Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors

doi: 10.3791/3612 Published: January 4, 2012

Summary

Typ B gelatin-baserade konstruerad nanovectors system (Gens) var utvecklad för systemisk gen leverans och transfektion vid behandling av cancer i bukspottskörteln. Genom modifiering med epidermal tillväxtfaktor (EGFR) särskilda peptid på ytan av nanparticles kunde de rikta om EGFR-receptorn och släpp plasmid i reducerande miljö, exempelvis höga intracellulära glutation koncentrationer.

Abstract

Mer än 32.000 patienter får diagnosen pankreascancer i USA varje år och sjukdomen är förknippad med mycket hög dödlighet 1. Akut behov finns för att utveckla nya kliniskt översättas terapeutiska strategier som kan förbättra den dystra överlevnad statistiken för patienter med pankreascancer. Även om genterapi vid cancer har visat en oerhörd löfte är den stora utmaningen i utvecklingen av säkra och effektiva leveranssystem, vilket kan leda till varaktig transgenen uttryck.

Gelatin är ett av de mest mångsidiga naturliga biopolymerer, ofta används i livsmedel och läkemedel. Tidigare studier från vårt laboratorium har visat att typ B gelatin kunde fysiska kapsla in DNA, som bevarade supercoiled struktur plasmiden och förbättrad transfektion effektivitet vid intracellulär leverans. Genom thiolation av gelatin, kunde sulfhydryl grupper föras in i polymeren och skulle fOrm disulfide obligationer inom nanopartiklar, som stabiliserar hela det komplexa och när disulfide obligation är bruten på grund av förekomsten av glutation i cytosolen, skulle nyttolast släppas 2-5. Poly (etylenglykol) (PEG)-modifierad Gens, när det ges i den systemiska cirkulationen, ger lång cirkulation tider och företrädesvis mål för att tumören massa på grund av den hyper-permeabiliteten i kärlnybildningens genom förbättrad permeabilitet och behålla effekten 6. Studier har visat överdrivet uttryck för epidermal tillväxtfaktor (EGFR) på Panc-1 humana celler i bukspottkörteln adenocarcinom 7. För att aktivt rikta bukspottkörteln linje cancercell var EGFR specifik peptid konjugerade på partikel ytan genom en PEG spacer 8.

De flesta anti-tumör genterapi är inriktade på förvaltning av tumörsuppressorgener, såsom vildtyp p53 (WT-p53), för att återställa pro-apoptotiska funktion i cellerna 9 10. I bukspottkörtelcancer, de flesta celler har mutationer i p53, vilket leder till förlust av apoptotiska aktivitet. Med införandet av WT-p53 kan apoptos repareras och ytterligare triggers celldöd i cancerceller 11.

Baserat på ovanstående grund, har vi utformat EGFR riktar peptid-modifierade thiolated gelatin nanopartiklar för WT-p53-genen leverans och utvärderas leverans effektivitet och transfektion i Panc-1 celler.

Protocol

1. Beredning av Plasmid DNA Inkapslade EGFR-Targeted Gelatin Nanopartiklar

  1. Syntes av thiolated gelatin
    1. Thiolated gelatin var syntetiseras som tidigare metoden 2-5, genom kovalent konjugering med 2-iminothiolane på primära aminogrupper av typ B gelatin. 1 gram gelatin upplöstes i 100 ml avjoniserat vatten och inkuberas med 20 mg 2-iminothiolane hydroklorid i rumstemperatur i 15 timmar.
    2. Oreagerad reagens avlägsnas genom dialys mot 5 mM HCl-lösning, följt av 1 mM HCl-lösning i 3 timmar vardera. Renat thiolated gelatin var frystorkad och förvaras vid 4 ° C för vidare användning.
  2. Preparation av DNA som innehåller nanopartiklar
    1. 200 mg thiolated gelatin upplöstes i vatten och pH lösning var justeras till 7 genom tillsats av 0,2 M NaOH-lösning. 1mg DNA inkom och försiktigt blandat med gelatin lösning.
    2. Kyld etanol lades långsamt i smeten medanomrörning lösning med hög hastighet. Nanopartiklar bildades när lösningsmedlet sammansättning ändras till 75% vattenkraft alkoholhaltiga lösningen.
    3. Nanopartiklar har ytterligare tvärbunden genom långsam tillsats av 0,1 ml 8% (v / v) glyoxal lösning. Oreagerad reagenser var släckt med 0,5 ml 0,2 M glycin lösning.
    4. Nanopartiklar var ultra-centrifugeras vid 16.000 rpm i 30 minuter. Pellets sköljdes med avjoniserat vatten två gånger och renat nanopartiklar var frystorkade och lagras vid 4 ° C.
  3. Ytbearbetning av nanopartiklar
    1. Nanopartiklar avbröts i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) med koncentration på 10 mg / ml och inkuberas med 2 gånger vikten av metoxi-PEG-succinimidyl karboxi metylester (MPEG-SCM, MW 2000 Da) eller maleimide-PEG-succinimidyl karboxi metyl (MAL-PEG-SCM, MW 2000 Da) i 2 timmar vid rumstemperatur med långsam omrörning.
    2. PEGylerat nanopartiklar har samlats in med ultra-centrifugering vid 16.000 rpm i 30 minuterS. Pellets sköljdes med avjoniserat vatten två gånger och renat nanopartiklar var frystorkade och lagras vid 4 ° C.
    3. MAL-PEG-SCM modifierad nanopartiklar avbröts i 0,1 miljoner fosfatbuffert (pH 6,5) med koncentrationen 10mg/ml och inkuberas med 10% i vikt av EGFR specifik peptid (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) under 6 timmar i rumstemperatur med långsam omrörning.
    4. Peptide modifierad nanopartiklar har samlats in med ultra-centrifugering vid 16.000 rpm i 30 minuter. Pellets sköljdes med avjoniserat vatten två gånger och renat nanopartiklar var frystorkade och lagras vid 4 ° C.

2. Karakterisering av EGFR-riktade Nanopartiklar

  1. Partikelstorlek och zeta potential mätning
    Nanopartiklar avbröts i vatten med koncentration av 1mg/ml. Fjädring analyserades med hjälp av Zetasizer Nano (Malvern Inc). Analys av partikelstorlek utfördes vid en spridning i 90 graders vinkel vid 25 °C. Zeta potential uppmättes till standard parametrar för dielektricitetskonstant, brytningsindex och viskositet för vatten vid 25 ° C.
  2. Svepelektronmikroskopi
    Frystorkad nanopartiklar var monterade på aluminium prov montera och spotta-belagda med palladium för att förbättra ledningsförmågan och minimera uppbyggd av avgifter. Prover observerades för ytan morfologi under en Hitachi 4800 fältemission svepelektronmikroskop vid 3 kV.
  3. Electron spektroskopet för kemisk analys (ESCA)
    Frystorkad formulering av kontroll var pegylerat och peptid uppdaterad nanopartiklar analyseras av ESCA. Det var som utförs på nationell ESCA och Surface Analysis Center för biomedicinska problem (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA).
    1. Proverna placerades i ultrahög vakuum och som utsätts för låg-energi röntgen stråle, vilket framkallade ett utsläpp av sekundär fotoelektronerna från ytan.
    2. Genom att rita antal upptäckta elektroner som funktion av binding energi, observerade spektrumet topparna var tilldelas varje kemiska komponenter.
    3. Högupplöst analys av C1s spektra utfördes för att fastställa exakta kemiska sammansättningen av kolväten (CC eller CH på 285mV), eter (CO) i 286.4mV) och karbonyl (C = O på 288,1 mV), och den relativa sammansättningen av varje funktion bestämdes av ytan under kurvan.
  4. Stabilitet av inkapslat plasmid
    Stabiliteten i det inkapslade plasmid-DNA bekräftades genom att köra den extraherade DNA på prefabricerade geler. Nanopartiklarna var kokas med 0,2 mg / ml proteas som innehåller PBS (30 min vid 37 ° C) och 0,2 E / ml DNAse (10min vid rumstemperatur) separat, samtidigt eller efter varandra. Prover sedan lastas ombord på 1,2% agarosgel (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) vid en koncentration av 100ng/well i ett 18μL volym per brunn. Naked plasmid laddades som kontroll och gel kördes vid 75 V under 30 minuter. Kodak Digital röntgen Specimen (DXS) system användes för att visualisera Bands med UV transluminescence.
  5. Fastställande av plasmid lastning
    Plasmid inkapslade nanopartiklar avbröts på 1mg/ml och kokas med 0.2mg/ml proteas vid 37 ° C i 30 minuter. Lösningen blev centrifugeras vid 13.000 rpm i 10 minuter och supernatanten samlades in och testades för plasmid koncentration med Picogreen analys (Invitrogen). Inkapsling uppgick beräknas genom att dividera den inkapslade plasmiden koncentration med den initiala lastning 0,5% (w / w).

3. In vitro Transfektion studier i Panc-1 bukspottkörtelcancer celler

  1. Cellodling villkor
    Panc-1 och Capan-1 bukspottkörteln adenokarcinom cellinjer var SKOV3 äggstockarna adenokarcinom cellinje och NIH-3T3 murin fibroblast cellinje från ATCC. Panc-1 och NIH-3T3 odlades med DMEM levereras med L-glutamin, Pen-STREP och 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C och 5% CO 2, medan Capan-1 krävs DMEM levererade 20% fetalt bovint serum.SKOV3 odlades i RPMI-1640 levereras med 10% fetalt bovint serum.
  2. Western blot analys för EGFR-uttryck
    1. Cell lysates samlades in från 2 miljoner celler och analyseras för total proteinkoncentration använda BCA analys (Pierce). NIH-3T3 användes som negativ kontroll och SKOV3 användes som positiv kontroll för EGFR-uttryck.
    2. 10 mikrogram av det totala protein extrakt kördes på prefabricerade natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) system vid 135V i 90 minuter.
    3. Därefter var gel överförs till PVDF membran av iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).
    4. Membran var blockerad med 5% fettfri mjölk i Tween-innehållande Tris-buffert saltlösning (TBS-T) i 1 timme i rumstemperatur.
    5. Membran skars och inkuberas med 1:1,000 spädning av primära kanin beta-aktin antikroppar och 1:1,000 spädning av primära antikroppar kanin EGFR sig över natten vid 4 ° C.
    6. Membran var sedan tvättas två gånger medTBS-T och inkuberas med 1:2,000 spädningar av sekundära anti-kanin pepparrot peroxidaskonjugerade IgG i TBS-T för 1 timme i rumstemperatur.
    7. Efter sköljning överskott antikroppar med TBS, t och vatten, var 4 ml ECL substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) till och inkuberas med membran i 5 minuter.
    8. Kemiluminiscent band har sedan visualiseras med Kodak Digital röntgen Specimen (DXS) system.
  3. Cellviabiliteten studier med olika formuleringar
    1. Panc-1 celler odlades i 96-brunnar vid 10000 celler per väl i 200μL i kompletterats DMEM natten.
    2. Tillväxten medelstora ersattes med serum fria medier innehåller olika koncentrationer av nanopartiklar med 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml. 1mg/ml PEI, en känd cytotoxiska katjoniska polymer, användes som positiv kontroll.
    3. Cellerna behandlades med 200μL nanopartiklar för 6 timmar och sedan ersättas med 20μL MTS reagens och 100μL komplettodlingsmedia.
    4. Efter inlägg inkubation i 3 timmar vid 37 ° C i 5% CO 2, var absorbans formazanförening produkt mäts vid 490nm med Biotek SynergyHT plattläsaren (Winooski, VT).
    5. Andelen livskraft celler uttryckt som förhållandet mellan absorbans polymer behandlade cellerna jämfört med negativ kontroll (0mg/ml) multiplicerat med 100 och ritas som funktion av polymer koncentrationer.
  4. Cell människohandel studier
    1. Rhodamine B isotiocyanat (RBITC) användes för att konjugat på thiolated gelatin genom reaktion med amin grupp. Efter dialys och frystorkning, märkt RBITC thiolated gelatin användes för nanopartiklar beredning.
    2. Innan desolvation var 25μL PicoGreen blandat med 1 mg plasmid i 1 minut och märkta plasmider lades till gelatin lösning. Olika formuleringar gjordes efter den tidigare metoden.
    3. Panc-1 celler odlades i 6-brunnars plattor med skyddsglas-slips med 200.000 celler pER bra. Efter natten tillväxten var 2 ml av märkt nanopartiklar behandlas i varje brunn med koncentration på 1mg/ml i serum fria medium.
    4. Efter olika tidpunkter, från 15 minuter till 6 timmar, var medelstora ersatts med odlingsmedium som innehåller 1μg/ml av Hoest 33.342 (Invitrogen) i 15 minuter inkubation vid rumstemperatur. 2 ml 4% paraformaldehyd lösning ersattes i varje brunn för att åtgärda celler. Celler sedan tvättas med PBS två gånger.
    5. Coversilps var monterade på objektglas. Laserskanning konfokala fluorescensmikroskopi användes för att ta bilder av fasta celler.
  5. Kvalitativ bestämning av transfektion effektivitet genom fluorescensmikroskopi med pEGFP-N1 inkapslade nanopartiklar
    1. pEGFP-N1 plasmider var inkapslade i nanopartiklar och svävande i serum fria medier med koncentration motsvarande 10 mikrogram plasmider per ml för ytterligare behandlingar.
    2. Panc-1 var celler som odlas över natten i 6-bra plattor behållarenNing skyddsglas-slips med 200.000 celler per brunn. 2 ml pEGFP-N1 plasmider inkapslade nanopartiklar behandlades i varje brunn. 20μg av plasmider blandades med 20μl Lipofectin, katjoniska lipid transfektion reagens, och det användes som positiv kontroll, medan obehandlade celler användes som negativ kontroll.
    3. Cellerna inkuberades med olika formuleringar för 6 timmar.
    4. Medium ersattes med odlingsmedium och celler efter transfekterade för 24, 48, 72 och 96 timmar.
    5. Efter efter transfektion, var medelstora ersatts med odlingsmedium som innehåller 1μg/ml av Hoest 33.342 (Invitrogen) och inkuberas med celler i 15 minuter i rumstemperatur.
    6. Täckglas var monterade på objektglas och uttryck av GFP i de celler observerades av fluorescensmikroskop. Differential interferenskontrast (DIC) och fluorescens bilder som förvärvats med hjälp Olympus BX61 mikroskop och digitala bilder har bearbetats med Image J programvara.
  6. pEGFP-N1 plasmider var inkapslade i nanopartiklar och svävande i serum fria medier med koncentration motsvarande 10 mikrogram plasmider per ml för ytterligare behandlingar.
  7. Panc-1 var celler som odlas över natten i 6-bra plattor med 200.000 celler per brunn. 2 ml pEGFP-N1 plasmider inkapslade nanopartiklar behandlades i varje brunn. 20μg av plasmider blandades med 20μl Lipofectin, katjoniska lipid transfektion reagens, som användes som positiv kontroll och obehandlade celler användes som negativ kontroll.
  8. Cellerna inkuberades med olika formuleringar för 6 timmar.
  9. Medium ersattes med odlingsmedium och celler efter ruvade i 24, 48, 72 och 96 timmar.
  10. Efter efter transfektion, var cell lysates in från varje brunn och analyseras för total proteinkoncentration använda BCA analys (Pierce).
  11. brunnar var coaTed med 100μl av 1:1000 spädningar av monoklonala anti-GFP antikroppar i varje brunn. Efter 2 timmars inkubering var plattan tvättas med PBS-0.5% (w / v) Tween-80 för 4 gånger.
  12. 300μl TBS blockering buffertar lades i varje brunn och inkuberas i 2 timmar. Då plattan var sedan tvättas med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 för 4 gånger.
  13. 30 mikrogram av proteiner i varje grupp har lagts in i plattan och inkuberas över natten vid 4 °. Då plattan var sedan tvättas med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 för 4 gånger.
  14. 100μl av 1:2400 spädningar av sekundära anti-GFP antikroppar jämfört med alkalisk fosfatas lades till varje brunn och inkuberas i 1 timme. Då plattan var sedan tvättas med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 för 4 gånger.
  15. 100μl alkaliskt fosfatas substrat lades till varje brunn och inkuberas i 30 minuter till 1 timme. Tavla mättes med Biotek Synergy HT plattläsaren för absorbans vid 405nm.
  16. Uttryckt GFP koncentration rapporterades som nanogram per millligrams av det totala protein.
  • Kvalitativ bestämning av transfektion effektivitet genom RT-PCR med WT-p53 plasmid inkapslade nanopartiklar
    1. WT-p53 plasmider var inkapslade i nanopartiklar och svävande i serum fria medier med koncentration motsvarande 10 mikrogram plasmiden per ml för ytterligare behandlingar.
    2. Panc-1 var celler som odlas över natten i 6-bra plattor med 200.000 celler per brunn. 2 ml WT-p53 plasmider inkapslade nanopartiklar behandlades i varje brunn. 20μg av plasmider blandades med 20μl Lipofectin, katjoniska lipid transfektion reagens, som användes som positiv kontroll och obehandlade celler användes som negativ kontroll.
    3. Cellerna inkuberades med olika formuleringar för 6 timmar.
    4. Medium ersattes med odlingsmedium och celler efter ruvade i 48 timmar.
    5. mRNA utvanns från varje brunn med High Pure RNA isolation kit (Roche, Indianapolis, IN) och mätt med Nanodrop 2000 (Thermo vetenskapliga, Wilminton, DE).
    6. RT-PCR gjordes genom att använda QIAGEN Ett steg RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). Grundfärger för p53, Bax, Bcl-2, beta-aktin, DR5, Apaf-1, Puma, var Survivin syntetiseras av Eurofins MVM operon (Huntsville, AL).
    7. PCR-produkterna utvärderades med gelelektrofores och pixlar av cDNA band analyserades med ImageJ programvara.
  • Kvantitativ bestämning av terapeutiska effektivitet med WT-p53 palsmid inkapslade nanopartiklar
    1. WT-p53 plasmid var inkapslade i nanopartiklar och svävande i serum fria medier med koncentration motsvarande 10 mikrogram plasmider per ml för vidare behandling.
    2. Panc-1 var celler som odlas över natten i 6-bra plattor med 200.000 celler per brunn. 2 ml WT-p53 plasmider inkapslade nanopartiklar behandlades i varje brunn. 20μg av plasmider blandades med 20μl Lipofectin, katjoniska lipid transfektion reagens, som användes som positiv kontroll och obehandlade celleranvänds som negativ kontroll.
    3. Cellerna inkuberades med olika formuleringar för 6 timmar.
    4. Medium ersattes med odlingsmedium och celler efter ruvade i 24, 48, 72 och 96 timmar.
    5. Kromatin Kondens / permeabilitet / Dead apoptos Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) användes för att märka apoptotiska celler, nekrotiska celler och levande celler med olika färgämnen.
    6. iCys Research Imaging cytometern från CompuCyte (Westwood, MA) användes för att analysera och jämföra apoptos nivåer efter behandling. Baserat på fluorescens mikroskopiska bilder, var intensiteten hos alla färger registreras och ritas sedan räknas och de procentsatser för olika populationer beräknas var.
    7. Jämfört med den negativa kontrollen, vilket betyder att det inte fanns någon behandling för cellerna var apoptotiska celler vik förändringar beräknas ut och som anges i grafen.
    8. 3.8.8 Apo-ONE Homogen caspase-3 / 7 Assay Kit (Promega, Madison, WI) användes för att undersöka pro-apoptotiska aktivitet efter transfektion av WT-p53 plasmid. 1mg/ml PEI användes som negativ kontroll för att eliminera alla apoptotiska aktivitet. Efter efter transfektion, var celler som behandlats med Rhodamine 110, bis-(N-CBZL-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparaginsyra amid, Z-DEVD-R110), som är ett substrat för kaspas 3 / 7, upp till 18 timmar.
    9. Tavla mättes med Biotek Synergy HT plattläsaren för fluorescens vid 490/520 nm. Baserat på intensiteten i grön fluorescens, kan pro-apoptotiska verksamheten utvärderas.
  • 4. Representativa resultat

    1. Syntes och Chatacterization av EGFR Riktade Nanopartiklar

    EGFR riktade peptid-modifierade nanopartiklar var syntetiseras som programmet visade i figur 1. Nanopartiklar som utarbetats av desolvation präglades för partikelstorlek och zeta potential. Den genomsnittliga storleken och ytladdning av partiklar framställda av thiolated gelatinmed olika grader av thiolation är listade i tabell 1. Den genomsnittliga partikel diameter olika nanopartiklar var mellan 150-250 nm. Thiolated nanopartiklar har mindre storlek jämfört med gelatin nanopartiklar, kanske på grund av disulfide bron bildas inuti partiklar. Med olika ytor modifieringar har storlekar av nanopartiklar ökat. Zeta potentialer av olika formuleringar var cirka -20 mV. Med SEM analys var storlekar ytan morfologi och sfäriska form av nanopartiklar som observerats och motsvarande Zetasizer resultat. DNA lastning effektivitet i gelatin nanopartiklar och thiolated gelatin nanopartiklar var högre än 95% (tabell 1).

    Figur 1
    Figur 1. Kemisk reaktionsteknik Scheme, illustrerar ytbearbetning av thiolated gelatin nanopartiklar med epidermal tillväxtfaktor factor (EGFR) bindande peptid genom en poly (etylenglykol) (PEG) spacer.

    Karakterisering av nanopartiklar

    Formulering Nanopartiklar Diameter (nm) Zeta Potential (mV) Plasmid-DNA Loading Verkningsgrad (%)
    Gel NP 151,4 ± 23,5 -17,1 ± 5,23 95,6 ± 2,2
    SH-Gel NP 132,6 ± 17,9 -24,6 ± 5,16 97,0 ± 3,8
    SH-Gel-PEG 179,0 ± 30,9 -22,3 ± 9,50 95,8 ± 6,5
    SH-Gel PEG Peptide 230,8 ± 41,5 -18,1 ± 4,02 94,8 ± 5,1

    TABLE 1. Partikelstorlek, ytladdning och plasmid-DNA inkapsling effektiviteten av kontroll och EGFR-riktade gelatin och thiolated gelatin nanopartiklar.

    Högupplöst C 1S skanningar av elektron spektroskopi för kemisk analys (ESCA) användes för att analysera ytan komponent thiolated gelatin (SH-Gel NP), PEG-modifierade thiolated gelatin (SH-Gel PEG) och EGFR riktar peptid-modifierade thiolated gelatin nanopartiklar (SH-Gel PEG Peptide). Resultaten i tabell 2 visar topp intensiteten hos CH (kolväten), CO (eter) och C = O (karbonyljärn) grupper på 285,0, 286,3 och 288,1 eV, respektive. Etern CO-signalen har ökat efter PEG modifiering och minskade efter peptid konjugering. Även kväve sammansättning har minskat efter PEG modifiering och ökade efter peptid ändring, som bekräftade förekomsten av EGFR-inriktade peptid på nanopartiklar. ESCA analys har ytterligare bekräftat PEG och peptid ytmodifiering.

    Elektronspektroskopi för kemisk analys av nanopartiklar ytsammansättning

    Formulering C 1s (%) O-1s (%) N 1s (%)
    SH-Gel NP 59,3 ± 0,8 22,9 ± 0,5 12,9 ± 0,1
    SH-Gel-PEG 58,2 ± 0,6 28,0 ± 1,2 9,5 ± 0,7
    SH-Gel PEG Peptide 56,7 ± 0,8 25,9 ± 0,7 12,3 ± 0,6
    Formulering CC (%) CO, N (%) C = O (% )
    SH-Gel NP 51,5 26,6 21,9
    SH-Gel-PEG 17,1 63,1 19,8
    SH-Gel PEG Peptide 33,1 42,8 24,1

    Tabell 2. C 1S högupplösta scanningar av elektron spektroskopi för kemisk analys (ESCA)

    För att undersöka stabiliteten i inkapslade plasmid var nanopartiklar som behandlats med proteashämmare eller DNAse separat simuntaneously eller efter varandra. Efter elektrofores, har resultaten i Figur 2 visar att plasmid-DNA inkapslade i alla nanopartiklar är skyddade av nanopartiklar och stabila, jämförbara med nakna plasmid-DNA. Dessa studerat har visat att alla dessa nanopartiklar kan samla och bevara plasmid strukturen efter inkapsling.

    / Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
    Figur 2. Stabilitet för plasmid-DNA inkapslade i thiolated gelatin, thiolated PEG-modifierade gelatin, och EGFR peptid-modifierad thiolated gelatin nanopartiklar med agarosgelelektrofores. Nanopartiklarna behandlades med 0,2 mg / ml proteas att bevisa plasmid-DNA inkapsling inom nanopartiklar matris

    2. Baseline EGFR-uttryck i bukspottkörtelcancer celler

    Två människor bukspottskörteln adenokarcinom cellinjer (Panc-1 och Capan-1) analyserades med Western blot för EGFR-uttryck. Mänskliga äggstockarna adenokarcinom (SKOV3) och murina fibroblast ((NIH-3T3-celler) valdes som positiva och negativa kontroller, respektive. Analyserades som protein Lastkontroll Beta-aktin. Panc-1 celler har visat högre EGFR-uttryck jämfört med Capan-1 och denna cellinje användes sedan för följande in vitro-studier

    3. Cytotoxicitet av Kontroll och SurfaCE-Ändrad Thiolated Gelatin Nanopartiklar

    För att utvärdera cellulär interaktion av nanopartiklar har cytotoxicitet analyser genomfördes efter behandling med nanopartiklar. Baserat på resultaten i figur 3, både kontrollen och ytan modifierade nanopartiklar var relativt trygga och biokompatibla i Panc-1 celler även vid höga koncentrationer, med jämförelse med PEI. Följande studier har genomförts med 1mg/ml nanopartiklar.

    Figur 3
    Figur 3. Percent cellviabiliteten som en funktion av koncentrationer nanopartikelformulering i Panc-1 celler utvärderas genom tetrazolium färgämne (MTS) analys

    4. Receptor medierad Cell Upptag i Panc-1 celler

    För att bekräfta yta tillgängligheten av EGFR-inriktade peptid och receptormedierad endocytotic upptag av nanopartiklar, var ett system som utformats genom märkning varje component med olika fluorescens för visualisering av nanopartiklar upptag och handel med celler. Med detta märkningssystem kan plasmid-DNA, nanopartiklar och cellkärna identifieras. Laserskanning konfokala fluorescensmikroskopi användes för att ta bilder vid olika tidpunkter, från 15 minuter till 6 timmar. Genom att jämföra bilder av olika formuleringar visade peptid konjugerade gelatin nanopartiklar den snabbt upptag och plasmid ut inom 30 minuter. Detta resultat visade vidare att EGFR peptid-konjugerade nanopartiklar genomgick underlättas endocytos med snabb interaktion mellan EGFR specifika peptiden och receptorer EGFR på cellytan, vilket var mycket snabbare, jämfört med andra nanopartiklar, som genomgick icke-specifik endocytos.

    Cell Trafficking Study

    Figur 4
    Figur 4. Confocal fluorescensmikroskopi enalysis av DNA-inkapslade nanopartiklar upptag och handel med Panc-1 celler. (Röd = Rhodamine-märkt nanopartiklar, grön = PicoGreen-märkt plasmid-DNA, och blå = DAPI-märkta kärna). Lasern makten var 7 gånger mindre under de sista fyra siffrorna i undre panelen.

    5. Kvalitativ och kvantitativ in vitro-Transfektion med Enhanced grönt fluorescerande protein

    ELISA i Figur 5 och fluorescens mikroskopisk analys av figur 6 användes för att mäta kvalitativa och kvantitativa effektiviteten GFP tranfection i Panc-1 celler vid tillförsel av omodifierade, PEG-modifierade och EGFR peptid-modifierad thiolated gelatin nanopartiklar. Plasmider levereras av EGFR-riktade nanopartiklar resulterade i den högsta nivån av GFP uttryck efter 48 timmar i förhållande till andra kontroller, inklusive Lipofectin-komplexbundet DNA.

    Figur 5
    Figur 5. GFP uttryck ennalyzed med ELISA ritas som en funktion av tid efter administrering av plasmid-DNA i kontroll och EGFR-riktade nanopartiklar.

    Fluoresence mikroskopisk analys för GFP transfektion

    Figur 6
    Figur 6. Kvalitativ analys av grönt fluorescerande proteinet uttryck i Panc-1 celler genom epifluoresence mikroskopi efter 24, 48, 72 och 96 timmar efter transfektion med EGFP-N1. Lipofectin-DNA-komplex användes som positiv kontroll.

    6. In vitro Tranfection med vildtyp p53 Plasmid i Panc-1 celler

    Vildtyp p53 plasmider pORF-hp53, med EF-1α / HTLV hybrid promotor utvanns från E. coli och inkapslade i nanopartiklar för att studera apoptotiska terapeutisk effekt. Panc-1 var celler som behandlats med partiklar i 6 timmar och efter transfekterade för ytterligare 24, 48, 72 och 96 timmar.

    Sedan p53 kan inducera apoptos i celler och för att åstadkomma denna funktion skulle många nedströms transkriptionsfaktorer vara med och direkt regleras av uttryck av WT-p53. Bland dem skulle Bax, caspase-3, caspase-9, DR5, Puma och Apaf-1 vara upp-regleras uttrycket av p53 och medan Bcl-2, skulle Survivin vara nere reglerade. För att undersöka nivåerna av dessa transkriptionsfaktorer, var mRNA ur Panc-1 celler efter 48 timmar efter transfektion och används för RT-PCR. Produkterna utvärderades med gelelektrofores och band analyserades med ImageJ. Baserat på resultaten visade i Figur 7 minskade Survivin betydligt med behandling av EGFR thiolated riktade gelatin nanopartiklar jämfört med andra behandlingar, inte fanns någon uppenbar förändring ses i Bcl-2, Bax och uttryck för caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA och Apaf-1increased med riktade nanopartiklar behandling.

    les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
    Figur 7. MRNA nivåer nedströms faktorer av WT-p53 uttryck jämfördes med RT-PCR efter 48 timmar efter transfektion.

    Efter WT-p53 transfektion, var Chromatin Kondens / permeabilitet / Dead apoptos kit används för att skilja apoptotiska celler, nekrotiska celler och levande celler med olika färgämnen. iCys Research Imaging cytometern från CompuCyte (Westwood, MA) användes för att analysera och jämföra apoptos nivåer efter behandling. Jämfört med den negativa kontrollen var apoptotiska celler gånger förändringar beräknas ut och som anges i Figur 8. EGFR-riktade thiolated gelatin nanopaticles har visat den högsta apoptotiska cellpopulation efter efter transfektion. Analys av caspase 3 / 7 aktivitet visade också att EGFR-riktade nanopartiklar hade snabba internationalisering och högsta apoptotiska aktivitet i Panc-1 celler.

    Figur 8 Figur 8. Cytometrisk analys av pro-apoptotiska aktivitet kontroll WT-p53 transfekterade Panc-1 celler med iCys ° Imaging flödescytometer

    Discussion

    Kontroll och EGFR riktade thiolated gelatin nanopartiklar var beredda med effektiva DNA inkapsling och stabilitet. Partiklar av alla dessa system var i intervallet 150-250 nm i diameter. Zeta potential har visat att detta system är en svagt negativ system. Med SEM analys, var storleken på nanopartiklar samma sak med Zetasizer resultat. ESCA analys kunde bekräfta PEG och peptid ytmodifiering.

    Western blot-analys visade att Panc-1 celler hade en hög EGFR-uttryck och denna cellinje användes för in vitro-studier. Både kontroll och ytan modifierade nanopartiklar var relativt mindre cytotoxiska i Panc-1 celler jämfört med PEI.

    Cell människohandel studier visade snabbt upptag och plasmid frisättning av EGFR-riktade nanopartiklar i Panc-1 celler. Leverans av reporter plasmider DNA uttrycker med EGFR-riktade nanopartiklar resulterade i högstaGFP uttryck i förhållande till andra kontroller, inklusive Lipofectin-komplexbundet DNA. Med samma system, utlöst transfektion med WT-p53 plasmid nedströms apoptotiska vägen och inducerad snabb apoptos i Panc-1 celler.

    Dessa preliminära resultat tyder på att EGFR-riktade thiolated gelatin nanopartiklar kan fungera som ett säkert och effektivt DNA leveranssystem för genterapi som behandling för cancer i bukspottkörteln.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgments

    Denna studie stöddes av National Cancer Institute har alliansen i Nanoteknik för Cancer Center for Cancer Nanoteknik Excellence (CCNE) bevilja U54-CA151881.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Type B gelatin, Bloom 225 Sigma-Aldrich G9391
    2-iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256
    pEGFP-N1 plasmid Elim Biopharm N/A
    pORF-hp53 E. coli Invitrogen porf-hp53
    Glyoxal solution (40wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 128465
    Glycine Sigma-Aldrich 410225-250G
    QIA filter Plasmid Mega kit Qiagen 12281
    Beckman LE 80K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. N/A
    FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems Labconco Corp. 7753020
    mPEG-SCM, MW 2,000 Da Laysan Bio Inc. mPEG-SCM-2K-1g
    MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da Jenkem Technology A5001-1
    Zetasizer Nano Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS
    Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope Hitachi S-4800 UHR FE-SEM
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits Invitrogen P7589
    Lipofectin Transfection Reagent Invitrogen 18292011
    DMEM Mediatech, Inc. 10 013 CM
    RPMI Mediatech, Inc. 50 020 PB
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    iBlot Dry Blotting System Invitrogen IB1001
    XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 32109
    Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System Kodak N/A
    CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega Corp. G3580
    BioTek SynergyHT plate reader BioTek N/A
    Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    One-step RT-PCR kit Qiagen 210212
    Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen V23201
    Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit Promega Corp. G7790
    Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    EGF Receptor Antibody Cell Signaling Technology 2232
    β-Actin Antibody Cell Signaling Technology 4967
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074
    Mouse Monoclonal GFP Antibody Novus Biologicals NB600-597
    Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) Novus Biologicals NB600-1502
    Phosphatase Substrate Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 37620

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
    2. Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
    3. Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
    4. Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
    5. Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
    6. Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
    7. Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
    8. Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
    9. McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
    10. Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
    11. Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
    Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).More

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter