Vi visar metoden för att utföra intravital mikroskopering av mjälte med GFP transgena malariaparasiter och kvantifiering av parasiten rörlighet och blodflödet i detta organ.
Tillkomsten av intravital mikroskopi i experimentella modeller gnagare malaria har gjort stora framsteg i kunskapen om parasit-värd interaktioner 1,2. Därmed har in vivo imaging av malariaparasiter under pre-erytrocyt steg avslöjade aktiva ingången av parasiter i noderna huden lymfkörtlar 3, den fullständiga utvecklingen av parasiten i huden 4, och bildandet av en hepatocyte som härrör merosome att försäkra migration och utsläpp av merozoites i blodet 5. Dessutom har utvecklingen av enskilda parasiter i erytrocyter har nyligen dokumenterats med hjälp av 4D avbildning och utmanade vår nuvarande syn på protein export i malaria 6. Därför har intravital imaging förändrats radikalt vår syn på viktiga händelser i Plasmodium utveckling. Tyvärr studier av dynamiska passage av malariaparasiter genom mjälten, en stor lymfoida organ anpassas vackert att rensa infekterade röda bLood celler saknas på grund av tekniska begränsningar.
Använda mus modell av malaria Plasmodium yoelii i BALB / c möss har vi genomfört intravital avbildning av mjälte och rapporterade en differentiell omdaning av den och följsamhet av parasiterade röda blodkroppar (pRBCs) till barriär celler fibroblastic ursprung i den röda massan under infektion med icke-dödliga parasiten line P.yoelii 17x till skillnad från infektioner med P.yoelii 17XL dödliga parasiten rad 7. För att nå dessa slutsatser, var en särskild metod med ImageJ fri programvara utvecklas för att möjliggöra karakterisering av snabba tredimensionella rörelse enda pRBCs. Resultat som erhållits med det här protokollet kan bestämma hastighet, riktning och uppehållstid av parasiter i mjälten, alla parametrar med inriktning på följsamhet in vivo. Dessutom rapporterar vi metoden för blodflödet kvantifiering med hjälp av intravital mikroskopi och användning av olikaolika färgämnen att få insikt i den komplexa mikrocirkulationen strukturen av mjälte.
Etik uttalande
Alla djurförsök utfördes på djuret faciliteterna på universitetet i Barcelona i enlighet med riktlinjer och protokoll har godkänts av den etiska kommittén för djurförsöksnämnden vid universitetet i Barcelona CEEA-UB (protokoll nr DMAH: 5429). Kvinna BALB / c möss av 6-8 veckors ålder erhölls från Charles River Laboratories.
Genomförandet av intravital mikroskopi av mjälte i denna gnagare malaria modell öppnat möjligheten att undersöka den dynamiska passage av parasiter genom detta organ som hittills ansetts vara en "black-box" på grund av tekniska överväganden. Här inne var en stor insats sätter att anpassa en kvantitativ metod som tillåter jämförande analys av olika parasit rader vid enstaka och befolkning nivåer. I motsats till andra vävnader och celler som hade avbildad tidigare i malaria 3,5 behöver…
The authors have nothing to disclose.
Vi är särskilt tacksamma mot S. Graewe och V. Heussler för grundutbildning och kontinuerlig inmatning i intravital mikroskopi av malariaparasiter, till J. Burns för att donera GFP transgena parasiter, till A. Bosch (Confocal Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) för att få hjälp inom bildanalys och kvantifiering och P. Astola för tekniskt stöd. Vi tackar R. Tous och jag Caralt för videoproduktion. MF är mottagare av en examen stipendium från det generella i Katalonien. HAP är en ICREA forskning professor. Arbete i laboratorium HAP finansieras av Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr 242.095, av de privata stiftelsen Cellex (Katalonien, Spanien), och av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation ( SAF2009-07.760).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |