Summary
אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.
Abstract
הופעתו של מיקרוסקופיה intravital במודלים ניסיוניים מלריה מכרסם אפשרה התקדמות גדולה לידיעת 1,2 אינטראקציות טפיל-המארח. לפיכך, הדמיה vivo של טפילי מלריה במהלך טרום האריתרוציטים בשלבים חשפו את הכניסה הפעילה של טפילים לתוך בלוטות הלימפה לעור 3, התפתחות מלאה של הטפיל בעור 4, ויצירת merosome hepatocyte הנגזרות להבטיח הגירה שחרורו של merozoites לתוך זרם הדם 5. יתר על כן, התפתחות של טפילים בודדים אריתרוציטים תועד לאחרונה באמצעות הדמיה 4D תיגר התצוגה הנוכחית שלנו על יצוא חלבון מלריה 6. לפיכך, הדמיה intravital השתנה באופן קיצוני דעתנו על אירועי מפתח בפיתוח Plasmodium. למרבה הצער, מחקרים המעבר הדינאמי של טפילי מלריה דרך הטחול, איבר הלימפה העיקריים מותאם להפליא כדי לנקות אדום נגוע בתאים lood חסרים בשל אילוצים טכניים.
שימוש במודל Murine של המלריה Plasmodium yoelii ב Balb / c עכברים, יישמנו הדמיה intravital של הטחול ודיווח על שיפוץ ההפרש של אותה דבקות parasitized של כדוריות דם אדומות (pRBCs) לתאי מחסום המוצא fibroblastic עיסת אדום במהלך זיהום עם לא קטלני טפיל קו P.yoelii 17x בניגוד זיהומים עם קו 17XL P.yoelii טפיל קטלני 7. כדי להגיע למסקנות האלה, מתודולוגיה ספציפית באמצעות תוכנת ImageJ בחינם פותחה כדי לאפשר אפיון של התנועה תלת מימדי מהיר של יחיד pRBCs. התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מאפשר לקבוע, מהירות כיווניות ומגורים זמן של טפילים הטחול, כל הפרמטרים פונה דבקות in vivo. בנוסף, אנו מדווחים על מתודולוגיה כימות זרימת הדם באמצעות מיקרוסקופ intravital ושימוש אונטערשיידferent צביעה סוכני לקבל תובנות לתוך המבנה microcirculatory מורכבת של הטחול.
משפט ואתיקה
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו במתקני חיה של אוניברסיטת ברצלונה בהתאם להנחיות ופרוטוקולים אושרה על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ברצלונה CEEA-UB (פרוטוקול לא DMAH: 5429). נקבה Balb / c עכברים של 6-8 שבועות של גיל התקבלו צ'ארלס ריבר מעבדות.
Protocol
שיטה זו שימשה במחקר דיווחו 7.
1. בעלי חיים זיהום עם הפלואורסצנט הירוק (GFP) טפילים חלבון מהונדס
- פ yoelii-GFP קווי מהונדס של 17XL ו - 17x נוצרו באמצעות וקטורים עם זאת, אסטרטגיית המיקוד ופרוטוקולים תיאר במקום אחר פ berghei 8. הם מבטאים את גרסה 3 של ה-GFP מוטציה 9 תחת האמרגן בכל מקום של פ berghei התארכות גורם 1 (Pbeef1a), אשר מפנה את הביטוי המכונן של ה-GFP כדי טפיל cytosol במהלך מחזור התוך האריתרוציטים כולו התפתחותית.
- הזרק intraperitoneally חיות עם parasitized כדוריות דם אדומות (pRBCs) של פ ' yoelii-GFP מהונדס קווי 17XL ו - 17x המתקבל דם הזנב של עכברים התורם בבית parasitemia 5-10% בדילול מלא ו-PBS. שימוש במינון של 5x10 5 pRBCs / עכבר להגיע parasitemia היקפי של 1% ביום 3 שלאחר infectiב (PI).
- באותו יום פאי 3, לבדוק כי parasitemia של עכברים נגועים עם שני קווים טפיל הוא עושה זאת על ידי כתם דם עם טיפת דם זנב ואחריו מכתים Giemsa ותצפית במיקרוסקופ אור במטרה שמן 100x. Parasitemia מוערך על ידי חישוב אחוז pRBCs מעל RBCs סך בשלושה תחומים אופטי של כ 300 RBCs.
- חיות בקרת הזריקו FITC שכותרתו RBCs ניתן לאפיין את התנועה של תאים אלה spleens נורמלי.
2. תיוג של כדוריות דם אדומות עם FITC הזרקת לשלוט חיות
- איסוף 1 מ"ל של דם דרך מסך לנקב לב של עכבר Balb / c ב 200 μl של PBS המכיל אתילן diamine חומצה tetraacetic (EDTA) (100 גר '/ ל', pH 7.4) ו לשטוף את גלולה RBC ב PBS / EDTA (0.1 גר '/ ל ', pH 7.4) באמצעות צנטריפוגה ב XG 300 במשך 5 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
- Resuspend 200 μl של גלולה RBC ב 300 μ l של PBS / EDTA (0.1 גר '/ ל', pH 8) המכיל FITC (10 גר '/ L) דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך עם תסיסה עדינה. לאחר זמן, supernatant היא להסיר את התאים שטף חמש פעמים (300 XG, 5 דקות, RT) ב-PBS / EDTA (0.1 גר '/ ל', pH 7.4).
- עבור בניסויים vivo, לדלל 10 μl של FITC שכותרתו RBC גלולה ב 200 μl של PBS ו להזריק לווריד עכבר Balb / c כדי להגיע 1% FITC-RBCs במחזור.
3. כירורגי פרוצדורות
- הכן הרדמה בזריקות מורכב 100 מ"ג / ק"ג של קטמין ו - 5 מ"ג / ק"ג של מנה לכל Midazolam על פי משקלו של בעל החיים. להזריק את intraperitoneally עכבר עם מנה אחת של חומר הרדמה. Readminister חצי מנה כל 30 דקות כדי לשמור על העכבר במשרה מלאה בהרדמה.
- שמור על העכבר חמים ולוודא כי העכבר הוא מורדם לחלוטין (בדרך כלל לאחר 50-20 דקות) על ידי צובט את כרית כף הרגל לפני שתמשיך.
- על מנתלהקל עירוי לוריד של חומרים במהלך הניסוי, cannulate את הווריד הזנב של העכבר באמצעות צינורית 27G. בדוק את המחט היא ממוצבת היטב על ידי הזרקת 20-50 μl של חיץ מלוחים בתוך הווריד וסוגרים אותו עם הקלטת. אם זה מפריע, לחזור על cannulation במעלה הזרם של הווריד. היזהר לא להכניס בועות אוויר.
- לחשוף את החלק הנחות של הטחול דרך חתך קטן בעור השרירים בצד שמאל הגבי של החיה. מניחים את הטחול שבו התנועה פחות נשימה הוא ציין וליישם PBS על פני השטח חשוף כדי לשמור על נקיונו של השיער העכבר התייבשות.
- חותם כיסוי פליטת 60x24mm עם דבק cyanoacrylate (Super Glue-3 Loctite) על העור המקיף את הטחול כדי לאפשר ויזואליזציה.
4. הדמיה של טפילים החיים הטחול
- ניסויים במיקרוסקופיה Intravital בוצעו מיקרוסקופ TCS-SP5 confocal לייקה (LeicaMicrosystems, היידלברג, גרמניה) מצויד במערכת דגירה עם בקרת טמפרטורה, טבילה APO 63x גליצרול המטרה העדשה (NA 1.3), סורק תהודה ב 8000 שורות / s ו - ארגון (488 ננומטר) HeNe (594 ננומטר, 633 ננומטר) לייזרים. לייזרים נוספים, כגון דיודות הכחול (405 ננומטר) דיודה משאבת-מצב מוצק (561 ננומטר), עשויות להידרש עירור של בדיקות הרשומים בטבלה 1.
- מניחים את חיה על הבמה של המיקרוסקופ עם כיסוי החליק הטחול כלפי מטה אל המטרה. מבט כללי על מבנה microcirculatory של הטחול יכול להיות אופציונלי דמיינו באמצעות אובייקטיבי 20x. לעומת זאת RBC השתקפות יהיה מועיל לבחור אזורים שונים של עניין לתמונה בהגדלה גבוהה יותר לאחר מכן.
- התמקדות באזורים נבחרים של עניין עם טבילה 63x עדשה אובייקטיבי גליצרול באמצעות autofluorescence רקמות. טפילים GFP הם נצפו עובר דרך אזורים שונים של הטחול.
- Fluorescence נרשם על שני צ'ה שוניםnnels (עירור / פליטה 488/505-580 גל nm עבור FITC / GFP ו 488/570-630 ננומטר עבור autofluorescence רקמות) עם להגדיר את חריר כדי 3.0 יחידות אוורירי. RBC השתקפות (488/480-495 ננומטר), יחד עם צבעי ניאון לתייג את הדם בכלי הדם (ראה לוח 1), משמשים כדי לקבל מידע נוסף על האזור להיות צילמו וגם את זרימת הדם הניסויים המתוארים להלן.
- צלמו תמונות דרך חמישה Z-ערימות כיסוי לעומק של 8 מיקרומטר בגלל ממדיות שלוש של האיבר, במהירות של kHz 8 להפיק קטעי וידאו של 1.5 דקות.
- קטעי וידאו שיא של אזורים שונים של הטחול על ניתוח כמותי.
5. מיקרוסקופיה Intravital של microvasculature של הטחול ורכישת תמונה למדידת זרימת הדם
- בדיקות ניאון ויטל מומס מלוחים איזוטוני יכול להיות מוזרק אל וריד הזנב במהלך הניסוי לדימוי תובנה vasculature ולהשיג לתוך המבנה של הטחול. רשימהבדיקות ויישומן מוצג בלוח 1 10.
- התווית מערכת כלי הדם עם פלורסנט dextran, להכין 1 מ"ג של 70 kDa dextran שכותרתו עם טקסס האדום μl 100 של המאגר מלוחים.
- השתמש וריד הזנב cannulated להזריק את dextran ניאון החיה להיות הדמיה.
- הגדר את כלי אופקית, לכיוון של סריקת לייזר, על ידי סיבוב השדה אופטי (לא משפיע על מהירות). השתמש xy ו xt קו סריקה מצבים של לומן המרכזי של הספינה. השתמש סריקה דו כיוונית עם ממוצע שורה של 32 במהירות של kHz 8 כדי להשיג תמונה של 512x512 פיקסלים.
- לרכוש תמונות של כלי על שלושה ערוצים שונים (עירור / פליטה גל 488/505-580 ננומטר, 594/605-660 ננומטר, 488/480-495 ננומטר עבור FITC / GFP, dextran טקסס האדום השתקפות כדורית אדומה, בהתאמה).
- קחו תמונות של כלי בקטרים שונים על שלבים שונים של מחזור הלב כדי לפצות על תנודות. בתמונות הללו, פסים הנובע תאים נעים ישמש לכמת את זרימת הדם 11.
6. עיבוד תמונה וניתוח כמותי של ניידות טפיל ImageJ באמצעות תוכנת
- יצירת וידאו בזמן אמת מתוך רצף הדימוי שנוצר באמצעות ImageJ התוכנה (גירסה 1.39o, וויין Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca ).
- פתח את ". Lif" קובץ ImageJ שמירה "xyzct" רצף ערוצי מופרדים.
- הרשמה מידע שימושי מקובץ מטה: dblvoxelX-voxel רוחב, dblvoxelY-voxel גובה, dblvoxelZ-voxel מעמיק המרווח בין מסגרת רצופים Z-מסגרות בין ערימות. מידע זה ישמש לצורך כיול.
- הפחת autofluorescence (ערוץ 2) על התמונות GFP-טפיל (ערוץ 1). סנן את התמונות עם Gaussian Blur = 1. נא לזכור כי Gaussian לטשטש באמצעות מסנן תמונות צריך להיות הכריז על publications. שמור את הקובץ "animal1_m1_substract.seq".
- וידאו Z-מקודד צבע נוצר כחומר תומכת ניתוח כמותי של ניידות טפיל, כמו זה יקל יחיד החלקיקים זיהוי חלקיקים זז מהר ו-Z תנועה אפיון.
- המר את הערימה על תמונה 5D, עם ממד שלישי שהוא ממד Z והרביעי לעת עתה. תנו צבע שונה לכל Z ואת כיסוי.
- פרויקט כל Z באמצעות עוצמת המרבי על כל מסגרות זמן כדי ליצור וידאו Z-מקודד צבע. שמור בשם "animal1_m1_Z_color.avi".
- לסווג תווית כל החלקיקים המופיעים לראשונה 10 מסגרות של וידאו לפי מספר מסגרות מגורים (מ 1 עד 10). בסרטון אחד, 20 חלקיקים תעקוב אחרי הפרופורציות שהושגו. בסך הכל, 120 טפילים יהיה לכמת מ 3 בעלי חיים, בעזרת שש קטעי וידאו / בעלי חיים המייצגים אזורים שונים של הטחול.
- דו"ח מסגרות המגורים על כל Zמעל הסרט כולו עבור כל החלקיקים להיות לכימות.
- בצע 4D (x, y, z, t) מעקב ידני של חלקיקים באמצעות תוסף MTrackJ (שנכתב על ידי E. Meijering). פתח את הקובץ "animal1_m1_substract.seq" כמו תמונה 5D ו להגדיר מאפייני התמונה באמצעות המידע הרשום לפני מ - פיקסל רוחב, גובה, עומק (ב מיקרומטר) ואת מרווח מחסנית (בתוך שניות). קבע את הגדרות המסלול כדלקמן: "לעבור בפעם הבאה" ו "להחיל המקומי הסמן בהיר centroid/25x25pixel". הגדרת מציג: "להראות מקור", "להראות תמונה", "להראות מסלול פעיל", "להראות רק שירים נוכח ערוצי הנוכחית", "להראות רק לעקוב אחר נקודה בזמן הנוכחי".
- הוספת מסלול עבור כל חלקיק. שקול התנועה ציר Z-רק אם העקירה הוא גבוה יותר מאשר 6 מיקרומטר (הקוטר הממוצע עבור pRBC). בצע את החלקיקים מעל למקסימום של 100 מסגרות.
- שמור את x, y, z ו-t קואורדינטות נמדד מן המסלול כמו "animal1_m1_p1". Xls.
- צעדים עקירה (D = SQRT ((x הסופיInital-x) 2 + (y-y inital הסופי) 2 + (z-z inital הסופי) 2); אורך הדרך (P = Σ n = 0 → SQRT הסופי ((x n +1-x n) 2 + ( n y 1-y n) 2 + (z n 1-z n) 2) עם n המציין כל עמדה מעקב; מהירות מתכוון זמן מגורים יכול להיות מחושב באמצעות הערכים x, y, z, t קואורדינטות מעקב מכויל לפי הנתונים הרשומים. כיווניות של חלקיקים מוגדרת כמנה של עקירה לעומת אורך הדרך, עם ערכים של קרוב ל 1 תנועה מכוונת המציין וערכים של קרוב ל 0 תנועה מאופקת המציין 12. תבנית לחישובים הוא הקל סגורה.
7. חישוב זרימת הדם volumetric
- זרימת הדם נפחית נאמדת Q = V * π * D v 2 / 4, עם V, מהירות כדורית אדומה על חתךnd D v, בקוטר של 11 לומן כלי שיט.
- כדי לחשב את V, למדוד את זוויות (θ) של חמישה פסים החלקיקים מראה השתקפות מבריק (RBC) וארבעה פסים החלקיקים מראה פלואורסצנטי ירוק (pRBC-GFP) בתמונה כל xt באמצעות תוכנת ImageJ. מדידת קוטר כלי לומן על התמונה xy.
- מהירות היא הביעה אז V = 1/tan (θ) * D e / D v לנרמל עבור כדורית אדומה (ד e = 6 מיקרומטר) ואת קוטר כלי לומן.
- לכמת מינימום של שלושה כלי בקטרים שונים חמש תמונות xt עבור כל ספינה.
8. ניתוח סטטיסטי
- עבור סטטיסטי כיווניות, ניתוח העלילה, כלומר מהירות וזמן מגורים כמו הפצות צפיפות להשתמש במבחן השוויון-of-חציונים ב Stata (IC10) כדי להעריך את ההבדלים בין שני הקווים טפיל.
9. נציג תוצאות
Intravital imaגינג של טפילים GFP הטחול חשף הבדלי ניידות בין שני זנים של טפילים. ניתוח כמותי של פרמטרים הניידות של טפילים חד הצביעו מופחת מהירות, חוסר כיווניות מגורים בתוספת הזמן של טפילים של עכברים נגועים בזן 17x. יתרה מכך, זרימת הדם בכלי volumetric לא היה שונה בין זני 7. ההליך הטכני מוצג באיור 1 א. 1B איור מראה מראה כללי של הטחול רגיל של עכבר הזריקו FITC שכותרתו RBCs, עם זום ב לתוך עיסת אדום אחר כלי (איור 1B, זום 1 ו -2, בהתאמה). Vasculature העידו על ידי הזרקת 70 dextran טקסס kDa האדום יחד עם ניגודיות השתקפות כדורית אדומה. צבעי ניאון אחרים לסכם בטבלה 1 ניתן להשתמש כדי לקבל מידע על האיבר להיות הדמיה, כגון Hoechst (תרשים 1C, 1D).
בזמן אמת הדמיה של טפילים של המתח 17XL ו - 17x מוצג סרטים 1 ו -2,עם כמה 17x-pRBC (סרט 2) מראה התנהגות מעגל מתגלגל-. ניתוח כמותי של פרמטרים הניידות הושג באמצעות מעקב של טפילים הפרט בעזרת Z-מקודד תמונות צבע. איור 2A מראה Z-השלכה של מחסנית Z-מקודד צבע, שבו החלקיקים מוקף מופיע נעים במישורים שונים. איור 2B ו - 2C מייצגים את המסלולים עבור טפילים שונים זיהום 17x ו - 17XL, בהתאמה. תוצאות מ כיווניות הזמן מגוריו של כל החלקיקים לכמת מוצגות כמפה צפיפות התפלגות האוכלוסייה טפיל באיור 2 ד ו 2E, בהתאמה. כדי לעקוב אחר זרימת הדם בתוך הטחול באמצעות מיקרוסקופ intravital, פסים המתקבל בתמונות xt של לומן המרכזי של כלי הנובע התנועה כדורית אדומה נמדדו כדי לחשב מהירות 11. התמונות מראות סריקה xy של כלי (איור 2F) עם המקבילה xt קו סריקה (איור 2G).
| פלורסנט probדואר | לוקליזציה | 1 פוטון עירור (ננומטר) | 2 פוטון עירור (ננומטר) | פליטת זוהה (ננומטר) | כמות / משקל העכבר |
| Hoechst 33342 | ממברנה permeant-DNA מחייבת בדיקה. זה תוויות הגרעינים של כל התאים (מת לחיות) לאחר מתן תוך ורידי. | 405 | 800 | 410-480 | 12.5 גרם / ק"ג |
| Propidium יודיד | ממברנה impermeant-DNA מחייבת בדיקה. זה הגרעינים של תאים תוויות עם הממברנה נפגעת (תאים אפופטוטיים, נמקי). | 561 | 800 | 570-650 | 250 מ"ג / ק"ג |
| 70,000 mol wt dextran-פלורסנט (FITC, טקסס האדום) | נוזל שלב סמן זה משפר הניגודיות של פלזמה. | FITC 488 טקסס אדום 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 מ"ג / ק"ג |
| נתרן והעמסת | סמן גורפת נוזל שלב אלבומין זה משפר הניגודיות של פלזמה. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / ק"ג |
| אוונס כחול | סמן גורפת נוזל שלב אלבומין זה משפר הניגודיות של פלזמה. | 633 | nd | 645-700 | 20 מ"ג / ק"ג |
| Rhodamine R6 | בדיקה ויטל שמצטבר במיטוכונדריה פעיל. זה תוויות endothelia והפצת תאים לבנים לאחר הזרקה תוך ורידית. | 561 | 800 | 570-650 | 25 מ"ג / ק"ג |
| Fluospheres-1micron בקוטר | חרוזים כי הם uptaken ידי תאים עם פעילות phagocytic. | 488 | 800 | 500-540 | nd |
| Alexa488 שכותרתו שרשרת ספציפיים הפיברין IIβ נוגדן | כי בדיקה תוויות הפיברין שרשרת IIβ | 488 | 800 | 500-540 | 0.3 מ"ג / ק"ג |
טבלה 1. בדיקות פלורסנט עבור מיקרוסקופיה intravital. צבעי ניאון ויטל עם לגרסאות המגוירות שונים שעשויים לשמש את התווית הטחול in vivo. עירור / פליטה (EXC / em) טווחי לשמש עם פוטון (או שני הפוטונים מיקרוסקופיה) מסופקים. המינון המוצע הוא מומס 0.1-0.2 מ"ל של חיץ מליחים מוזרק אל וריד את הזנב של העכבר. [Nd: לא נקבע במחקר זה.
באיור 1. מיקרוסקופיה Intravital של הטחול. א לייקה TCS-SP5 מיקרוסקופ confocal עם העכבר האחת מונחת על הבמה של המיקרוסקופ. העכבר יש את החלק הנחות של הטחול חשוף חתום להחליק-לכסות. B. מקדימה של אזור נציג של הטחול של בעלי חיים שאינם נגועים הזריקו FITC שכותרתו RBCs ו70 dextran טקסס kDa האדום לדמיין את כלי הדם. השתקפות (צהוב), dextran (כחול) ו-FITC RBCs (ירוק) מוצגים. Blow-קופצים קופסאות לבן מייצגים במחזור פתוח (1) ולסגור את זרימת הדם (2) אזורים. במחזור הפתיחה (C) קרוב במחזור (ד ') מוכתם 70 kDa dextran (אדום) Hoechst 33342 (כחול).
באיור 2. כימות ניידות טפיל ואת זרימת הדם. AC. ניתוח כמותי של תנועת החלקיקים בארבע מימדים (4D) הוא הקל על ידי שימוש בצבעים עיבוד התמונה. מעקב אחר א 'בוצע עם המידע מתוך עומק Z-מקודד תמונות צבע, המיוצג באמצעות הקרנת עוצמה מקסימלית של חמש בעומקים שונים. לבן מלבן המייצג את החלקיקים באותו Z שונה בנקודה אחת בזמן. עמדות שונות בשל פערי הזמן בין הרכישהתמונות שונות של Z. קוד עומק:. הצהוב (0 מיקרומטר), כתום (2 מיקרומטר), ורוד (4 מיקרומטר), כחול (6 מיקרומטר), ירוק (8 מיקרומטר) B, C. תחזיות זמן של תנועת החלקיקים עם רווח בכל פעם בצבע כמו: אפור (0-2.4 שניות), ציאן (2.4-4.8 שניות), מגנטה (4.8-7.0 שניות), אדום (7.0-9.4 שניות) וצהוב (9.4-11.8 שניות). הקו הלבן מייצג 4D מעקב ידני של חלקיקים של 17x (11.8 s) (ב) ו - 17XL (4.8 שניות) (ג) טפילים GFP באמצעות MTrackJ. D, E. התפלגות צפיפות החלקיקים GFP על ידי ערכים של כיווניות (D) זמן מגורים (E). נתונים מקבילים 120 חלקיקים של כל שורה של טפילים 100 RBCs FITC שכותרתו משלושה ניסויים עצמאיים ניתח במבחן השוויון-of-חציונים. חציונים 17X/17XL/FITC-RBCs הם 0.53/0.75/0.85 (D) 4.61/0.67/0.9 שניות (E). הבדלים בין שני הקווים
סרטים 1 ו 2. זמן לשגות תמונות מיקרוסקופיה intravital של הטחול Murine נגוע 17XL (1) או 17x (2) ה-GFP-מהונדס טפילים parasitemia ב 10% (Z-המרבי הקרנה). טפיל ו autofluorescence רקמות מוצגים ירוק ואדום בהתאמה. ברים סולם מייצגים 10 מיקרומטר ו מרווח הזמן הוא שניות.
v "> לחצו כאן כדי לצפות בסרט 1.
לחץ כאן כדי לצפות בסרט 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יישום של מיקרוסקופיה intravital של הטחול במודל זה מלריה מכרסם פתחה את האפשרות לחקור את המעבר הדינאמי של טפילים באמצעות איבר זה שעד עתה נחשב "קופסה שחורה" בשל שיקולים טכניים. כאן, מאמץ גדול הושם להתאים שיטה כמותית המאפשרת ניתוח השוואתי של קווי טפיל שונה ברמות יחיד האוכלוסייה. לעומת רקמות ותאים אחרים שהיו צילמו לפני כן מלריה 3,5, הדמיה מעבר pRBCs דרך הטחול צריך לקחת בחשבון את שלושת ממדיות ואת מידור של האיבר, נוכחות תפוצה שונים עם מהירות איטית השטף 13, כמו גם את מהירויות כדורית אדומה מהירה. במטרה זו, מתודולוגיה ספציפית באמצעות תוכנת זמין באינטרנט ImageJ פותחה על מנת לאפשר מעקב טפיל יחיד, ניתוח ניידות והשוואה בין השורות את population רמה. עם זאת, היישום של תוכנה אוטומטית הפותר זיהוי ומעקב של טפילים חד בהקשר זה עדיין יש צורך. ראוי לציין, הפרמטרים המשמשים לתיאור ניידות טפיל תוארו בעבר במחקרים אחרים לדווח על גיוס הלימפוציטים הדבקה in vivo 12,14,15. לפיכך, מתודולוגיה זו ופרמטרים צריך להיחשב כלי חדש ל במחקרים vivo של הדבקות ב מלריה. בעתיד, נוכל להשתמש בטכנולוגיה זו כדי לקבל תובנה Immunobiology ו-טפיל הטחול אינטראקציות התא על ידי זיהום הדמיה העכברים הטרנסגניים לבטא גנים הכתב ניאון בתאים שונים. יתר על כן, הדור של טפילים מהונדס המבטא סמנים ניאון אחר מאשר ה-GFP ניתן להשתמש בשילוב לזיהומים תמונה כפול במודל זה.
בשנת vivo הדמיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את יחסי הגומלין דינמי של טפילים בתוך מארחיהם. עם זאת, יש לשעברמספר גורמים המשפיעים על ניידות ist התא חייב להילקח בחשבון. שינויים בארכיטקטורה רקמות כתגובה לזיהומים שונים עם זנים Plasmodium יכול לשנות מעבר תא ואינטראקציה עם רקמות 7,16 ואת המאפיינים rheological של כדוריות דם אדומות, כמו גם שינויים בפרמטרים המטולוגיות המטוקריט או אחר, יכול להשפיע על זרימת הדם ולכן האינטראקציה של תאים עם הרקמה. מסיבה זו, מומלץ לנתח את זרימת הדם בכלי עם ההליך המוצע. כדי למנוע תופעות בלבול, אנו צילמו את הטחול של עכברים נגועים בנקודת זמן שבו המטוקריט, reticulocytemia ו טפיל כמיהות דומה בשני זיהומים 7.
הרזולוציה של טכניקה זו מאפשרת תצפית של תאים פלורסנט בודד עובר דרך הטחול בנקודות זמן קודמות (<parasitemia 1%). עם זאת, ניתוח כמותי של ההתנהגות הדינמית של טפילים בוצעהב parasitemia 1%, בכמות מספקת של pRBCs כאשר נצפו עובר דרך הטחול על נסיגות זמן המאפשרים מעקב אחר תנועת תא בודד. בסרטים 1 ו -2, אשר מתאימות חיות בבית parasitemia 10%, הראינו את התבנית הכללית של מעבר הטפיל דרך הטחול זיהום כל, עם זאת, ניתוח כמותי של תאים נעים בוצעה סרטים מחיות parasitemia ב 1%, כאשר אחד התאים אחריו בקלות. בשל התנועה תלת מימדי מהיר של נגועים בתאי דם אדומים, לא יכולנו להבחין בין שלבי ההתפתחות של הטפיל, כמו עוצמות הקרינה השונים ניתן לייחס בעומקים שונים או חדירות של הלייזר.
בנוהל זה, תאים פלורסנט ניתן דמיינו באזור subcapsular של הטחול, מורכבת בעיקר עיסה אדומה 17. באמצעות צבעי פלזמה, אנחנו יכולים להבחין בין תפוצה מהיר / איטי סגור / פתוח של עיסת האדום. מחקרים אחריםיש הדמיה דיווחה של פלורסנט T-תאים עיסת לבן באמצעות confocal 18 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה 19, עם ההנפקה האחרונה חדירה לרקמות גדולה יותר. באותן, off-line ניתוח ואפיון vivo לשעבר של אזור להיות הדמיה היא גורם חשוב במדויק לפרש את הנתונים. לפיכך, מאמצים להאיר את המבנה microcirculatory של הטחול, כמו גם פיתוח של בדיקות כי התווית תאים ספציפיים ומבנים, הם בעלי חשיבות כדי להקל על מחקר של טפיל-מארח אינטראקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה במיוחד ס Graewe וו 'Heussler לאימונים הראשוני קלט רציף במיקרוסקופ intravital של טפילי מלריה, כדי ג'יי ברנס על תרומת ה-GFP טפילים מהונדס, א' בוש (יחידת Confocal, CCiT-UB, IDIBAPS) סיוע בניתוח תמונה וכימות ועל פ Astola לקבלת סיוע טכני. אנו מודים tous ר Caralt I. עבור הפקת וידאו. MF הוא מקבל מלגת בוגר בכלליות של קטלוניה. הפ הוא פרופסור מחקר ICREA. עבודה במעבדה של הפ ממומנת על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) מענק לפי הסכם N ° 242095, על ידי קרן פרטית CELLEX (קטלוניה, ספרד), ועל ידי משרד ספרדית למדע וחדשנות ( SAF2009-07760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
