحال.
- يتم تسجيل مضان على اثنين من مختلف تشاnnels (الإثارة / الانبعاثات الطول الموجي 488/505-580 نانومتر لFITC / GFP و488/570-630 نانومتر للتألق ذاتي الأنسجة) مع مجموعة وحدات ذات الثقب إلى 3.0 إيري. وتستخدم RBC التفكير (488/480-495 نانومتر) ، جنبا إلى جنب مع الأصباغ الفلورية لتسمية الأوعية الدموية في الدم (أنظر الجدول 1) ، للحصول على معلومات إضافية حول المنطقة التي يجري تصويرها في التجارب وتدفق الدم هو موضح أدناه.
- التقاط الصور من خلال خمسة Z - مداخن تغطي عمق 8 ميكرومتر نظرا لأبعاد ثلاثة من الأعضاء ، وبسرعة 8 كيلو هرتز لتوليد أشرطة الفيديو 1.5 دقيقة.
- تسجيل الفيديو من مناطق مختلفة من الطحال للتحليل الكمي.
5. Intravital المجهري للmicrovasculature في الطحال والحصول على الصور لقياس تدفق الدم
- ويمكن حقن مجسات حيوية الفلورسنت المذاب في المياه المالحة متساوي التوتر إلى الوريد الذيل خلال التجربة لصورة الأوعية الدموية واكتساب البصيرة في هيكل الطحال. قائمةتحقيقات وتطبيقها الواردة في الجدول 1 10.
- لتسمية الأوعية الدموية مع ديكستران الفلورسنت ، وإعداد 1 ملغ من 70 كيلو دالتون ديكستران المسمى مع الأحمر في ولاية تكساس 100 ميكرولتر من العازلة المالحة.
- استخدام الوريد الذيل مقنى لحقن ديكستران الفلورسنت للحيوانات التي يجري تصويرها.
- تعيين السفن أفقيا ، في اتجاه المسح بواسطة أشعة الليزر ، التي تناوب المجال البصري (لا تؤثر على السرعة). س ص واستخدام خط XT المسح الضوئي وسائط في التجويف المركزي للسفينة. استخدام المسح الضوئي ثنائي الاتجاه مع خط متوسط ال 32 بسرعة 8 كيلو هرتز للحصول على صورة 512x512 بكسل.
- الحصول على صور من السفن على ثلاث قنوات مختلفة (الإثارة / الانبعاثات الطول الموجي 488/505-580 نانومتر ، 594/605-660 نانومتر ، 488/480-495 نانومتر لFITC / GFP ، الأحمر ديكستران وتكساس والتفكير كرات الدم الحمراء ، على التوالي).
- التقاط صور للسفن بأقطار مختلفة وعلى مراحل مختلفة من دورة القلب للتعويض عن تقلبات. في هذه الصور ، سيتم استخدام الشرائط الناتجة من خلايا تتحرك لقياس تدفق الدم 11.
6. معالجة الصور والتحليل الكمي للحراك به الطفيلي ImageJ البرمجيات
- إنشاء الفيديو في الوقت الحقيقي من تسلسل الصور تم إنشاؤها باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.39o ، واين Rasband ، المعاهد الوطنية للصحة ، www.macbiophotonics.ca ).
- فتح ". ليف" حفظ الملف في ImageJ "xyzct" تسلسل والقنوات المنفصلة.
- تسجيل بعض المعلومات المفيدة من الملف الفوقية : dblvoxelX - فوكسل العرض ، dblvoxelY - فوكسل الارتفاع ، dblvoxelZ - فوكسل متعمقة والفاصل الزمني بين الإطار متتالية Z - إطارات وبين المداخن. وسوف تستخدم هذه المعلومات لأغراض المعايرة.
- طرح تألق ذاتي (قناة 2) إلى الصور GFP - الطفيلي (قناة 1). تصفية الصور مع التمويه الضبابي = 1. يرجى التذكير بأن استخدام تصفية غاوسي طمس الصور في حاجة إلى أن يعلن عن publicatioنانوثانية. حفظ الملف "animal1_m1_substract.seq".
- يتم إنشاء لون الفيديو Z تلوينها كمادة داعمة للتحليل الكمي للتنقل الطفيلي ، كما أنه سيتم تسهيل واحدة لتحديد الهوية في الجسيمات الجسيمات تتحرك بسرعة وتوصيف Z - الحركة.
- تحويل المكدس ل5D صورة ، مع البعد الثالث هو البعد Z والرابع هو الزمن. تعطي لونا مختلفا لكل Z وتراكب.
- المشروع كافة Z باستخدام الشدة القصوى على جميع الأطر الزمنية اللازمة لخلق لون الفيديو Z تلوينها. انقاذ "animal1_m1_Z_color.avi".
- تصنيف وتسمية جميع الجزيئات التي تظهر في لقطة لأول مرة 10 من شريط الفيديو وفقا لعدد من الأطر الإقامة (من 1 إلى 10). في كل فيديو ، سيتم مجنزرة 20 الجسيمات التالية النسب التي حصل عليها. في المجموع ، سيتم كميا 120 الطفيليات من 3 الحيوانات ، وباستخدام ست الفيديو / الحيوان يمثلون مناطق مختلفة من الطحال.
- تقرير الإطارات الإقامة على كل Zوخلال الفيلم بأكمله لجميع الجزيئات لتكون كميا.
- أداء 4D (س ، ص ، ض ، ر) تتبع الخط من الجزيئات باستخدام البرنامج المساعد MTrackJ (كتبه Meijering هاء). فتح ملف "animal1_m1_substract.seq" كما 5D صورة وتعيين خصائص الصورة باستخدام المعلومات المسجلة من قبل عرض بكسل والارتفاع والعمق (في ميكرون) ، والفاصل الزمني المكدس (في ثانية). تكوين إعدادات المسار على النحو التالي : "الانتقال إلى المرة القادمة" و "تطبيق المحلية centroid/25x25pixel المؤشر بين مشرق". عرض تكوين : "تبين المنشأ" ، و "الصورة تظهر" ، "تبين المسار النشط" ، "تبين المسارات موجودة فقط في القنوات الحالية" ، "تظهر فقط مسار نقطة في الوقت الحالي".
- إضافة المسار لكل الجسيمات. تنظر الحركة في محور Z إلا إذا التشرد هو أعلى من 6 ميكرون (القطر المتوسط لpRBC). اتبع الجسيمات خلال مدة أقصاها 100 إطارات.
- حفظ X ، Y ، Z و t الإحداثيات يقاس من المسار بانها "animal1_m1_p1". XLS.
- تدابير لتشريد (D = الجذر التربيعي ((X النهائيس inital) 2 + (ذ ذ inital النهائي) 2 + (Z - Z inital النهائي) 2) ؛ طول المسار (P = Σ ن = 0 → الجذر التربيعي النهائي ((س ن ن س +1) 2 + ( ذ ن ن ص +1) 2 + (ن +1 ض ض ن) 2) مع n تشير إلى موقف كل مجنزرة ، ويمكن حساب السرعة والوقت يعني الإقامة به من قيم س ، ص ، ض ، ر إحداثيات مجنزرة معايرة وفقا للبيانات المسجلة. اتجاهية يعرف من الجسيمات والحاصل التشرد مقابل طول المسار ، مع قيم وثيقة تشير إلى حركة موجهة 1 وقيم مقربة من حركة 0 ضبط النفس مشيرا إلى (12) وتيسير المغلقة قالب لإجراء العمليات الحسابية.
7. حساب تدفق الدم الحجمي
- ويقدر تدفق الدم كما الحجمي Q = V * π * D ت 2 / 4 ، مع الخامس ، وسرعة كرات الدم الحمراء أكثر من مقطع عبورD الثاني والخامس ، التجويف قطرها 11 سفينة.
- V لحساب وقياس الزوايا (θ) من الشرائط five الجسيمات تظهر انعكاس مشرق (RBC) والشرائط الجسيمات تظهر four مخضر (pRBC - GFP) في كل صورة XT ImageJ باستخدام البرمجيات. سفينة القطر قياس التجويف على الصورة س ص.
- ثم أعرب عن سرعة و1/tan V = (θ) * D ه / D الخامس لتطبيع لكرات الدم الحمراء (د ه = 6 ميكرون) وبأقطار السفينة التجويف.
- تحديد الحد الأدنى من ثلاث سفن بأقطار مختلفة ، وخمس صور XT لكل سفينة.
8. التحليل الإحصائي
- تحليل إحصائي عن اتجاهها مؤامرة ، يعني السرعة والوقت وتوزيع كثافة السكن واستخدام اختبار المساواة من بين المتوسطات في STATA (IC10) لتقييم الاختلافات بين السطور الطفيلي اثنين.
9. ممثل النتائج
Intravital IMAوكشف جينج من الطفيليات GFP في الطحال الاختلافات في التنقل بين سلالتين من الطفيليات. وأشار التحليل الكمي خفض التنقل من المعلمات من الطفيليات وحيدة السرعة ، وعدم اتجاهها وزيادة مدة بقاء الطفيليات من الفئران المصابة مع سلالة 17X. علاوة على ذلك ، لم يتم تغييرها الحجمي تدفق الدم في الاوعية بين سلالات 7. ويرد الإجراء التقني في الشكل 1A. 1B الرقم يدل على الرأي العام من الطحال الطبيعي للماوس حقنوا FITC كرات الدم الحمراء التي تحمل علامات ، مع التكبير في اللب الأحمر وأخرى لسفينة (1B الشكل ، والتكبير في 1 و 2 على التوالي). ومما يدل على الأوعية الدموية من خلال ضخ 70 كيلو دالتون ديكستران - تكساس الأحمر مع تباين انعكاس كرات الدم الحمراء. ويمكن استخدام الأصباغ الفلورية الأخرى تلخيصها في الجدول رقم 1 للحصول على معلومات عن الجهاز التي يجري تصويرها ، مثل هويشت (الشكل 1C ، 1D).
وتقدم في الوقت الحقيقي التصوير الطفيليات من سلالة 17XL و17X في أفلام 1 و 2 ،مع بعض - 17X pRBC (فيلم 2) يدل على سلوك المتداول ، دائرة. وقد تحقق التحليل الكمي من المعلمات التنقل من خلال تتبع من الطفيليات الفردية مع مساعدة من الصور الملونة Z تلوينها. الشكل 2A يظهر Z - إسقاط كومة اللون Z تلوينها ، حيث حاصرت الجسيمات يبدو تتحرك في مستويين مختلفين. والرقم 2B 2C تمثل المسارات المختلفة للطفيليات في العدوى 17X و17XL ، على التوالي. وترد النتائج من اتجاهها ووقت إقامة جميع الجسيمات كميا وكثافة خريطة توزيع السكان في الشكل الطفيلي 2D و 2E ، على التوالي. لمراقبة تدفق الدم في الطحال intravital باستخدام المجهر ، تم قياس الشرائط التي تم الحصول عليها في الصور XT من التجويف المركزي السفن الناجمة عن حركة كرات الدم الحمراء لحساب سرعة 11. وتظهر الصور تفحص XY سفينة (الشكل 2F) مع فحص المقابلة خط XT (الشكل 2G).
| مشكله الفلورسنته | التوطين | 1 الإثارة الفوتون (نانومتر) | 2 الإثارة الفوتون (نانومتر) | الكشف عن الانبعاثات (نانومتر) | الكمية / الماوس الوزن |
| هويشت 33342 | غشاء نفيذ الحمض النووي ملزم التحقيق. انها تسميات نوى كل الخلايا (الحية والميتة) بعد الحقن في الوريد. | 405 | 800 | 410-480 | 12.5 غرام / كغ |
| Propidium يوديد | غشاء impermeant الحمض النووي ملزم التحقيق. انها تسميات نوى الخلايا مع غشاء خطر (خلايا أفكارك ونخرية). | 561 | 800 | 570-650 | 250 ملغ / كلغ |
| 70000 مول بالوزن ديكستران - نيون (FITC ، تكساس الاحمر) | السائل التدريجي الذي يعزز علامة على النقيض من البلازما. | FITC تكساس الأحمر 488 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 ملغ / كلغ |
| الصوديوم فلوريسئين | معظم السوائل المرحلة الزلال الذي يعزز علامة على النقيض من البلازما. | 488 | 800 | 500-540 | 2 ملمول / كغ |
| ايفانز الأزرق | معظم السوائل المرحلة الزلال الذي يعزز علامة على النقيض من البلازما. | 633 | الثانية | 645-700 | 20 ملغ / كلغ |
| رودامين R6 | حيوية التحقيق الذي يتراكم في الميتوكوندريا النشطة. انها تسميات بطائن وتعميم الخلايا البيضاء بعد الحقن في الوريد. | 561 | 800 | 570-650 | 25 ملغ / كلغ |
| Fluospheres - 1micron قطر | الخرز التي uptaken بواسطة الخلايا البلعمية مع النشاط. | 488 | 800 | 500-540 | الثانية |
| Alexa488 المسمى سلسلة محددة IIβ الليفين الأضداد | المسبار أن IIβ الليفين تسميات سلسلة | 488 | 800 | 500-540 | 0.3 ملغ / كلغ |
الجدول 1. تحقيقات نيون لintravital المجهري. فلوري الأصباغ حيوي مع تعريب المختلفة التي يمكن استخدامها لتسمية الطحال في الجسم الحي. الإثارة / الانبعاثات (EXC / م) نطاقات لاستخدامه مع فوتون واحد (أو اثنين الفوتون المجهري) يتم توفيرها. يذوب الجرعة المشار إليها في 0،1-0،2 مل من المياه المالحة والعازلة للحقن في الوريد ذيل الفأر. [الثاني : لم تحدد في هذه الدراسة.
الشكل 1. المجهري Intravital في الطحال. ألف لايكا TCS - SP5 المجهر مبائر مع واحد الماوس وضعت على المسرح من المجهر. الماوس والجزء السفلي من الطحال المكشوفة ومختومة مع زلة تغطية باء صورة منطقة ممثل الطحال من الحيوانات غير المصابة حقنوا FITC كرات الدم الحمراء والتي تحمل علامات70 كيلو دالتون دكستران ، تكساس الاحمر لتصور الأوعية الدموية. انعكاس (الصفراء) ، وترد ديكستران (الأزرق) وFITC كرات الدم الحمراء ، (أخضر). ضربة المنبثقة في المربعات البيضاء تمثل المفتوح التداول (1) وعلى مقربة الانتشار (2) المناطق. فتح الانتشار (C) وعلى مقربة الانتشار (D) ملطخة ديكستران 70 كيلو دالتون (الحمراء) ، وهويشت 33342 (الأزرق).
الشكل 2. الكمي لتنقل طفيلي وتدفق الدم. المتردد. ومما يسهل التحليل الكمي للحركة الجسيمات في الأبعاد الأربعة (4D) باستخدام مرمزة معالجة الصور. ألف تعقب أجريت مع عمق المعلومات من الصور الملونة Z - مشفرة ، ممثلة تستخدم الحد الأقصى لكثافة الإسقاط من خمسة أعماق مختلفة. أبيض مستطيل يمثل الجسيمات في نفس النقطة Z مختلفة في وقت واحد. المواقف المختلفة ومن المقرر أن الوقت هفوات بين اكتسابZ من الصور المختلفة. رمز العمق : الأصفر (0 ميكرون) ، البرتقال (2 ميكرون) ، والوردي (4 ميكرون) ، الزرقاء (6 ميكرون) ، والأخضر (8 ميكرومتر) B ، C. توقعات دوام حركة الجسيمات مع كل فاصل زمني الملونة على النحو التالي : رمادي (0-2،4 ثانية) ، سماوي (2،4-4،8 ثانية) ، أرجواني (4،8-7،0 ثانية) ، الحمراء (7،0-9،4 ثانية) والأصفر (9،4-11،8 ثانية). يمثل الخط الأبيض 4D دليل تعقب جزيئات 17X (11.8 ق) (B) و17XL (4.8 ثانية) (C) باستخدام الطفيليات GFP MTrackJ. D ، E. توزيع كثافة الجسيمات التي GFP قيم الاتجاهية (D) و الوقت الإقامة (E). تتوافق البيانات إلى 120 جزيئات كل سطر من الطفيليات و 100 FITC كرات الدم الحمراء التي تحمل علامات من ثلاث تجارب مستقلة تحليلها مع اختبار المساواة من بين المتوسطات. والوساطات و17X/17XL/FITC-RBCs 0.53/0.75/0.85 (D) و4.61/0.67/0.9 ثانية (E). الفروق بين هذين الخطين في
أفلام 1 و 2. الوقت الفاصل بين الصور intravital المجهري للطحال الفئران المصابة 17XL (1) أو 17X (2) GFP - المعدلة وراثيا في الطفيليات تطفلن الدم بنسبة 10 ٪ (Z - أقصى الإسقاط). وتظهر الطفيليات وتألق ذاتي الأنسجة باللون الأخضر والأحمر على التوالي. أشرطة النطاق تمثل 10 ميكرومتر والفاصل الزمني في ثوانى.
ت "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم 1.
انقر هنا لمشاهدة فيلم 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
افتتح تنفيذ المجهري intravital في الطحال في هذه القوارض نموذجا الملاريا إمكانية التحقيق في مرور ديناميكية من الطفيليات من خلال هذا الجهاز الذي تم حتى الآن يعتبر "الصندوق الأسود" نظرا لاعتبارات تقنية. هنا ، وضعت جهدا كبيرا للتكيف مع أسلوب الكمية التي يسمح تحليل مقارن للخطوط الطفيلي مختلفة على الصعيدين احد والسكان. على النقيض من الخلايا والأنسجة الأخرى التي تم تصويرها من قبل في الملاريا 3،5 ، والتصوير مرور pRBCs من خلال الطحال تحتاج إلى أن تأخذ في الاعتبار ثلاثة أبعاد والتقسيم للجهاز ، ووجود التداولات مختلفة مع السريعة والبطيئة تدفق 13 ، فضلا عن السرعات كرات الدم الحمراء السريع. مع هذا الهدف ، تم وضع منهجية محددة عبر الانترنت باستخدام برنامج ImageJ المتاحة لتمكين تتبع واحد الطفيلي ، والتحليل والمقارنة بين التنقل في خطوط populatioن المستوى. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة لتطبيق البرنامج الذي يحل تلقائيا تحديد وتعقب من الطفيليات وحيدة في هذا السياق. من المذكرة ، كانت المعايير المستخدمة لوصف حركة الطفيلي هو موضح سابقا في دراسات أخرى عن الإبلاغ عن التوظيف والتصاق الخلايا اللمفاوية في الجسم الحي 12،14،15. وبالتالي ، ينبغي النظر في هذه المنهجية والمعلمات أداة جديدة لفي الدراسات المجراة في الانضمام الملاريا. في المستقبل ، وسوف نستخدم هذه التكنولوجيا الى التبصر في البيولوجيا المناعية والتفاعلات الخلية الطفيلي الطحال عن طريق العدوى التصوير في التعبير عن جينات الفئران المعدلة وراثيا في خلايا مراسل الفلورسنت مختلفة. وعلاوة على ذلك ، قد يتم استخدام الجيل من الطفيليات وراثيا علامات الإعراب الفلورسنت بخلاف GFP في تركيبة للعدوى المزدوجة في صورة هذا النموذج.
في مجال التصوير فيفو هو أداة قوية لدراسة التفاعل الديناميكي للطفيليات داخل مضيفيهم. ومع ذلك ، هناك السابقينالعديد من العوامل التي تؤثر على التنقل IST الخلية التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. التغييرات في بنية النسيج في الاستجابة للعدوى مع سلالات مختلفة يمكن تعديل المتصورة مرور الخلية والتفاعل مع النسيج 7،16 والخصائص الريولوجية من خلايا الدم الحمراء ، فضلا عن التغيرات في المعلمات الدموية الهيماتوكريت أو غيرها ، يمكن أن تؤثر على تدفق الدم وبالتالي التفاعل مع خلايا الأنسجة. لهذا السبب ، فإننا ننصح لتحليل تدفق الدم السفينة مع الإجراء المنصوص. لتجنب أي آثار الخلط ، ونحن تصوير الطحال من الفئران المصابة عند نقطة عند الساعة الهيماتوكريت ، وreticulocytemia tropism الطفيلي مماثلة في كل من التهابات 7.
حل هذا الأسلوب يسمح لرصد الخلايا الفلورسنت واحدة مرورا الطحال في وقت سابق نقطة (<تطفلن الدم 1 ٪). ومع ذلك ، تم إجراء التحليل الكمي للسلوك الحركي للطفيلياتتطفلن الدم عند 1 ٪ ، شوهدت أعداد كافية من pRBCs عندما تمر عبر الطحال في الوقت الذي تسمح للهفوات تتبع حركة خلية واحدة. في الأفلام 1 و 2 ، والتي تتوافق مع الحيوانات في تطفلن الدم 10 ٪ ، وأظهرت أننا النمط العام للمرور الطفيلي من خلال الطحال في كل عدوى ، ولكن تم إجراء التحليل الكمي من خلايا تتحرك في الأفلام من الحيوانات في تطفلن الدم 1 ٪ ، حيث واحد وتتبع الخلايا بسهولة. نتيجة لحركة ثلاثي الأبعاد السريع لخلايا الدم الحمراء المصابة ، لم نتمكن من التمييز بين مراحل تطور الطفيلي ، كما يمكن أن يعزى مضان كثافات مختلفة لأعماق مختلفة أو الاختراق من الليزر.
مع هذا الإجراء ، يمكن تصور الفلورية الخلايا في المنطقة تحت المحفظة في الطحال ، التي تتألف أساسا من اللب الأحمر 17. باستخدام الأصباغ البلازما ، ويمكننا أن نستشف بين التداولات سريع / بطيء مغلقة و/ فتح اللب الأحمر. دراسات أخرىلقد ذكرت من التصوير الفلورسنت خلايا تي في اللب الأبيض باستخدام مبائر 18 عاما أو عامين الفوتون المجهري 19 ، مع توفير قدر أكبر من مشاركة اختراق الأنسجة. في تلك ، خارج خط تحليل وتوصيف فيفو السابقين للمنطقة التي يجري تصويرها هو عامل مهم لتفسير البيانات بدقة. وبالتالي ، فإن الجهود لتنوير هيكل microcirculatory في الطحال ، وكذلك تطوير تحقيقات تلك التسمية خلايا معينة والهياكل ، هي من الأهمية لتسهيل دراسة التفاعلات الطفيلي المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون بشكل خاص لGraewe S. Heussler وخامسا لبرامج التدريب الأولي والمستمر في مدخلات intravital المجهري للطفيليات الملاريا ، إلى J. بيرنز للتبرع GFP الطفيليات المعدلة وراثيا ، وألف بوش (وحدة متحد البؤر ، CCIT - UB ، IDIBAPS) للحصول على المساعدة في تحليل الصور وتقدير وP. Astola للحصول على المساعدة التقنية. نشكر ر طوس أولا وCaralt لإنتاج الفيديو. MF هو حاصل على زمالة الدراسات العليا من عمومية من كاتالونيا. HAP هو أستاذ البحوث ICREA. ويتم تمويل عمل في مختبر HAP من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) بموجب اتفاق منحة رقم 242095 ، من قبل مؤسسة خاصة سلكس (كاتالونيا ، اسبانيا) ، والاسبانية من قبل وزارة العلوم والابتكار ( SAF2009 - 07760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
