Summary
이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 <10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.
Abstract
인플루엔자 바이러스는 세계의 여러 지역에서 병적 상태와 사망률 매년 높은 학위를 일으키는 호흡기 병원체이다. 따라서 임상 샘플 방대한 숫자의 감염 변형 및 신속한 높은 처리량 검사의 정확한 진단 유행성 감염의 확산을 제어할 답해야 해요. 인플루엔자 감염 현재 임상 진단은 serologic 검사, 중합 효소 사슬 반응, 직접 표본 immunofluorescence 및 세포 배양 1,2를 기준으로합니다.
여기서는 라이브 인플루엔자 바이러스를 검색하는 데 사용 소설 진단 기술의 발전을보고합니다. 우리는 MDCK 세포에게 4를 사용하여이 기술의 효능을 테스트하는 마우스 적응 인간 A/PR/8/34 (PR8, H1N1) 바이러스 3 사용됩니다. MDCK 세포는 (물론 지당 10 4 ~ 5 × 10 3) 96에서 배양해 있었다 - 또는 PR8 및 바이러스성 단백질에 감염된 384 잘 접시는 IR 염료 복합 초에 의해 안티 M2 다음을 사용하여 발견되었습니다ondary 항체. M2 5 적혈구응집소 1은 다양한 진단 assays에 사용되는 두 가지 주요 마커 단백질입니다. 채용 IR-염료 복합 이차 항체는 다른 형광 염료와 관련된 autofluorescence을 최소화. 안티 M2 항체의 사용은 우리가 바이러스 수량의 직접적인 메트 릭으로 항원에 특정한 형광 강도를 사용하도록 허용했다. 형광 강도를 열거하기 위해 우리는 LI-COR 오디세이 기반 적외선 스캐너를 사용했습니다. 이 시스템은 fluorophores을 파악하고 배경 잡음에서 그들을 차별화하기 위해 두 채널의 레이저 기반 적외선 탐지를 사용합니다. 첫 번째 채널은 680 nm의에서 흥분과 배경을 계량하기 위해 700 nm의에서 방출. 두 번째 채널은 780 nm의에서 fluorophores 그 자극을 감지 및 800 nm의에서 내보냅니다. 적외선 스캐너의 PR8에 감염된 MDCK 세포 검사는 바이러스 titer 종속 밝은 형광을 지적했다. 10 2 -10 5 PFU부터 바이러스 titer에 대한 형광 강도의 긍정적인 상관 관계가 사기꾼이 될 수도sistently 관찰했다. 10 2 -10 3 PFU PR8 바이러스성 titers는 거의 적외선 염료의 높은 감도를 보여주지만, 최소한의 감지 양성 지속적으로 본. 신호 대 잡음 비율 모의 - 감염된 또는 isotype 항체 - 대우 MDCK 세포를 비교하여 결정되었다.
96에서 형광 강도를 사용하여 - 또는 384 - 잘 플레이트 형식을, 우리는 표준 적정 곡선을 잽니다. 두 번째 변수는 형광 강도가있는 동안이 계산에서 첫 번째 변수는 바이러스 titer입니다. 따라서 바이러스 titers와 형광 농도 사이의 다항식 관계를 결정하는 곡선 맞춤을 생성하는 지수 분포를 사용했습니다. 집단적으로, 우리는 IR 염료 기반의 단백질 검출 시스템은 바이러스 변종에 감염 진단하고 정확하게 감염 병원체의 titer를 열거할 수 있습니다 결론.
Protocol
1. MDCK 세포 배양
- 10% FBS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 1 밀리미터 나트륨 pyruvate, 7.5 % 나트륨 중탄산염의 5 %와 RPMI1640 전체 매체의 20 ML의 T-75cm 2 플라스크에서 하룻밤 문화 5,000,000 MDCK 세포 37 ° C 배양기에서 솔루션과 0.001 % β-메르 캅 토 에탄올이 5.2 % CO 2 주입.
2. PR8 감염 및 BAL 유체 수집
- 도전 C57BL / 6 마우스 intranasally 한 콧구멍을 통해 30 μl의 총 볼륨의 멸균 PBS에서 PR8 바이러스 5000 PFU와. 바이러스없이 전용 무균 PBS를 사용하여 모의 감염을 수행.
- 쥐를 0, 2, 4, 감염 후 7 일 안락사와 흉강 열고 그것을 폭로하기 위해 마우스의 모피를 통해기도에 1cm의 절개를 병렬을 했네요.
- 기도의 근위 부분에서 중간선 절개를합니다.
- PBS-1 % BSA 0.5 ML과 함께 호흡 관을 불어 넣다하고 학위를 기음L 유체. 사용 전까지는 BAL 유체는 -20 ° C의 냉장고에 저장할 수 있습니다.
3. LI-COR의 오디세이로 바이러스 감염과 바이러스성 매트릭스 단백질 (M2)의 검출
- 인프라 붉은 염료 복합 항체를 사용하여 바이러스 titers을 계량하기 위해 T-75cm 2 flasks 및 광학 평평한 바닥에 검정 접시에 그들을에서 MDCK 세포를 수확 96 - 음 (10,000 아니라 당 세포) 또는 384도 (물론 5,000 세포 ) 접시. 37 문화 하룻밤을위한 MDCK 세포 ° RPMI1640 완전한 매체 및 혈청이없는 DMEM 함유 BSA (0.2 %, 중량 / 부피), 페니실린 (100 U / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ml) 쇼핑, 나트륨으로 두 번 씻어에서 C pyruvate (1 ㎜), 나트륨 중탄산염 용액 (7.5 % 중 5 %) 및 β-메르 캅 토 에탄올 (0.001 %).
- BAL 액 (384 잘 접시 96 - 웰 플레이트 또는 10 μl 50 μl) 또는 동등 볼륨 각각 잘 알려진 titers (96 - 웰 플레이트 또는 384를위한 10 μl, 50 μl와 PR8 바이러스 MDCK 세포를 품다 - DMEM 매체의) 접시에 잘포함하는 L-1-tosylamido-2-페닐 케톤 chloromethyl은 (TPCK) 트립신을 (0.2 μg / ml) 쇼핑 - 처리.
- 감염의 1 H 따라, 100 μl (96 - 웰 플레이트) 또는 10 % 각각 잘으로 RPMI1640 전체 매체를 FBS 함유 20 μl (384 잘 플레이트)를 추가합니다.
- 감염의 또 다른 16 H 위해 culturing MDCK 세포를 계속, PBS-1 % BSA 용액 100 μl (96 - 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 - 웰 플레이트)으로 두 번 MDCK 세포를 씻어과 100 μl (96 - 웰과 해결 판) 또는 5 분 1 % paraformaldehyde 20 μl (384 잘 플레이트).
- 고정 후, 추가로 차단을위한 PBS-1 % BSA 100 μl (96 - 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 잘 판)과 30 분 동안 MDCK 세포를 품어.
- M2 단백질에 대한 일차 항체 : 1 개 H (1:1000, PBS-1% BSA에 희석)에 대한 MDCK 세포를 품어 차단 후. 각각, 50 희석 항체 잘, 20 μl 당 μl 당 잘 96 - 웰 또는 384 잘 접시에 사용하십시오.
- 100 μl (96 - 웰 플레이트에 세 번이나 MDCK 세포를 씻으) 또는 PBS-포함된 50 μl (96 - 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 - 웰 플레이트) 염소 항 마우스 IRDye @ 800 이차 항체와 1 H 1 % BSA와 부화를 (20 μl (384 잘 판) 1:200 희석).
- PBS-포함된 1 % BSA를 100 μl로 세 번이나 MDCK 세포를 씻으십시오. 또는 384 잘 플레이트 읽기 - 96에 대한 LI-COR의 오디세이 적외선 스캐너의 독서 유리 플랫폼에서 스테인드 접시를 놓고 독자를 설정합니다.
- 빈 부정적인 제어 우물은 LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용하여 설정할 수 있습니다. LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용 플레이트 내에 전체 플레이트 또는 선택한 우물을 수량.
- 자동 모양 도구를 사용하여, 시험 중간에 잘 96의 대상 영역 (ROI)의 경계를 그려 - 또는 384 - 잘 접시. 투자 수익 (ROI)의 창조는 소프트웨어가 바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교할 수 있습니다.
- 전체 분석을위한 기준 값을 설정하려면, 배경 투자 수익 (ROI)를 사용합니다. 현 대 적 인에 대한 투자 수익 (ROI) 내에 오디세이 소프트웨어가 제공하는 두 개의 반대 크로스 머리카락 소개잘 건너 형광의 강도를 다시.
- 검출을위한 780 nm의 채널 및 LI-COR의 오디세이 적외선 스캐너의 기준 파장과 같은 680 nm의를 사용하는 접시를 검사합니다.
- '읽기'명령이 활성화되면 투자 수익 (ROI)의 균일한 간격으로 형광 농도가 측정되며 수집된 데이터는 통합 가리 킵니다. 표준 편차 배율은 투자 수익 결정에 포함되는 기준 이상의 신호의 레벨을 결정합니다.
- 배경 형광은 혼자가 제어 모의 - 감염된 또는 보조 항체로부터 계량되며 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용됩니다.
- 그것이 정의된 각각의 장소에 대한 그물 픽셀 볼륨을 나타내는 및 기능 크기의 독립적이기 때문에 계산을위한 '통합 강도'를 선택했다. 미지 시료의 바이러스 titers을 계산하는 알려진 바이러스 titers에서 표준 곡선을 사용합니다. 정확하게 바이러스 titers을 계산하는 긴 보간 곡선을 사용합니다. v를 계산표준 곡선과 시험 샘플의 농도를 비교하여 테스트 샘플에 iral titers.
4. 대표 결과
IR 염료 기반의 높은 처리량 바이러스 탐지 시스템의 표준화
PR8 바이러스는 MDCK 세포를 감염시킬 수 있으므로, 우리는이 분석을 개발하는 데 이러한 세포를 사용했습니다. 우리는 독감 바이러스 모체 단백질 (M2)에 대한 일차 항체를 사용하여 바이러스 titers를 측정했습니다. 다른 방법과는 달리, 우리는 거의 적외선 염료의 복합이다 이차 항체를 사용했습니다. 이 방법은 M2 단백질을 감지하는 동안 생성되는 형광 강도를 사용하여 간단하고 자동화된 PR8 바이러스 titer 결정을 제공합니다. 인플루엔자 바이러스 감염 후, M2 단백질은 번역 운반하고 세포 표면을 포함하여 숙주 세포에 축적됩니다. 따라서, M2 단백질의 수량은 바이러스의 수량을 결정하는 측정 가능한 매개 변수를 나타냅니다. 에서 농도를 비교표준 곡선과 테스트 샘플 바이러스 titers의 정확한 측정을 제공합니다.
형광 기반의 방법의 효능을 확인하려면, 우리는 교양 4 MDCK 세포 / 잘 챔버의 10 하룻밤 사이에 슬라이드. 알려진 titers의 PR8 바이러스성 주식이 다른 플라크 형성 단위 (PFU)와 우물을 복제하기 위해 추가 한 시간 동안 세포에 adsorb로 허용되었다. 세포는 바이러스가 증식하도록 16 H 위해 incubated되었다. 이 후, 챔버 슬라이드에서 MDCK 세포는 AlexaFluor에 의해 추가로 한 H에 대한 488-복합 이차 항체를 따라, 1 H를 위해, 1 % paraformaldehyde로 고정 씻어 및 안티-M2 항체 물들일되었다. 감염된 MDCK 세포 공촛점 현미경 분석 자기편 단일층이 크게 손상되지했고 PR8 파생 M2 단백질은 감염된 MDCK 세포 (그림 1A) 내부에 다량 존재였다 보여주었다. Fluorescing 세포와 같은 낮은 바이러스성 titers과 감염에 포착할 수 10 2
따라서 정확한 바이러스 추정 방법을 확립하기 위해 우리는 IR 염료 기반 감지 및 부량 시스템을 채용. MDCK 세포 (10 4 / 잘) PR8과 바이러스성 단백질에 감염된 96 - 웰 플레이트에서 배양해 줄 것은 안티 M2 IR 염료 복합 이차 항체 다음을 사용하여 발견되었다. 안티 M2 항체의 사용은 우리가 바이러스 수량의 직접적인 메트 릭으로 항원에 특정한 형광 강도를 사용하도록 허용했다. 형광 강도를 열거하기 위해 우리는 LI-COR 오디세이 기반 적외선 스캐너를 사용했습니다. 이 시스템은 두 채널 레이저 BAS를 사용에드 적외선 탐지가 fluorophores을 파악하고 배경 잡음에서 그들을 구별합니다. 첫 번째 채널은 680 nm의에서 흥분과 배경을 계량하기 위해 700 nm의에서 방출. 두 번째 채널은 780 nm의에서 fluorophores 그 자극을 감지 및 800 nm의에서 내보냅니다. LI-COR의 오디세이에 PR8에 감염된 MDCK 세포 검사는 바이러스 titer 종속 밝은 형광 (그림 1B)를 지적했다. M2 긍정적인 형광 MDCK 세포가 우물 (그림 1B) 안에서 선명하게 보이고 있었다. 10 2 -10 5 PFU부터 바이러스 titer에 대한 형광 강도의 긍정적인 상관 관계가 지속적으로 관측할 수 있었을 것이다. 분석의 감도에 대한 상한을 설정하는 세포 죽음에 대해 10 6 PFU의 리드보다 PR8 바이러스성 titrations 높다. 10 2 -10 3 PFU PR8 바이러스성 titers는 거의 적외선 염료의 높은 감도를 보여주지만, 최소한의 감지 양성 지속적으로 본. 신호 대 잡음 비율을 moc을 비교하여 결정되었다K-감염이나 isotype 항체 - 대우 MDCK 세포. 이러한 컨트롤 둘 다 형광 무시할 또는 감지 레벨 (그림 1B) 결과.
추가 감도를 향상시키고 테스트 샘플 볼륨 요구 사항을 줄이기 위해, 우리는 5 감염 × 10 3 MDCK 세포를 / 잘 384 잘 접시에. PR8의 다른 PFUs는 일련의 로그를 dilutions (그림 1C)로 테스트했습니다. 384도 접시에서 감지 민감도는 96 - 웰 플레이트 assays의 비교했습니다. 10 1과 10 두 2 PFU는 96 - 웰 플레이트에 비해 384 잘 접시에 일관되게 잘 나왔어. 96에서 형광 강도를 사용하여 - 또는 384 - 잘 플레이트 형식을, 우리는 표준 적정 곡선 (그림 1D) 구축. 두 번째 변수는 형광 강도가있는 동안이 계산에서 첫 번째 변수는 바이러스 titer입니다. 따라서 커브-맞게 determ 위해를 생성하는 지수 분포를 사용바이러스 titers와 형광 농도 사이의 다항식 관계를 오프라인. 우리는 또한 PR8 바이러스의 핵 단백질 (NP) (데이터가 표시되지 않음)에 대해 감독하는 다른 항체를 사용하여 우리의 관찰을 검증했습니다. PR8 변종의 독특한 소스도 방지 NP 또는 방지 M2 항체 (데이터가 표시되지 않음)에서 테스트되었습니다 MDCK 세포를 감염하는 데 사용되었다. 집단적으로, 우리는 IR 염료 기반의 단백질 검출 시스템은 바이러스 변종에 감염 진단하고 정확하게 감염 병원체의 titer를 열거할 수 있습니다 결론.
바이러스 titers을 계산하는 수학 고려 사항
아래 설명에 따라 형광 강도 및 titer의 결정의 수학적 계산이 완료됩니다. 염색법 절차에 따라 전체 강판 또는 강판 이내 선택한 우물은 LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용하여 계량하고 있습니다. 자동 모양 도구 사용하여 대상 영역 (ROI)의 경계는 96의 테스트 우물 중간에 그려진되었다 - 또는 384 - 우리접시됩니다 (그림 2A와 B). 투자 수익 (ROI)의 창조는 소프트웨어가 바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교할 수 있습니다. 배경 투자 수익 (ROI)은 전체 분석을위한 기준 값을 설정하는 데 사용되었다. 두 개의 반대 십자선 (흰색)이 잘 (그림 2C)을 통해 형광의 강도를 측정하기위한 투자 수익 (ROI) 내에 도입되었습니다. 오른쪽과 그림 2C에서 대리인 우물 아래 곡선이 십자선을 따라 픽셀의 강도를 나타냅니다. 투자 수익 (ROI)의 균일한 간격으로 형광 농도가 측정되었으며 수집된 데이터 포인트가 통합되었다. 표준 편차 배율은 투자 수익 결정에 처음 포함되었습니다 기준 이상의 신호의 레벨을 결정. 배경 형광은 모의 - 감염된 또는 보조 혼자 항체 컨트롤에서 계량 및 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용되었다. 그것이 repres 때문에 계산을 위해 통합 강도를 선택정의된 각각의 장소 및 엔트 그물 픽셀 볼륨 기능 크기의 독립적입니다. 또한, 통합 강도는 해상도 실질적으로 독립적입니다. 총 강도 / 픽셀 (I)에서 발생하는 신호 강도에 해당하는 픽셀 영역 (가) 플러스 픽셀 영역 (B)의 배경에서 발생하는 신호에 잘 선택했습니다. 따라서 픽셀을위한 'i'를 :
나는 I = I의 I + B 전
픽셀 볼륨 신호의 크기와 그것이 분산되는 영역을 모두 나타냅니다. 신호 영역은 신호를 생성 시료의 분포와 관련되어 있습니다. 픽셀 볼륨 픽셀의 영역에서 'i'를 (가) 배 높이 (I) 픽셀 단위로 측정 전체 신호와 동일합니다. 따라서 픽셀을위한 'i'를 :
바이올렛 = 나는 그
총 픽셀 볼륨 따라서 전체 영역에서 총 신호의 요약입니다 :
| ; | N | N | |
| V = | Σv 전 | = | aΣI 전 |
| 전 = 1 | 전 = 1 |
통합 적극성이 원형 / 사각형 (카운트 mm 2) 지역 곱한 기능에 둘러싸인 모든 픽셀의 강도 값의 합계입니다. 따라서, 통합 강도 =
(ΣI I - 나)
여기서 B는 평균 배경 픽셀의 강도를 의미합니다. 이 수식은 제어 또는 실험 우물의 통합 신호 농도를 계산하고이를 표준 곡선을 설정합니다. 테스트 샘플에 바이러스성 titers이 표준 곡선을 사용하여 계산되었다. 농도 (강도) 정의의 투자 수익 (ROI)에 형광 현재의 수량을 말합니다. 테스트 샘플의 농도는 calcula 있습니다같은 이미지에 기준 정의된 농도에 테드의 상대. 정확한 바이러스 titers를 계산하려면 각 농도 표준의 강도는 꾸몄다과 긴 보간 곡선과 함께 장착되어있다. 테스트 샘플의 농도는 표준 곡선 내에서 영역의 강도를 비교하여 계산됩니다.
인플루엔자에 감염된 생쥐의 BAL 액에서 바이러스 titers의 결정
임상 및 실험실 표본의 라이브 인플루엔자 바이러스 입자의 검출은 중요한 의미가있다. 따라서 우리가 다음 우리가 실험실 샘플에 바이러스 titers을 결정하기 위해이 방법을 활용할 수 있는지 여부를 조사했다. BAL 유체가 아닌 예방 접종을 생쥐에서 수집하여 PR8 바이러스의 알려진 액수를 타서되었다. 아군 BAL 유체는 선형적으로 바이러스 titers을 열거 위해 titrated했다. 아군 BAL 유체의 Aliquots은 96 - 웰 플레이트에 MDCK 세포를 감염하는 데 사용되는 고정 및 안티-M2 및 IR 염료 복합 secondar 물들일되었습니다Y의 항체. 그림 3A에 나타난 결과는 아군 BAL 액에서 바이러스 titers가 감지되었으며 표준 곡선 PR8 titers와 상호 것을 보여줍니다. 표준 곡선을 이용하여 마약 및 titrated BAL 유체의 정확한 바이러스성 번호는 계량되었다. 지수 곡선 적합 계산은 아군 BAL 유체 (그림 3B)의 바이러스 titers을 계산하는 척도를 제공했습니다. 이 방법을 통해 우리는이 접근 방식 (그림 3C)을 확인, 계산 및 마약 바이러스성 titers 사이 우수한 상관 관계를 획득하였습니다.
다음, 우리는 PR8에 감염된 생쥐에서 BAL 액을 분석했다. PR8는 광범위한 인간의 병리 및 안티 바이러스 면역 3 이해하기 murine 모델에 사용되었습니다. 생쥐의 그룹 intranasally PR8 5,000 PFU에 감염되었다. 마우스는 체중 감소, hunched 뒤쪽의 모습 뻗치고 모피 및 기타 임상 증상에 대한 감시했다. 일 0, 2, 4, 7 및 사후 감염의 10 일,생쥐가 희생되었고 BAL 체액을 채취했다. 이러한 실험실 표본으로 이용하기 위해서 MDCK 세포는 96 - 웰 플레이트에서 17 H 50 μl의 최종 볼륨에서 BAL 액의 시리얼 dilutions와 incubated했다. 주식 PR8 바이러스의 알려진 titers에 감염된 MDCK 세포의 제어 우물은 표준 곡선을 생성 하였다. 감염 후 세포는 씻어 고정하고 가까운 적외선 염료 복합 이차 항체 다음에 안티 - M2 일차 항체 물들일되었다. 모의 - 감염 또는 감염이 titer 계산을위한 배경 형광의 강도를 제공한 후 isotype 컨트롤로 치료했다 MDCK 세포.
BAL 액의 분석은 실험실 표본의 PR8 바이러스 IR 염료 기반의 분석 시스템을 통해 감지되어 있는지 보여주었다. BAL 유체의 바이러스 부하의 상당한 증가 일 2 및 4 포스트 감염 (그림 4A)에서 관찰되었다. 통합 강도의 계산 일 2와 4에서 BAL 체액 내가을 게시한다는 지적nfection은 PR8 바이러스의 상당 수준 (그림 4B)가 포함되어 있습니다. 우리의 결과는이 질병의 심각도를 보여주 PR8 감염의 초기 단계에서 점진적이지만 상당한 체중 감량을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 마우스는 7 일 게시물 감염 (그림 4C)을 질병의 증상에서 회복과 체중을 얻는 시작했다. 10 일째 게시물 감염에서 마우스는 또한 체중 증가와 질병의 증상에 상당한 감소와 상호 바이러스의 등급을 나타내는 어떠한 감지 PR8이 부족해.
더욱 이러한 분석의 응용 프로그램을 확장하기 위해, 우리는 (H1N1) 인체 독감은 IR 염료 기반 항체 검출 시스템 분리 및 실시간 PCR 분석으로 비교 2009 테스트했습니다. 이 임상 샘플 의심되는 환자로부터 얻은 통합 nasopharyngeal / 인후 면봉으로부터 격리되었다. 격리는 밀워키 보건국 실험실에서 MDCK 세포주에 전파되었다. 테스트 결과는 안돼요 있었다실시간 PCR의 assays (그림 5)에 IR 염료 기반 방법의 감도를 확인할 빨강. 결과는 IR 염료 기반 항체 검출 시스템은 임상 관련 내에 PCR 기반의 분석 (10 TCID 50 / ML)과 가을과 비교 10 3 TCID 50 / ML로 낮은 바이러스 부하를 감지하는 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다 대부분의 환자 샘플 다양합니다. 이러한 결과는 IR 염료 기반의 분석 시스템은 충분한 감도, 연구 실험실과 임상 설정에서 바이러스 titer 열거 신청을받을 가능성이있다는 강력한 증거를 제공합니다.
1 그림. 인플루엔자 바이러스의 IR은 염료 기반의 면역 감지. () 8 - 잘 챔버 슬라이드에서 인플루엔자에 감염된 MDCK 세포의 공촛점 현미경 분석합니다. Immunofluorescence 미세한 분석은 자기편 MDCK 단일층는 바이러스 파생 M과 크게 온전하고로드 입증이 단백질. IR 염료와 LI-COR의 오디세이 시스템을 바탕으로 바이러스 titers의 (BC) 부량. 표준 곡선 및 지수 곡선 맞춤 프로파일 (D) 세대. 광고에서 제시된 데이터 다섯 독립적인 실험의 대표입니다.
그림 2. IR 염료를 사용하여 바이러스 titers를 결정 방법론. () 통합 형광 강도 측정. 시험 우물 (ROI) 내부에 정의된 영역이 형광 강도를 측정하는 편이 었지. 자동 모양 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 경계는 96의 테스트 우물 중간에 그려져 있었다 - 또는 접시 384도. 형광은 투자 수익 (ROI) 이내 개별 픽셀 (화소 = N)로 측정되었다. 통합 적극성이 원형 / 사각형 (카운트 mm 2) 지역 곱한 기능에 둘러싸인 모든 픽셀의 강도 값의 합계입니다. (B) 분석 우물의 통합 형광 농도를 결정. 투자 수익 (ROI)의 창조바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교하기 위해 LI-COR 스캐너를 허용했다. 배경 형광은 모의 - 감염된 또는 보조 혼자 항체 컨트롤에서 계량 및 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용되었다. 투자 수익 (ROI) 내의 데이터 포인트의 (C) 컬렉션. 두 개의 반대 십자선 (흰색)이 잘 건너 형광의 강도를 측정하기위한 투자 수익 (ROI) 내에 도입되었습니다. 오른쪽과 대표 우물 아래 곡선이 십자선을 따라 픽셀의 강도를 나타냅니다.
그림 3. PR8 아군 BAL 체액에있는 바이러스 titers의 감지 및 부량. () MDCK 세포가 하룻밤 사이에 96 - 웰 플레이트에서 배양해 및 PR8 아군 BAL 액과 함께 추가되었습니다. 플레이트는 LI-COR의 오디세이 시스템에서 읽을 수 있었다. (B) Exogenously 아군 BAL 액은 표준 곡선과 비교되었다. 계산에 예상 비르의 (C) 비교 야외 titers. 지수 곡선 피팅은 Y = 9.4784e 0.0014x를 제공했습니다. 교류에 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표입니다.
4 그림. PR8 감염된 생쥐에서 BAL 체액의 인플루엔자 바이러스의 검색 및 부량. () 생쥐의 그룹은 intranasally PR8 5,000 PFU에 감염되었다. MDCK 세포는 96 - 웰 플레이트 17 H 50 μl의 최종 볼륨에서 BAL 액의 시리얼 dilutions와 incubated했다. 감염 후 세포는 씻어 고정 및 IR 염료 복합 이차 항체 이어 안티 M2 일차 항체 물들일되었다. 가장 오른쪽 패널은 표준 곡선을 나타냅니다. (B)에 감염된 생쥐의 BAL 액에서 바이러스 titers의 부량. PR8 감염 동안 생쥐의 (C) 체중 감소는 바이러스 부하와 상호. 교류에 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표입니다.
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그림 5. 2009 감지 및 부량는 (H1N1) 유행 (PDM) 독감은 인간의 환자에서 분리. 감염된 MDCK 세포주의 절반 배 적정위한 () IR 염료 기반 항체 형광 시스템의 탐지. 형광 결과 분석 10 3 TCID 50 / ML과 같은 낮은 바이러스 부하를 감지하는 잠재력이있다 나타냅니다. (B)의 문화에서 추출한 핵산은 CDC 실시간 PCR 분석 12로 분석되었다 분리 알려진 titered H1N1의 직렬 10 배로 dilutions와 함께 격리. 실시간 PCR을위한 감지 한계는 10 TCID 50 / ML했습니다.
Discussion
동남 아시아에서 조류 독감과 돼지 독감 유행병의 세계적 공포의 최근 전염병 발생은 공중 보건과 안전에 대한 커다란 우려를 부과. 중요한 초점은 인플루엔자 바이러스의 기존 및 새로운 변종을위한 백신을 발전 전념하고있다. 정확한 감지하고 정확한 바이러스 titer의 계산을위한 신속한 높은 처리량 기술의 가용성은 대단히 치료를 향상됩니다. 바이러스 titer를 계산하기 위해 사용된 가장 일반적으로 사용되는 기법은 플라크 형성과 독감 hemagglutination의 assays를 포함합니다. 플라크 형성 검정 처음으로 박테리오 파지 titers을 추정하기 위해 개발되었으며, 동물의 바이러스성 titers에게 4 계산할 Renato Dulbecco에 의해 채택되었습니다. 이러한 분석을 수행하려면 6 - 잘 접시에 인플루엔자 주식이나 BAL 유체와 같은 동물 표본의 10 배 dilutions이 준비되며 0.1 ML aliquots는 MDCK 세포 단일층에 주사한다. 바이러스는 광고 뒤에 MDCK 세포에 adsorb 할 수 있습니다영양 매체와 아가로 오스의 dition. 배양하는 동안, 원래 감염된 세포는 이웃 세포에게 전염 바이러스 자손을 풀어주고있다. 독감 바이러스 감염의 cytopathogenic 효과 상패 불리는 감염된 세포의 원형 영역을 생산하고 있습니다. 각 플라크는 아마도 바이러스의 복제를 다음 단일 바이러스 입자와 단일 세포의 감염 후에 형성된다. 살아있는 세포와 plaques 사이의 대비 같은 크리스탈 바이올렛 등 염료에 의해 향상될 수 있습니다. 이 분석의 주요 단점은 재현성과 실험 사이 거대한 변화의 부족이다. 인플루엔자 바이러스 titer를 결정하는 데 사용되는 또 다른 분석은 hemagglutination 분석이다. 인플루엔자 바이러스의 표면에 적혈구응집소 단백질 선물 효율적으로 포유류와 조류 적혈구 1 N-acetylneuraminic 초산 함유 단백질에 바인딩합니다. 인플루엔자 바이러스와 적혈구 간의 이러한 상호 작용은 격자의 형태로 응집이 생깁니다. 리터응집의 거시기는 테스트 표본에서 인플루엔자 바이러스의 titer를 추정하는 데 사용됩니다. 적혈구 응집 분석은 알려진 바이러스의 적정을 결정하기 위해서만 사용되며, 스트레인 식별 목적으로 사용할 수 없습니다. 이 분석은 실제와 죽은 바이러스를 구분하지 않기 때문에, 그것은 바이러스 titers의 정확한 계산을 얻기 어렵습니다.
인플루엔자 감염 현재 임상 진단은 serologic 검사, 중합 효소 사슬 반응, 직접 표본 immunofluorescence 및 세포 배양 1,6를 기준으로합니다. 새로운 방법은 또한 임상 및 실험실 진단 잠재력을 가지고 여기에 설명했다. 인플루엔자 검출 키트 Directigen 독감 등 핵 단백질 7으로 바이러스 항원을 검출하기 위해 (BD Biosciences, 산호세, 캘리포니아)과 BinaxNow (Binax 주식 회사, 스카, ME) 사용 immunochromatography 분석. , 바이러스 감지 이러한 키트를 사용하면 15 분 이내에 달성될 수 있지만, 모든 부정적인 샘플이 더들 있어야세포 배양 방법으로 creened. 각종 연구는 또한 감염이 약한 또는 8 낮았다 특히이 키트의 낮은 감도를,보고했습니다. 우리의 방법에서 우리는 지속적으로 바이러스의 낮은 100 등 PFU을 감지. 이것은 감염이 약한 경우에도 우리의 기술은, 임상 샘플에서 H1N1 바이러스를 검출에 유용합니다 제안합니다. 중 nasopharyngeal 대기음의 표본 직접 분석 않았거나 바이러스 증식 및 후속 분석 9 감염될 세포 단일층에 주사 곳 - 바이러스 항원을 감지하는 형광 기반의 방법은,보고되었습니다. 그러나 이러한 방법은 진단 목적으로 제한 및 바이러스 titer 계산에 적합하지 않습니다. Q-PCR은 RNA 바이러스의 존재를 파악하는 데 도움과 실시간 바이러스의 감염을 추정하지 않습니다. 이러한 assays에 비해 IR 염료 기반의 분석 시스템은 임상 및 실험실 표본의 탐지 및 바이러스 titer 열거에 도움이 될 것입니다. 독감 발발 경우에는 그렇지짧은 기간 동안 견본의 수천을 진단하는 것이 중요합니다. 384 잘 플레이트와 적외선 스캐너를 기반으로 우리의 방법은 그러므로 다른 직접적인 형광등 방식에 비해 큰 이점을 제공 시간 (> 2,000 샘플)에 6 접시를 스캔할 수 있습니다. 임상 견본의 수천의 빠른 처리 타당성은 분석 시간과 비용을 테스트 변화, 길이를 줄일 수 있습니다. M2 특정 항체의 사용은 H와 N 단백질의 변형 차이 독립적이라는 장점을 제공합니다. M2-단백질은 상대적으로 인간을 감염 대부분의 인플루엔자 변종에 보존되어있다. 순환 얼룩 특정 항체는 저희 시스템과 결합하는 경우에는 하나는 바이러스의 두 titer를 측정하고 긴장을 식별할 수 있습니다. M2는 Amantadine 같은 약물의 대상이기 때문에 그러나, 돌연변이 여기에 사용되는 mAb에 대한 바인딩 사이트를 바꿀 수 있었 발생할 수 있습니다. 이것은이 약물에 의해 치료되고 개인이 시스템에 대한 잠재적인 제한 사항을 나타냅니다.
복수assays는 테스트 샘플에서 인플루엔자 titers를 열거하는 데 사용됩니다. 바이러스 titer, 50 %의 조직 문화가 전염성 선량 (TCID 50) 계란 allantoic 유체 기반 assays를 계산하기 위해서는 널리 1,10를 사용합니다. 그러나 여러 일 요구 사항은 이러한 방법이 덜 안정적인합니다. 또한, 이러한 방법에 plaques의 수가 50 %의 변화를 기반으로 계산이 정확한 이론 있지만 바이러스 titrations를 제공합니다. assays를 형성 상패가 96시간 이내에 수행할 수 있으나, 재현성의 부족 바이러스 titer 계산에서 주요 관심사입니다. 여기에 설명된 현재의 기술은 몇 가지 뚜렷한 장점이 있습니다. 첫째, 일관성있는 결과와 높은 재현성 기술입니다. 둘째, 바이러스 titer의 계산은 정의된 표준 곡선 비교되는 형광 강도의 간단한 부량 기준으로 산정됩니다. 셋째, 두 개 이상의 일차 항체는 주어진 샘플에서 여러 serotypes를 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 IR 염료 복합 항체가 미소를알 autofluorescence하며 세포 이미징 11 사용되었습니다. 높은 양자 항복 내생 fluorophores의 존재로 인해 높은 휴대 autofluorescence의 자외선이나 방사선 영상 (300-600 nm의) 결과입니다. 이들은 방향족 아미노산, 사러가 - 안료, pyridinic 세포핵 (NADPH), 엘라스틴, 콜라겐과 플라 빈의 coenzymes을 포함합니다. 세포의 이러한 본질적인 속성은 프로브는 특정 단백질의 표현을 수치로 어렵게 방사선 이러한 소스를 활용할 수 있습니다. 반면, 가까운 적외선 염료는 자극과 670-1000 nm의 사이에 내보냅니다. 많은 호스트 세포 분자와 polyaromatic 탄화 수소는이 파장에 자극 및 감소 광 산란으로 인해 매우 낮은 배경 형광을 방출하지 않습니다. 또한, 배경과 구체적인 탐지 사이의 창이 크게 부근-IR fluorophores의 높은 흡광 계수에 의해 향상됩니다. Photostability, 우수한 신호 대 노이즈 비율은 바이러스 titers의 부량에 매우 적합합니다. microfl 사용uidic 챔버 스는 로봇 제어를 통해 심사 과정을 자동화합니다, 그리고 우리가 쉽게 높은 전염성 임상 샘플을 테스트할 수있다. 따라서 이러한 메서드에 가까운 적외선 염료의 활용은 조직 샘플에서 바이러스 titers를 열거할 수 이상과 높은 신뢰성이다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 부분 NIH 교부금 R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM까지)에서 지원됩니다. 우리는 원고의 비판적 검토, 논의와 기술적 도움 티나 히틀러를 저희 연구실 구성원 감사드립니다. 우리는 바이러스 문화와 PCR을위한 데이비드 비나, 밀워키 보건국 실험실을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
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