Summary
هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 - أو 384 لوحة جيدا، يتطلب <10 ميكرولتر من حجم المواد واختبار لديه القدرة على فحص متزامن من مسببات الأمراض متعددة.
Abstract
فيروس الانفلونزا هي العوامل المسببة للأمراض في الجهاز التنفسي الذي يسبب درجة عالية من كل عام معدلات الاعتلال والوفيات في مناطق متعددة من العالم. لذلك فإن التشخيص الدقيق للاصابة بسلالة وفحص سريع عالية الإنتاجية من أعداد هائلة من العينات السريرية أمر بالغ الأهمية للسيطرة على انتشار الأمراض الوبائية. وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي العينات وخلية 1،2 الثقافة.
هنا، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة للتشخيص المستخدمة للكشف عن فيروسات الأنفلونزا الحية. استخدمنا الإنسان الفأر تتكيف A/PR/8/34 (PR8، H1N1) فيروس 3 لاختبار فعالية هذه التقنية باستخدام الخلايا MDCK 4. تم زراعة الخلايا MDCK (10 4 أو 5 × 10 3 لكل بئر) في 96 - أو تم الكشف عن 384 لوحات جيدة، مصابة PR8 والبروتينات الفيروسية استخدام الألغام المضادة للM2 تليها ثانية صبغ مترافق IRondary الأجسام المضادة. M2 (5) وراصة دموية 1 هي علامة اثنين من البروتينات الرئيسية المستخدمة في فحوصات التشخيص كثير مختلفة. التقليل من توظيف IR-صبغ مترافق الأجسام المضادة الثانوية تألق ذاتي المرتبطة الأصباغ الفلورية الأخرى. يسمح للاستخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة M2 لنا لاستخدام كثافة مستضد محدد مضان باعتباره متري مباشرة من كمية الفيروس. تعداد كثافة مضان، استخدمنا LI-COR الماسحة الضوئية الحمراء أوديسي مقرها. هذا النظام يستخدم اثنين من قناة الليزر القائمة على اكتشافات الأشعة تحت الحمراء لتحديد fluorophores وتمييزها من الضوضاء في الخلفية. القناة الأولى يثير في 680 نانومتر، وتنبعث عند 700 نانومتر للمساعدة في تحديد الخلفية. القناة الثانية بالكشف عن fluorophores التي تثير في 780 نانومتر، وتنبعث منها في 800 نانومتر. وأشار المسح الضوئي للPR8 الخلايا المصابة MDCK في الماسحة الضوئية الحمراء فيروسية عيار التي تعتمد على مضان مشرق. ويمكن لعلاقة إيجابية من كثافة مضان لعيار الفيروس بدءا من 10 2 5 -10 PFU يكون يخدعولاحظ sistently. الحد الأدنى من الإيجابية ولكن يمكن اكتشافها ينظر باستمرار مع 10 2 -10 3 PFU PR8 التتر الفيروسية أظهرت حساسية عالية من الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء. تم تحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال مقارنة وهمية المصابة أو isotype الأجسام المضادة الخلايا المعالجة MDCK.
استخدام كثافات مضان من 96 - أو صيغ لوحة 384 بشكل جيد، وضعنا منحنيات المعايرة القياسية. في هذه الحسابات، المتغير الأول هو عيار الفيروس في حين أن المتغير الثاني هو كثافة مضان. لذا، كنا التوزيع الأسي لإنشاء منحنى مناسبا لتحديد العلاقة متعدد الحدود بين التتر الفيروسية وكثافة مضان. بشكل جماعي، فإننا نستنتج أن الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين صبغ النظام القائم يمكن أن تساعد في تشخيص اصابة السلالات الفيروسية وتعداد بالضبط عيار من مسببات العدوى.
Protocol
1. MDCK الخلايا ثقافة
- ثقافة 5000000 الخلايا MDCK بين عشية وضحاها في T-75 قارورة 2 سم في 20 مل من RPMI1640 المتوسطة كاملة مع 10٪ FBS، 100 يو / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 1 البيروفات الصوديوم ملم، 5٪ من بيكربونات الصوديوم 7.5٪ حل و 0.001٪ β-المركابتويثانول في الحاضنة 37 درجة مئوية يملؤه 5.2٪ CO 2.
2. PR8 العدوى وBAL جمع السائل
- التحدي C57BL / 6 الفئران الأنف. مع 5000 PFU من PR8 الفيروس في برنامج تلفزيوني العقيمة في وحدة تخزين ما مجموعه 30 ميكرولتر من خلال واحد المنخر تنفيذ الالتهابات وهمية باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة فقط بدون الفيروس.
- الموت ببطء الفئران 0، 2 و 4 و 7 أيام بعد الإصابة وخفض التجويف الصدري فتح وجعل شق 1 سم موازية للالقصبة الهوائية من خلال الفراء من الماوس لكشف ذلك.
- جعل شق خط الوسط على الجانب القريب من القصبة الهوائية.
- يبث في القصبة الهوائية مع 0.5 مل من جيش صرب البوسنة PBS-1٪، ونضح مكتبة الإسكندريةL السوائل. ويمكن تخزين السوائل BAL في الفريزر -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
3. عدوى الفيروس والكشف عن بروتين المصفوفة الفيروسية (M2) مع الأوديسة LI-COR
- لقياس عيار الفيروسية باستخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ مترافق الأجسام المضادة، وحصاد الخلايا MDCK من T-75 قوارير 2 سم، ولهم في لوحة بصرية سوداء مسطحة القاع 96-جيدا (10،000 الخلايا لكل بئر) أو 384 حسنة (5،000 خلايا لكل بئر ) لوحات. ثقافة الخلايا MDCK ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط RPMI1640 كاملة وغسل مرتين مع المصل خالية من جيش صرب البوسنة التي تحتوي على DMEM (0.2٪، والوزن / الحجم)، البنسلين (100 يو / مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل)، والصوديوم البيروفات (1 ملم)، والصوديوم بيكربونات حل (5٪ من 7.5٪) و β-المركابتويثانول (0.001٪).
- احتضان خلايا MDCK مع السائل BAL (50 ميكرولتر ل96-جيدا لوحة أو ميكرولتر 10 ل384 جيد لوحة) أو PR8 فيروس مع التتر معروف في كل بئر مع حجم مساو (50 ميكرولتر ل96-جيدا لوحة أو 10 ميكرولتر عن 384 - كذلك لوحة) من متوسط DMEM،تحتوي على L-1-tosylamido-2-الفنيل كيتون كلوروميثيل (TPCK) معاملة التربسين (0.2 ميكروغرام / مل).
- بعد 1 ساعة من العدوى، وإضافة 100 ميكروليتر (96 جيدا لوحة) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) من 10٪ FBS المحتوية على RPMI1640 المتوسطة كاملة إلى كل بئر.
- تستمر الخلايا زراعة MDCK لآخر ح 16 من العدوى؛ غسل الخلايا MDCK مرتين مع 100 ميكرو لتر (96 جيدا لوحة) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) من برنامج تلفزيوني-1 حل جيش صرب البوسنة في المائة واصلاحها مع 100 ميكرو لتر (96 جيدا لوحة) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) لامتصاص العرق 1٪ لمدة 5 دقائق.
- بعد تحديد واحتضان خلايا MDCK كذلك لمدة 30 دقيقة مع 100 ميكرو لتر (96 جيدا لوحة) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) من جيش صرب البوسنة PBS-1٪ للحظر.
- بعد منع احتضان خلايا MDCK لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين M2 (1:1000، مخففة في برنامج تلفزيوني BSA-1٪). استخدام 50 ميكرولتر لكل ميكرولتر جيد و 20 من الأجسام المضادة المخفض بشكل جيد في 96-جيدا أو جيدا 384 لوحات، على التوالي.
- غسل خلايا MDCK ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر (96 لوحة جيد) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) من برنامج تلفزيوني المحتوية على (1٪ جيش صرب البوسنة والحضانة لمدة 1 ساعة مع 50 ميكروليتر (96 جيدا لوحة) أو 20 ميكروليتر (384 حسنة لوحة) الماعز لمكافحة فأر IRDye @ 800 الأجسام المضادة الثانوية 1:200 التخفيف).
- غسل خلايا MDCK ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يتضمن-BSA 1٪. وضع لوحات الملون على منصة القراءة من زجاج الماسحة الضوئية أوديسي IR-LI مجلس النواب وتعيين قارئ عن 96 - 384 أو جيدا قراءة لوحة.
- يمكن تعيين فارغة آبار مراقبة سلبية باستخدام برنامج أوديسي LI-COR. كميا لوحة كاملة أو آبار مختارة ضمن لوحة باستخدام LI-COR البرمجيات الأوديسة.
- باستخدام أداة الشكل التلقائي، ورسم حدود منطقة الهدف (ROI) في منتصف اختبارا جيدا من 96 - أو لوحات 384 أيضا. إنشاء ROI يسمح البرنامج للمقارنة بين الآبار خلفية محددة لعينات الفيروسات معاير.
- لتعيين قيمة أساسية لفحص كامل، واستخدام عائدات الاستثمار في الخلفية. أعرض اثنين عبر الشعر معارضة التي قدمها البرنامج أوديسي في العائد على الاستثمار إلى measuإعادة كثافة مضان عبر البئر.
- تفحص لوحات باستخدام 780 قناة نانومتر للكشف و 680 نانومتر والطول الموجي في إشارة ماسح ضوئي أوديسي IR-LI مجلس النواب.
- بمجرد تفعيل الأمر 'قراءة'، سوف يتم قياس كثافة فلوري في فترات زمنية موحدة من العائد على الاستثمار ونقاط دمج البيانات التي تم جمعها. وسوف مضاعف الانحراف المعياري تحديد مستوى إشارة على خط الأساس التي يتم تضمينها في تقرير بالارقام.
- وسيتم كميا مضان الخلفية من الجسم المضاد وهمية المصابة أو الثانوية وحدها تسيطر على وسيتم استخدامها لتقدير شدة المتكاملة في اختبار الآبار.
- اختارت "كثافة متكاملة" لإجراء العمليات الحسابية لأنه يمثل صافي حجم بكسل لبقعة محددة وفردية مستقلة عن حجم الميزة. استخدام منحنى قياسي من التتر والفيروسية المعروفة لحساب التتر الفيروسي لعينات غير معروفة. استخدام منحنى الاستيفاء طويلا لحساب بالضبط التتر الفيروسية. حساب الخامسiral التتر في عينات الاختبار من خلال مقارنة شدة من عينات اختبار مع منحنى القياسية.
4. ممثل النتائج
توحيد قائم على الأصباغ الحمراء نظام سرعة الكشف عن الفيروس عالية
يمكن PR8 فيروس يصيب خلايا MDCK، وبالتالي، نحن استخدام هذه الخلايا لتطوير هذا الفحص. قمنا بقياس التتر الفيروسية باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد مصفوفة بروتين الأنفلونزا الفيروسية (M2). وعلى النقيض من المنهجيات الأخرى، وكنا الأجسام المضادة الثانوية التي هي مترافق إلى صبغة شبه الأشعة تحت الحمراء. هذا الأسلوب يوفر، آلية بسيطة عيار فيروس PR8 تقرير باستخدام كثافة مضان التي يتم إنشاؤها في حين كشف عن البروتين M2. بعد عدوى فيروس الانفلونزا، تتم ترجمة البروتين M2، ونقلها ويتراكم في الخلية المضيفة بما في ذلك سطح الخلية. وهكذا، فإن كمية من البروتين M2 يمثل معلمة قابلة للقياس لتحديد كمية الفيروس. المقارنة بين شدة منعينات الاختبار مع منحنى معيار يوفر القياس الدقيق من التتر الفيروسية.
لتحديد مدى فعالية من الأسلوب القائم على مضان، ونحن مثقف 10 4 خلايا MDCK / بشكل جيد في غرفة ينزلق بين عشية وضحاها. تم إضافة أسهم PR8 الفيروسية من التتر معروفة لتكرار الآبار مع وحدات مختلفة لوحة التشكيل (PFU)، ويسمح للامتزاز على الخلايا لمدة ساعة. وحضنت الخلايا لمدة 16 ساعة للسماح للفيروس للنشر. بعد هذا، تم إصلاح الخلايا MDCK في الشرائح غرفة مع بارافورمالدهيد 1٪، وغسلها وملطخة مكافحة M2 الضد لمدة 1 ساعة، تلاه AlexaFluor 488-مترافق الأجسام المضادة الثانوية لH 1 إضافية. أظهرت التحليلات المجهرية مبائر من الخلايا المصابة في MDCK أحادي الطبقة ملتصقة كانت سليمة إلى حد كبير، وبروتين PR8 المشتقة M2 كان موجودا بوفرة داخل الخلايا المصابة MDCK (الشكل 1A). ويمكن الكشف عن خلايا الاستشعاع في الالتهابات الفيروسية مع التتر منخفضة تصل إلى 10 2
لذلك، لإنشاء طريقة تقدير دقيق فيروسي استخدمنا الأشعة تحت الحمراء صبغية الكشف ونظام القياس الكمي. تم زراعة الخلايا MDCK (10/4 أيضا) في لوحات 96-جيدا، والمصابين PR8 والبروتينات الفيروسية تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة للM2 يعقبه الأضداد صبغ مترافق IR الثانوية. يسمح للاستخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة M2 لنا لاستخدام كثافة مستضد محدد مضان باعتباره متري مباشرة من كمية الفيروس. تعداد كثافة مضان، استخدمنا LI-COR الماسحة الضوئية الحمراء أوديسي مقرها. هذا النظام يستخدم اثنين من قناة الليزر BASإد اكتشافات الأشعة تحت الحمراء لتحديد fluorophores وتمييزها من الضوضاء في الخلفية. القناة الأولى يثير في 680 نانومتر، وتنبعث عند 700 نانومتر للمساعدة في تحديد الخلفية. القناة الثانية بالكشف عن fluorophores التي تثير في 780 نانومتر، وتنبعث منها في 800 نانومتر. وأشار المسح الضوئي للPR8 الخلايا المصابة MDCK في LI-COR أوديسي فيروسية عيار التي تعتمد على مضان مشرق (الشكل 1B). كانت ايجابية فلوري M2 الخلايا MDCK واضحة للعيان داخل الآبار (الشكل 1B). ويمكن لعلاقة إيجابية من كثافة مضان لعيار الفيروس بدءا من 10 2 PFU 5 -10 لوحظ باستمرار. PR8 المعايرة الفيروسية أعلى من 10 الرصاص PFU 6 إلى موت الخلية، التي تضع حدا أعلى لحساسية الفحص. الحد الأدنى من الإيجابية ولكن يمكن اكتشافها ينظر باستمرار مع 10 2 -10 3 PFU PR8 التتر الفيروسية أظهرت حساسية عالية من الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء. تم تحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال مقارنة وزارة التجارةK-المصابين أو isotype الأجسام المضادة الخلايا المعالجة MDCK. أدى كل من هذه الضوابط في مستويات لا تذكر أو غير قابل للكشف من مضان (الشكل 1B).
لزيادة تحسين حساسية والحد من متطلبات حجم عينة اختبار، مصابة نحن 5 × 10 3 خلايا MDCK / جيد في 384 جيدا لوحات. تم اختبار PFUs مختلفة من PR8 كما المسلسل التخفيفات سجل واحد (الشكل 1C). وكان الكشف عن حساسية من لوحات 384 جيد للمقارنة إلى أن من المقايسات لوحة 96-جيدا. عملت كل 10 1 و 10 2 PFU أفضل دائما في لوحات 384 جيد بالمقارنة مع 96-جيدا لوحات. استخدام كثافات مضان من 96 - أو صيغ لوحة 384 بشكل جيد، وضعنا منحنيات المعايرة القياسية (1D الشكل). في هذه الحسابات، المتغير الأول هو عيار الفيروس في حين أن المتغير الثاني هو كثافة مضان. لذا، كنا التوزيع الأسي لإنشاء منحنى يصلح لdetermالمعهد الوطني للإحصاء العلاقة متعدد الحدود بين التتر الفيروسية وكثافة مضان. والتحقق من صحتها ونحن أيضا ملاحظاتنا آخر باستخدام الأجسام المضادة التي يتم الموجهة ضد البروتين النووي (NP) من PR8 فيروس (لا تظهر البيانات). كما استخدمت مصادر مختلفة من سلالات PR8 لتصيب الخلايا MDCK التي تم اختبارها مع أو ضد NP-M2 لمكافحة الأجسام المضادة (لا تظهر البيانات). بشكل جماعي، فإننا نستنتج أن الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين صبغ النظام القائم يمكن أن تساعد في تشخيص اصابة السلالات الفيروسية وتعداد بالضبط عيار من مسببات العدوى.
اعتبارات رياضية لحساب التتر الفيروسية
وتتم عمليات حسابية من كثافة مضان والقرارات عيار كما هو موضح أدناه. بعد إجراء تلطيخ، وكميا لوحة كاملة أو آبار مختارة ضمن لوحة باستخدام LI-COR البرمجيات الأوديسة. باستخدام أداة الشكل التلقائي، تم رسم الحدود في منطقة الهدف (ROI) في وسط بئر اختبار من 96 - 384 أو نحن،ليرة لبنانية لوحات (الشكل 2A وباء). إنشاء ROI يسمح البرنامج للمقارنة بين الآبار خلفية محددة لعينات الفيروسات معاير. واستخدمت عائدات الاستثمار خلفية لتعيين قيمة أساسية لفحص كامل. تم إدخال اثنين من المعارضين عبر الشعر (أبيض) في العائد على الاستثمار لقياس كثافة مضان عبر البئر (الشكل 2C). منحنيات إلى الجانب الأيمن وأسفل الآبار ممثل في الشكل 2C تمثل شدة بكسل على طول هذه عبر الشعر. تم قياس كثافة فلوري في فترات زمنية موحدة من العائد على الاستثمار وأدمجت نقاط البيانات التي تم جمعها. تحديد ومضاعف قيمة الانحراف المعياري على مستوى الإشارات عبر خط الأساس التي تم تضمينها في تقرير عائدات الاستثمار. وكان كميا خلفية مضان من الأجسام المضادة وهمية المصابة أو الثانوية وحدها الضوابط والمستخدمة لتقدير شدة المتكاملة في اختبار الآبار. اخترنا شدة متكاملة لإجراء العمليات الحسابية لأنه REPRESالوالدان حجم بكسل الصافية للبقعة محددة وفردية مستقلة عن حجم الميزة. وبالإضافة إلى ذلك، كثافة متكامل مستقل إلى حد كبير من القرار. كثافة الكل / بكسل (I) يتوافق مع شدة إشارة الناجمة عن. اختيار جيد في منطقة بكسل (هل)، بالإضافة إلى الإشارة الناجمة عن خلفية من منطقة بكسل (ب) ولذلك، من أجل بكسل "أنا":
أنا أنا أنا ق = ط + ب ط
حجم بكسل يمثل على حد سواء حجم إشارة والمنطقة التي يتم توزيعها. وترتبط منطقة إشارة إلى توزيع العينة التي يتم توليد إشارة. حجم بكسل يساوي مجموع إشارة قياس بكسل في "أنا" في المنطقة (أ) من بكسل مرات ارتفاعه (I). ذلك لبكسل "أنا":
سادسا = أ أنا أنا
اجمالى حجم بكسل هو محصلة مجموع إشارة من المنطقة بأسرها على النحو التالي:
| ؛ | ن | ن | |
| V = | Σv أنا | = | aΣI أنا |
| أنا = 1 | أنا = 1 |
كثافة متكامل هو مجموع قيم كثافة كل بيكسل محاطة ميزة، مضروبا في مساحة الدائرة / المستطيل (العدد ملم 2). ولذلك، فإن كثافة متكاملة =
1 (ΣI ط - ب)
هنا، ب يقف لشدة خلفية بكسل متوسط. هذه الصيغة بحساب كثافة إشارة متكاملة للسيطرة أو الآبار التجريبية ويؤسس بذلك منحنى القياسية. وحسبت التتر الفيروسية في عينات الاختبار باستخدام هذا المنحنى القياسي. ويعرف التركيز (من شدة)، وكمية الحالي مضان في العائد على الاستثمار المحددة. التركيزات في عينات الاختبار هي calculaتيد بالنسبة لتركيزات محددة من المعايير في نفس الصورة. لحساب دقيق التتر الفيروسية، ويتم رسم كثافة من كل مستوى التركيز ومزودة الاستيفاء منحنى طويل. وتحسب لتركيزات عينات الاختبار من خلال مقارنة شدة من المساحة داخل منحنى القياسية.
تقرير من عيار الفيروسية من السوائل BAL من الفئران المصابة بالأنفلونزا
الكشف عن جسيمات حية الأنفلونزا الفيروسية في العينات السريرية والمخبرية له اهمية حاسمة. ولذلك، درسنا القادم ما اذا كان بامكاننا استخدام هذه الطريقة لتحديد عيار فيروسية في عينات المختبرات. وقد تم جمع السوائل BAL من الفئران غير المحصنين وارتفعت مع كمية معروفة من فيروس PR8. ومعاير خطيا السوائل BAL ارتفعت لتعداد التتر الفيروسية. واستخدمت Aliquots من السوائل BAL ارتفعت لتصيب الخلايا MDCK في لوحات 96-جيدا، ثابتة وملطخة secondar صبغ مترافق مكافحة M2 والأشعة تحت الحمراءالأجسام المضادة ذ. النتائج المبينة في الشكل 3A تثبت أن التتر الفيروسية في السائل BAL ارتفعت وكشف وارتباطا مع التتر PR8 في منحنى القياسية. باستخدام منحنى قياسي، وكان كميا أرقام دقيقة الفيروسية في السائل BAL ارتفعت ومعاير. قدمت الأسي الحسابات مناسبا منحنى مقياسا لحساب التتر الفيروسية في السائل BAL ارتفعت (الشكل 3B). من خلال هذه الطريقة حصلنا على العلاقات المتبادلة الممتازة بين التتر والفيروسية محسوبة وارتفعت، التحقق من صحة هذا النهج (الشكل 3C).
المقبل، قمنا بتحليل السائل BAL من PR8 المصابين الفئران. وقد استخدمت على نطاق واسع في PR8 نماذج الفئران لفهم الإنسان 3 حصانة علم الأمراض والفيروسات. أصيب الأنف مجموعات من الفئران مع 5000 PFU من PR8. تم رصد الفئران لفقدان الوزن، ظهور مرة أخرى متحدب والفراء تكدرت والأعراض السريرية الأخرى. في أيام 0، 2، 4، 7 و 10 من عدوى آخر،تم التضحية الفئران وجمعت السوائل BAL. للاستفادة من هذه العينات المختبرية، وحضنت الخلايا MDCK مع التخفيفات المسلسل من السوائل BAL في الحجم النهائي من 50 ميكرو لتر لمدة 17 ساعة في 96-جيدا لوحات. خدم الآبار السيطرة على خلايا مصابة MDCK التتر معروفة من فيروس PR8 الأوراق المالية لإنشاء منحنى القياسية. بعد الإصابة، وكانت تغسل الخلايا، ثابتة وملطخة مكافحة M2 الأجسام المضادة الأولية تليها الأضداد صبغ مترافق القريب من الأشعة تحت الحمراء الثانوية. MDCK الخلايا التي كانت وهمية المصابة أو التعامل مع الضوابط isotype بعد الإصابة قدمت كثافة مضان الخلفية لإجراء العمليات الحسابية عيار.
تحاليل السائل BAL أثبتت أن PR8 الفيروس في عينة المختبر قابلا للاكتشاف من خلال فحص الأشعة تحت الحمراء نظام قائم على الأصباغ. ولوحظ وجود زيادة كبيرة في الحمل الفيروسي في السائل BAL في أيام 2 و 4 إصابة آخر (الشكل 4A). وأشارت الحسابات من شدة المتكاملة التي السوائل BAL من أيام 2 و 4 من المشاركات Iالواردة nfection مستويات كبيرة من PR8 فيروس (الشكل 4B). نتائجنا تدل على فقدان الوزن تدريجيا لكنه مهم خلال المرحلة المبكرة من PR8 عدوى، مما يدل على شدة المرض. ومع ذلك، بدأت معظم الفئران يتعافى من أعراض المرض واكتساب الوزن 7 إصابة آخر أيام (الشكل 4C). تفتقر الفئران في إصابة آخر يوم 10 أي PR8 اكتشافها مما يدل على إزالة هذا الفيروس، الذي ارتبط أيضا مع الزيادة في وزن الجسم وتخفيضات كبيرة في أعراض المرض.
لمزيد من توسيع نطاق تطبيق هذا الاختبار، نحن اختبار عام 2009 الأنفلونزا A (H1N1) عزل الإنسان مع صبغية IR الضد نظام الكشف ومقارنتها مع فحص PCR في الوقت الحقيقي. تم عزل هذه عينة سريرية من مسحة مجتمعة البلعوم / الحلق تم الحصول عليها من المريض المشتبه بهم. وكان نشر في عزل في خط خلية MDCK في مختبر وزارة الصحة ميلووكي. وكانت نتائج الاختبار المقارنةالحمراء للتحقق من حساسية طريقة قائم على الأصباغ الحمراء لفحوصات PCR الوقت الحقيقي (الشكل 5). وتشير النتائج إلى أن الأشعة تحت الحمراء الكشف عن الأجسام المضادة صبغ النظام القائم لديه القدرة على كشف الحمل الفيروسي منخفضة تصل إلى TCID 3 10/50 مل، وهو مشابه لPCR القائم على فحص (10 TCID 50 / مل)، وتدخل في علاقة السريرية مجموعة لعينات معظم المرضى. هذه النتائج تقدم دليلا قويا على أن الأشعة تحت الحمراء نظام الفحص قائم على الأصباغ لديه حساسية كافية والقدرة على تطبيقها لتعداد عيار الفيروسية في المختبرات البحثية والسريرية.
الشكل 1. IR صبغية كشف المناعي للفيروس الانفلونزا. (أ) تحليلات المجهري متحد البؤر من إنفلونزا المصابين خلايا MDCK الشرائح في غرفة 8-جيدا. تحليل مجهري المناعي شرح أحادي الطبقة ملتصقة MDCK سليمة إلى حد كبير ومحملة فيروس المشتقة M2 بروتين. (قبل الميلاد) والكمي لالتتر الفيروسي على أساس صبغة الأشعة تحت الحمراء وLI-COR نظام أوديسي. (د) توليد من المنحنيات القياسية والأسي ملامح منحنى مناسبا. البيانات الواردة في AD تمثل خمس تجارب مستقلة.
الشكل 2. منهجية تحديد التتر الفيروسية باستخدام الأصباغ الحمراء. (A) المتكامل قياسات كثافة مضان. وشهدت منطقة محددة داخل آبار اختبار (ROI) لقياس كثافة مضان. باستخدام أداة الشكل التلقائي، جرى رسم الحدود من العائد على الاستثمار في وسط بئر اختبار من 96 - 384 أو جيدا لوحات. وقد تم قياس مضان كما بكسل الفردية (بكسل = ن) في العائد على الاستثمار. كثافة متكامل هو مجموع قيم كثافة كل بيكسل محاطة ميزة، مضروبا في مساحة الدائرة / المستطيل (العدد ملم 2). (ب) تحديد شدة متكاملة مضان في الآبار فحص. خلق من العائد على الاستثمارسمح الماسح الضوئي LI-COR للمقارنة بين الآبار خلفية محددة لعينات من فيروس معاير. وكان كميا خلفية مضان من الأجسام المضادة وهمية المصابة أو الثانوية وحدها الضوابط والمستخدمة لتقدير شدة المتكاملة في اختبار الآبار. (ج) جمع من نقاط البيانات في العائد على الاستثمار. تم إدخال اثنين من المعارضين عبر الشعر (أبيض) في العائد على الاستثمار لقياس كثافة مضان عبر البئر. منحنيات إلى الجانب الأيمن وأسفل الآبار ممثل تمثل شدة بكسل على طول هذه عبر الشعر.
الشكل 3. الكشف النوعي والكمي لالتتر الفيروس في سوائل PR8 BAL ارتفعت. (أ) تم زرعها في خلايا MDCK 96-جيدا لوحات بين عشية وضحاها، وأضاف مع PR8-BAL ارتفعت السوائل. كانت تقرأ لوحات في النظام أوديسي LI-COR. (ب) تمت مقارنة خارجيا السائل BAL ارتفعت مع المنحنيات القياسية. (ج) مقارنة بين VIR على حساب المتوقع التتر شركة. أسي منحنى المناسب المقدمة ص = 9.4784e 0.0014x. البيانات الواردة في AC هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة.
الشكل 4. الكشف النوعي والكمي لفيروس الانفلونزا في السوائل BAL من PR8 الفئران المصابة. (A) أصيبوا الأنف مجموعات من الفئران مع 5000 PFU من PR8. وحضنت الخلايا MDCK مع التخفيفات المسلسل من السوائل BAL في الحجم النهائي من 50 ميكروليتر لمدة 17 ساعة في 96-جيدا لوحات. بعد الإصابة، وكانت تغسل الخلايا، ثابتة وملطخة مكافحة M2 الأجسام المضادة الأولية تليها الأضداد صبغ مترافق IR الثانوية. لوحة أقصى اليمين يمثل منحنى القياسية. (ب) تحديد كميات من التتر الفيروسية في السائل BAL من الفئران المصابة. (ج) فقدان الوزن من الفئران خلال PR8 عدوى ترتبط مع الحمل الفيروسي. البيانات الواردة في AC هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة.
إعادة 5 "SRC =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
الشكل 5. الكشف النوعي والكمي لعام 2009 A (H1N1) الجائحة (الحركة الشعبية الديمقراطية) الأنفلونزا عزل من مريض الإنسان. (A) والأشعة تحت الحمراء صبغية كشف الأجسام المضادة نظام مضان لمدة نصف أضعاف المعايرة من خط الخلية المصابة MDCK. نتائج مضان تشير إلى فحص لديها القدرة على الكشف عن الحمل الفيروسي منخفضة تصل إلى 10 مل TCID 3/50. (ب) الأحماض النووية المستخرجة من ثقافة عزل جنبا إلى جنب مع التخفيفات عشرة أضعاف من مسلسل H1N1 1 titered معروف العزلة وحللت مع مركز السيطرة على الأمراض فحص PCR في الوقت الحقيقي 12. وكان الحد من الكشف عن الوقت الحقيقي PCR 10 TCID 50 / مل.
Discussion
اندلاع وباء انفلونزا الطيور مؤخرا في جنوب شرق آسيا والخوف العالمي من وباء انفلونزا الخنازير فرض مخاوف هائلة على الصحة والسلامة العامة. فقد تم تخصيص التركيز الحاسمة في توليد لقاحات للسلالات الحالية والجديدة من فيروس الانفلونزا. وسوف توفر تقنيات عالية الإنتاجية سريع للكشف عن حسابات دقيقة ودقيقة عيار الفيروسية تحسن بشكل هائل العلاج. التقنيات الأكثر شيوعا المستخدمة لحساب عيار فيروس تشمل فحوصات لوحة التراص تشكيل والأنفلونزا. وقد وضعت لأول مرة فحص لوحة تشكيل لتقدير التتر عاثية واعتمد من قبل Dulbecco ريناتو لحساب التتر فيروسي حيواني 4. لإجراء هذا الاختبار، يتم إعداد بمقدار 10 أضعاف التخفيفات من الأوراق المالية أو إنفلونزا عينات حيوانية مثل السائل BAL ويتم تلقيح 0،1 aliquots مل على لأحادي الطبقة من الخلايا MDCK في 6 لوحات جيدة. ولا يسمح للفيروس إلى كثف على الخلايا MDCK يليه إعلانdition من وسيط المواد الغذائية والاغاروز. أثناء الحضانة، والخلايا الأصلية المصابة الافراج عن سلالة الفيروسية التي تنتشر فقط على الخلايا المجاورة. تأثير ممرض للخلايا من عدوى الانفلونزا الفيروسية وتنتج منطقة دائرية من الخلايا المصابة تسمى لوحة. يفترض أن يتم تشكيل كل لوحة بعد الإصابة من خلية واحدة مع جسيمات الفيروس واحدة تليها تكرار الفيروس. ويمكن تعزيز التباين بين الخلايا الحية واللوحات وبواسطة الأصباغ مثل البنفسجي وضوح الشمس. والعيب الرئيسي من هذا الفحص هو عدم وجود استنساخ والتغيرات الهائلة في التجارب. آخر فحص تستخدم لتحديد عيار الأنفلونزا الفيروسية هو مقايسة التراص. الحاضر راصة دموية بروتين على سطح فيروس الانفلونزا تربط بكفاءة للبروتينات التي تحتوي على حامض N-acetylneuraminic في الثدييات والطيور خلايا الدم الحمراء 1. هذا التفاعل بين فيروس الانفلونزا وكريات الدم الحمراء ويؤدي إلى تراص في شكل شعرية. لامويستخدم إيفل من تراص لتقدير عيار من فيروس الانفلونزا في عينات الاختبار. وتستخدم كريات الدم الحمراء مقايسة التراص فقط لتحديد المعايرة من فيروس يعرف، ولا يمكن أن تستخدم لأغراض تحديد سلالة. منذ هذا الاختبار لا يفرق بين الحي والميت للفيروسات، فإنه من الصعب الحصول على حساب دقيق من التتر الفيروسية.
وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي عينة والثقافة الخلية 1،6. ووصف الطريقة الجديدة هنا أيضا إمكانية التشخيص السريري والمختبري. إنفلونزا كشف مجموعات Directigen الانفلونزا A. دينار بحريني (علوم الأحياء، سان خوسيه، كاليفورنيا) وBinaxNow (Binax، وشركة، سكاربورو، ME) استخدام فحص للكشف عن immunochromatography مستضد الفيروسية مثل البروتين النووي 7 ويمكن استخدام هذه المجموعات، والكشف عن فيروس يمكن تحقيقه في غضون 15 دقيقة، ولكن جميع العينات سلبية من الضروري أن تكون الصورة أيضاcreened من قبل خلية أسلوب ثقافة. وأفادت دراسات مختلفة أيضا انخفاض الحساسية لهذه المجموعات، وخصوصا، عندما العدوى كانت معتدلة أو منخفضة 8. في طريقة لنا، ونحن باستمرار اكتشاف ما يصل الى 100 PFU من الفيروس. وهذا يوحي لنا تقنية مفيدة في الكشف عن الفيروس H1N1 في العينات السريرية، حتى عندما تكون الإصابة خفيفة. وتم الإبلاغ عن طريقة مضان القائم على كشف المستضدات الفيروسية، حيث تم تحليل العينات إما بشكل مباشر أو نضح البلعوم تم تلقيح في الصعود إلى أحادي الطبقة من الخلايا عرضة لتكاثر الفيروس والتحليلات اللاحقة 9. ومع ذلك، وتقتصر هذه الطرق لأغراض التشخيص وغير مناسبة لإجراء العمليات الحسابية عيار الفيروس. Q-PCR يساعد على تحديد وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي ولا تقدير العدوى من فيروسات حية. بالمقارنة مع هذه المقايسات، والأشعة تحت الحمراء نظام الفحص قائم على الأصباغ مساعدة في الكشف عن والفيروسية تعداد عيار في العينات السريرية والمخبرية. في حالة اندلاع الانفلونزا، فمنحاسم لتشخيص آلاف العينات في فترة زمنية قصيرة. يمكن أن أسلوبنا يستند على طبق من 384 جيدا، والماسحة الضوئية الحمراء تفحص 6 لوحات في وقت واحد (> 2000 عينة)، وتقدم بالتالي أكبر ميزة على أساليب أخرى فلوري مباشرة. يمكن أن الجدوى من سرعة معالجة الآلاف من العينات السريرية تقليل اختبار تقلباته، وطول الوقت وتكاليف الفحص. استخدام جسم مضاد M2 محددة توفر ميزة كونها مستقلة عن الخلافات السلالة في البروتينات H و N. يتم حفظها نسبيا من البروتين M2، في معظم سلالات الأنفلونزا تصيب البشر. إذا يتم الجمع بين الأضداد محددة لالبقع المنتشرة مع نظامنا لا يمكن للمرء قياس كل من عيار من الفيروسات والتعرف على السلالة. ومع ذلك، منذ M2 هو الهدف لهذه الأدوية مثل الأمانتادين، يمكن أن تنشأ المسوخ التي قد تغيير موقع ملزم لخريطة موقع المستخدمة هنا. وهذا يمثل الحد المحتملة لهذا النظام في الأفراد الذين يخضعون للعلاج بواسطة هذه العقاقير.
متعدديتم استخدام فحوصات تعداد التتر الأنفلونزا في عينات الاختبار. لحساب فيروس عيار، 50٪ جرعة زراعة الأنسجة المعدية (TCID 50) والبيض السقائي فحوصات السائل المستندة إلى وتستخدم على نطاق واسع 1،10. ومع ذلك، متطلبات عدة أيام جعل هذه الأساليب أقل موثوقية. علاوة على ذلك، في هذه الأساليب الحسابات على اساس تغير 50٪ في عدد من لوحات توفير المعايرة الفيروسية النظرية ولكن ليست دقيقة. لا يمكن أن يؤديها لوحة تشكيل المقايسات خلال 96 ساعة، ولكن عدم وجود استنساخ هو مصدر قلق كبير في العمليات الحسابية عيار الفيروسية. الأسلوب الحالي وصفها هنا له مزايا عدة متميزة. الأول، وهو أسلوب استنساخه للغاية مع نتائج متسقة. وتستند الثانية، وحسابات عيار الفيروسية في تقدير بسيط من كثافة مضان أن تتم مقارنة ضد منحنيات معيار محدد. الثالث، ويمكن استخدام اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية لتشخيص الأنماط المصلية متعددة في نموذج معين. أيضا، IR صبغ مترافق الأجسام المضادة لها قطرةوقد استخدمت شركة تألق ذاتي والتصوير الخلية 11. الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة المرئية (300-600 نانومتر) النتائج في تألق ذاتي الخلوية مرتفعة بسبب وجود fluorophores ذات العوائد المرتفعة الكم الذاتية. وتشمل هذه الأحماض الأمينية العطرية ويبو أصباغ، النيوكليوتيدات pyridinic (NADPH)، الإيلاستين والكولاجين والإنزيمات المساعدة فلافين. هذه الخاصية الجوهرية للخلايا يجعل من الصعب الاستفادة من هذه المصادر من الإشعاع كما مجسات لقياس التعبير عن بروتينات معينة. في المقابل، القريب من الأشعة تحت الحمراء الأصباغ تثير وتطلق بين 670-1000 نانومتر. جزيئات المضيف العديد من الخلوية والهيدروكربونات العطرية المتعددة لا تثير في هذه الموجة، ونظرا لتشتت الضوء المنخفض، تنبعث منها منخفضة للغاية مضان الخلفية. علاوة على ذلك، وطرأ تحسن كبير على النافذة الخلفية وبين كشف محددة نتيجة لمعامل انقراض عالية من fluorophores القريب من الأشعة تحت الحمراء. صمود للضوء، متفوقة إشارة إلى نسبة الضوضاء، وثيق الصلة للغاية في تحديد مقدار التتر الفيروسية. استخدام microflوسوف الغرف uidic أتمتة عملية الفرز من خلال الضوابط الروبوتية، ويمكن أن تسمح لنا لاختبار عينات سريرية شديدة العدوى بسهولة. وهكذا، فإن استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأصباغ في هذه الأساليب هو المثالي وموثوق بها للغاية لتعداد التتر فيروسية في عينات الأنسجة.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل في شكل منح المعاهد الوطنية للصحة جزء R01 A1064826-01، U19 AI062627-01، NO1، HHSN26600500032C (لSM). ونحن نشكر أعضاء مختبرنا للحصول على مساعدة مناقشة والتقنية، وتينا هايل لمراجعة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر ديفيد بينا، وميلووكي مختبر وزارة الصحة للثقافة وفيروس PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A. Fluorescent proteins: into the infrared. Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
