Summary
Denne metoden beskriver bruk av Infrarød fargestoffbaserte imaging system for påvisning av H1N1 i bronchioalveolar lavage (BAL) væske av infiserte mus på en høy sensitivitet. Denne metodikken kan utføres i en 96 - eller 384-brønnen plate, krever <10 mL volum av testmateriale og har potensial for samtidige screening av flere patogener.
Abstract
Influensa virus er en luftveissykdom patogen som forårsaker en høy grad av sykelighet og dødelighet hvert år i flere deler av verden. Derfor er presis diagnose av infisere belastning og raske high-throughput screening av store mengder kliniske prøver viktig for å kontrollere spredningen av pandemisk infeksjoner. Aktuelle kliniske diagnoser av influensa infeksjoner er basert på serologisk testing, polymerase kjedereaksjon, direkte prøven immunfluorescens og cellekultur 1,2.
Her rapporterer vi utviklingen av en roman diagnostisk teknikk som brukes til å oppdage live influensavirus. Vi brukte musen tilpasset menneskelig A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-viruset 3 for å teste effekten av denne teknikken bruker MDCK celler 4. MDCK celler (10 4 eller 5 x 10 3 per brønn) ble dyrket i 96 - eller 384-vel plater, infisert med PR8 og virale proteiner ble oppdaget ved hjelp av anti-M2 etterfulgt av en IR dye-konjugert sekgående antistoff. M2 5 og hemagglutinin en er to viktige markører proteiner som brukes i mange ulike diagnostiske analyser. Sysselsetter IR-dye-konjugerte sekundære antistoffer minimert autofluorescens assosiert med andre fluorescerende fargestoffer. Bruken av anti-M2 antistoff tillot oss å bruke den antigen-spesifikk fluorescens intensitet som en direkte beregning av viral kvantitet. For å nummerere fluorescensintensiteten vi brukt LI-COR Odyssey-baserte IR skanner. Dette systemet bruker to-kanals laser-baserte IR deteksjoner å identifisere fluorophores og skille dem fra bakgrunnsstøy. Den første kanalen Stimulerer ved 680 nm og avgir ved 700 nm for å hjelpe kvantifisere bakgrunnen. Den andre kanalen oppdager fluorophores som opphisse på 780 nm og et utslipp på 800 nm. Skanning av PR8-infiserte MDCK celler i IR skanneren indikert en viral titer-avhengig lyse fluorescens. En positiv korrelasjon av fluorescens intensitet til virus titer fra 10 2 -10 5 PFU kunne consistently observert. Minimal men påviselig positivitet konsekvent sett med 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titere demonstrerte den høye følsomheten på nær-IR fargestoffer. Signal-til-støy-forhold ble bestemt ved å sammenligne mock-infiserte eller isotype antistoff-behandlede MDCK celler.
Bruke fluorescens intensiteter fra 96 - eller 384-brønns plate formater, bygget vi vanlige titrering kurver. I disse beregningene, er den første variabelen viral titer mens den andre variabelen er fluorescens intensitet. Derfor har vi brukt eksponentialfordelingen å generere en kurvetilpasning å bestemme polynomet forholdet mellom viral titere og fluorescens intensiteter. Samlet konkluderer vi at IR dye-basert protein detection system kan hjelpe diagnostisere infiserer virusstammer og presist nummerere titer av smitte patogener.
Protocol
1. MDCK celler kultur
- Kultur 5 millioner MDCK celler overnatting i en T-75 cm 2 kolbe i 20 ml RPMI1640 komplett medium med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, 1 mm natrium pyruvat, 5% av 7,5% natriumbikarbonat løsning og 0,001% β-mercaptoethanol i en 37 ° C inkubator infused med 5,2% CO 2.
2. PR8 infeksjon og BAL væskeansamling
- Challenge C57BL / 6 mus intranasalt med 5000 PFU av PR8 virus i sterile PBS i et totalt volum på 30 mL gjennom ett nesebor. Gjennomføre mock infeksjoner med bare sterilt PBS uten viruset.
- Avlive 0 mus, 2, 4 og 7 dager etter smitte og kutte brysthula åpne og lage en 1 cm snitt parallell til luftrøret gjennom pelsen av musen til å avsløre den.
- Lag en midtlinjen snitt på den proksimale del av luftrøret.
- Sette mot trachea med 0,5 ml PBS-1% BSA og aspirer BAL væske. BAL væsker kan lagres i -20 ° C fryser til det brukes.
3. Virusinfeksjon og påvisning av viral matrix protein (M2) med LI-COR Odyssey
- For å kvantifisere de virale titere bruker infrarøde dye-konjugerte antistoffer, høste MDCK celler fra T-75 cm 2 kolber og plate dem i optisk flat bunn svart 96-brønnen (10.000 celler per brønn) eller 384-brønnen (5000 celler per brønn ) plater. Kultur de MDCK cellene for overnatting ved 37 ° C i RPMI1640 fullstendig medium og vask to ganger med serum-free DMEM inneholder BSA (0,2%, vekt / volum), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 mikrogram / ml), natrium pyruvat (1 mm), natriumbikarbonat løsning (5% av 7,5%) og β-mercaptoethanol (0,001%).
- Inkuber MDCK cellene med BAL væske (50 mL for 96-brønn plate eller 10 mL for 384-brønns plate) eller PR8 virus med kjente titere i hver brønn med tilsvarende volum (50 mL for 96-brønn plate eller 10 mL for 384 - brønn plate) av DMEM medium,inneholder L-1-tosylamido-2-Phenylethyl Chloromethyl ketone (TPCK)-behandlet trypsin (0,2 mikrogram / ml).
- Etter 1 t for infeksjon, tilsett 100 mL (96-brønn plate) eller 20 mL (384-brønns plate) på 10% FBS-inneholder RPMI1640 komplett medium til hver brønn.
- Fortsett dyrking MDCK celler for en annen 16 h for smitte, vaske MDCK cellene to ganger med 100 mL (96-brønn plate) eller 20 mL (384-brønns plate) av PBS-1% BSA-løsning og fikse med 100 mL (96-brønn plate) eller 20 mL (384-brønns plate) på 1% paraformaldehyde i 5 min.
- Etter festing, Inkuber MDCK cellene videre i 30 min med 100 mL (96-brønn plate) eller 20 mL (384-brønns plate) av PBS-1% BSA for blokkering.
- Etter blokkerer Inkuber MDCK cellene i 1 time med primær antistoff mot M2 protein (1:1000, fortynnet i PBS-1% BSA). Bruk 50 mL per brønn og 20 mL fortynnet antistoff per brønn i 96-brønn eller 384-brønnen plater, henholdsvis.
- Vask MDCK celler tre ganger med 100 mL (96-brønn plate) Eller 20 mL (384-brønns plate) av PBS som inneholder 1% BSA og inkuber i 1 time med 50 mL (96-brønn plate) eller 20 mL (384-brønns plate) geit anti-mus IRDye @ 800 sekundært antistoff ( 1:200 fortynning).
- Vask MDCK celler tre ganger med 100 mL PBS som inneholder 1% BSA. Plasser de fargede platene på lesing glass plattform av LI-COR Odyssey IR skanner og setter leseren for en 96 - eller 384-brønnen plate lesing.
- Blanke negative kontroll brønner kan stilles inn med LI-COR Odyssey programvare. Kvantifisere hel plate eller utvalgte brønner innen plate med LI-COR Odyssey programvare.
- Bruke Auto Shape Tool, trekke grensene for et mål region (ROI) i midten av en testbrønn av 96 - eller 384-brønns plater. Opprettelse av ROI tillater programvaren å sammenligne de definerte bakgrunnen brønnene til virus-titrerte prøver.
- Hvis du vil angi grunnlinjen verdi for hele analysen, bruke en bakgrunn avkastning. Innføre de to motstående trådkorset levert av Odyssey programvare innenfor ROI å målesre intensiteten av fluorescens over brønnen.
- Skann plater med 780 nm kanal for deteksjon og 680 nm som referanse bølgelengde i en LI-COR Odyssey IR skanner.
- Når 'Read' kommandoen er aktivert, vil de fluoriserende intensiteter på ensartede intervaller av avkastningen måles og de innsamlede datapunkt integrert. En standard avvik multiplikator vil bestemme nivået på signalet over grunnlinjen som er inkludert i avkastningen besluttsomhet.
- Bakgrunnsfluorescens skal kvantifiseres fra modellvaksinen infiserte eller sekundært antistoff alene styrer og vil bli brukt til å estimere den integrerte intensiteten i testbrønner.
- Velg "integrert intensitet 'for beregninger fordi den representerer netto piksel volum for en definert individuell spot og er uavhengig av funksjon størrelse. Bruk standard kurve fra de kjente viral titere å beregne viral titere av ukjente prøver. Bruk en lang interpolering kurve til nettopp beregne viral titere. Beregn viral titere i stikkprøvene ved å sammenligne intensiteter av stikkprøvene med standard kurve.
4. Representative Resultater
Standardisering av IR dye-basert høy gjennomstrømning viral deteksjonssystem
PR8 viruset kan infisere MDCK celler, og derfor brukte vi disse cellene til å utvikle denne analysen. Vi målte virale titere ved hjelp av en primær antistoff mot en influensa viral matrise protein (M2). I motsetning til andre metoder, brukte vi en sekundær antistoff som er konjugert til en nær-IR fargestoff. Denne metoden gir en enkel, automatisert PR8 virus titer besluttsomhet hjelp fluorescensintensiteten som genereres mens oppdage M2 protein. Etter influensa virus infeksjon, er M2 protein oversatt, transportert og akkumuleres i vertscellen inkludert celleoverflaten. Dermed representerer mengden av M2 protein en målbar parameter for å bestemme mengden av viruset. Sammenligning av intensiteter frastikkprøvene med standard kurve gir presis måling av viral titere.
For å bestemme effekten av fluorescens-basert metode, vi kultivert 10 4 MDCK celler / brønn i kammeret glir over natten. PR8 viral bestander av kjente titere ble lagt til duplisere brønner med ulike plakk dannende enheter (PFU) og lov til å adsorberes på cellene i en time. Celler ble inkubert i 16 timer for å la viruset å formere seg. Etter dette ble MDCK cellene i kammeret lysbildene festes med 1% paraformaldehyde, vasket og beiset med anti-M2 antistoff i 1 time, etterfulgt av AlexaFluor 488-konjugert sekundært antistoff for en ytterligere 1 time. Confocal mikroskopiske analyser av infiserte MDCK celler demonstrerte heftende monolayer var stort sett intakt, og PR8-avledet M2 protein var rikelig tilstede inne i infiserte MDCK cellene (Figur 1a). Fluoriserende celler kan påvises i infeksjoner med virus-titer så lav som 10 2
Derfor, for å etablere en nøyaktig viral beregningsmetode vi ansatt en IR dye-basert deteksjon og kvantifisering system. MDCK celler (10 4 / brønn) ble dyrket i 96-brønners plater, infisert med PR8 og virale proteiner ble oppdaget ved hjelp av anti-M2 etterfulgt av en IR dye-konjugert sekundært antistoff. Bruken av anti-M2 antistoff tillot oss å bruke den antigen-spesifikk fluorescens intensitet som en direkte beregning av viral kvantitet. For å nummerere fluorescensintensiteten vi brukt LI-COR Odyssey-baserte IR skanner. Dette systemet bruker to kanaler laser-based IR deteksjoner å identifisere fluorophores og skille dem fra bakgrunnsstøy. Den første kanalen Stimulerer ved 680 nm og avgir ved 700 nm for å hjelpe kvantifisere bakgrunnen. Den andre kanalen oppdager fluorophores som opphisse på 780 nm og et utslipp på 800 nm. Skanning av PR8-infiserte MDCK celler i LI-COR Odyssey indikerte en viral titer-avhengig lyse fluorescens (Figur 1B). M2 positive fluorescerende MDCK celler var godt synlig på innsiden av brønnene (Figur 1B). En positiv korrelasjon av fluorescens intensitet til virus titer fra 10 2 -10 5 PFU kunne være konsekvent observert. PR8 virale titreringer høyere enn 10 6 PFU fører til celledød, som setter en øvre grense for følsomheten til analysen. Minimal men påviselig positivitet konsekvent sett med 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titere demonstrerte den høye følsomheten på nær-IR fargestoffer. Signal-til-støy-forhold ble bestemt ved å sammenligne MOCk-smittet eller isotype antistoff-behandlede MDCK celler. Begge disse kontrollene resultert i ubetydelig eller ikke målbare nivåer av fluorescens (figur 1b).
For ytterligere å forbedre følsomheten og for å redusere prøven volum krav, infisert vi 5 × 10 3 MDCK celler / brønn i 384-brønns plater. Ulike PFUs av PR8 ble testet som serielle én stokk fortynninger (figur 1C). Følsomhet fra 384-vel platene var sammenlignbar med de 96-brønns plate analyser. Både 10 1 og 10 2 PFU jobbet konsekvent bedre i 384-brønns plater i forhold til 96-brønns plater. Bruke fluorescens intensiteter fra 96 - eller 384-brønns plate formater, bygget vi standard titrering kurver (figur 1D). I disse beregningene, er den første variabelen viral titer mens den andre variabelen er fluorescens intensitet. Derfor har vi brukt eksponentialfordelingen å generere en kurvetilpasning til determine polynomet forholdet mellom viral titere og fluorescens intensiteter. Vi har også validert våre observasjoner ved hjelp av en annen antistoff som er rettet mot nucleoprotein (NP) av PR8 virus (data ikke vist). Distinkte kilder til PR8 isolatene ble også brukt til å infisere MDCK celler som ble testet med anti-NP eller anti-M2 antistoffer (data ikke vist). Samlet konkluderer vi at IR dye-basert protein detection system kan hjelpe diagnostisere infiserer virusstammer og presist nummerere titer av smitte patogener.
Matematiske hensyn for beregning viral titere
De matematiske beregningene av fluorescens intensitet og titer bestemmelser er gjort som beskrevet nedenfor. Etter farging prosedyren, er hel plate eller utvalgte brønner innen plate kvantifiseres LI-COR Odyssey programvare. Bruke Auto Shape Tool, ble grensene for et mål region (ROI) tegnet i midten av testbrønner på 96 - eller 384-vill plater (Figur 2A og B). Opprettelse av ROI tillater programvaren å sammenligne de definerte bakgrunnen brønnene til virus-titrerte prøver. En bakgrunn ROI ble brukt til å angi grunnverdi for hele analysen. To motstridende trådkors (hvit) ble introdusert i ROI for å måle intensiteten av fluorescens over brønnen (figur 2C). Kurver til høyre side og under de representative brønnene i figur 2C representerer intensiteten av piksler langs disse trådkors. De fluoriserende intensiteter på ensartede intervaller av avkastningen ble målt, og de innsamlede datapunkt ble integrert. Et standardavvik multiplikator fastsatt nivået på signalet over grunnlinjen som ble inkludert i avkastningen besluttsomhet. Bakgrunnsfluorescens ble tallfestet fra modellvaksinen infiserte eller sekundært antistoff alene kontroller og brukes til å estimere den integrerte intensiteten i testbrønner. Vi valgte integrert intensitet for beregningene fordi det representene netto pixel volum for en definert individuell spot og er uavhengig av funksjon størrelse. I tillegg er integrert intensitet hovedsak uavhengig av oppløsning. Totalt intensitet / pixel (I) tilsvarer signalet intensitet som følge av valgt brønnen i pixel-området (Er) pluss signalet som oppstår på bakgrunn av pixel område (b). Derfor, for piksel 'i':
Jeg i = jeg er i + b i
Pixel volum representerer både omfanget av signalet og området hvor det er fordelt. Signal-området er knyttet til fordelingen av prøven som genererer signalet. Det pixel volum er lik total signal målt i pixel 'i' i området (a) i pixel ganger sin høyde (I). Så for pixel 'i':
VI = en jeg i
Total piksel volum er summering av total signal fra hele området slik:
| ; | n | n | |
| V = | Σv i | = | aΣI i |
| i = 1 | i = 1 |
Integrert intensitet er summen av intensitet verdier av alle piksler omsluttet av funksjonen, multiplisert med arealet av sirkelen / rektangel (count mm 2). Derfor den integrerte intensitet =
en (ΣI i - b)
Her står b for den gjennomsnittlige bakgrunnen pikselintensiteten. Denne formelen beregner integrerte signal intensiteter av kontroll eller eksperimentelle brønner og dermed etablerer en standard kurve. Viral titere i stikkprøvene ble beregnet ved hjelp av denne standardkurve. Konsentrasjon (av intensitet) er definert som den mengde fluorescens stede i en definert avkastning. Konsentrasjoner i stikkprøvene er beregTed forhold til de definerte konsentrasjoner av standardene i det samme bildet. For å beregne de nøyaktige viral titere, er intensiteten av hver konsentrasjon standard plottet og utstyrt med en lang interpolering kurve. Konsentrasjonene av stikkprøvene er beregnet ved å sammenligne intensiteten av området innenfor standardkurve.
Bestemmelse av virale titere fra BAL væske av influensa infiserte mus
Påvisning av levende influensa viruspartikler i kliniske og laboratorie prøver er av avgjørende betydning. Derfor har vi neste undersøkt om vi kan utnytte denne metoden for å bestemme viral titere i laboratorieprøver. BAL væske ble samlet inn fra ikke-immunisert mus og tilsatt en kjent mengde PR8 virus. Piggete BAL væsker ble lineært titreres for opplisting av virale titere. Alikvoter av piggete BAL væsker ble brukt til å infisere MDCK celler i 96-brønners plater, fast og farget med anti-M2 og IR dye-konjugert secondary antistoffer. Resultater er vist i figur 3A viser at de virale titere i spiked BAL væske var påvisbar og korrelert med PR8 titere i standardkurve. Bruke standardkurven, ble presise virale tall i spiked og titreres BAL væske kvantifisert. Eksponentiell kurve fit beregninger forutsatt et tiltak for å beregne de virale titere i spiked BAL væske (Figur 3B). Gjennom denne metoden fikk vi gode korrelasjoner mellom de beregnede og piggete viral titere, validere denne tilnærmingen (Figur 3C).
Deretter analyserte vi BAL væske fra PR8-infiserte mus. PR8 har vært mye brukt i murine modeller for å forstå menneskelig patologi og anti-viral immunitet tre. Grupper av mus ble intranasalt smittet med 5000 PFU av PR8. Musene ble overvåket for vekttap, utseende krum rygg, ruffled pels og andre kliniske symptomer. På dager 0, 2, 4, 7 og 10 av post infeksjon,Musene ble ofret og BAL væsker ble samlet inn. For å utnytte disse laboratorieprøvene, ble MDCK celler inkubert med serielle fortynninger av BAL væske i en endelig volum på 50 mL for 17 h i 96-brønners plater. Kontroll brønner MDCK celler infisert med kjente titere på lager PR8 virus servert å generere en standard kurve. Etter infeksjon ble cellene vasket, fikset og farget med anti-M2 primære antistoff fulgt av nær-IR dye-konjugert sekundært antistoff. MDCK celler som var mock-smittet eller behandlet med isotype kontroller etter smitte, forutsatt at bakgrunnsfluorescens intensitet for titer beregninger.
Analyser av BAL væske viste at PR8 virus i laboratoriet prøven er synlig gjennom IR dye-baserte analysen system. En betydelig økning i virusmengde i BAL væske ble observert på dag 2 og 4 innlegg infeksjon (figur 4A). Beregninger av integrerte intensitet indikerte at BAL væske fra dag 2 og 4 av Post infection inneholdt betydelige nivåer av PR8 virus (Figur 4B). Våre resultater viser en gradvis, men betydelig vekttap i løpet av tidlig fase av PR8 infeksjon, viser alvorlighetsgraden av sykdommen. Likevel begynte de fleste mus utvinne fra sykdom symptomer og økende vekt 7 dager etter smitte (Figur 4C). Mus på dag 10 etter smitte manglet påvisbare PR8 indikerer klarering av viruset, som også korrelert med økningen i kroppsvekt og betydelige reduksjoner i sykdomssymptomer.
For ytterligere å utvide anvendelsen av denne analysen, testet vi en 2009 A (H1N1) human influensa isolere med IR dye-basert antistoff deteksjon system og sammenlignet den med real-time PCR analysen. Denne kliniske prøven ble isolert fra et kombinert nasofaryngeal / halsprøve innhentet fra mistenkt pasient. Den isolere ble dyrket i MDCK cellelinje ved Milwaukee Health Department Laboratory. Testresultatene var selrødt for å sjekke følsomheten til IR dye-basert metode for å real-time PCR-analyser (figur 5). Resultatene tyder på at IR fargestoffbasert antistoff detection system har potensial til å oppdage virusmengde så lavt som 10 3 TCID 50 / ml, som er sammenlignbart med PCR-baserte analysen (10 TCID 50 / ml) og faller innenfor den kliniske relevansen rekkevidde for de fleste pasientprøver. Disse resultatene gir sterke bevis for at IR dye-baserte analysen systemet har tilstrekkelig sensitivitet og potensial til å bli brukt for viral titer oppregning i forskningslaboratorium og kliniske settinger.
Figur 1. IR dye-basert immune påvisning av influensavirus. (A) confocal mikroskopiske analyser av influensa-infiserte MDCK celler i åtte-brønns kammermusikk lysbilder. Immunfluorescens mikroskopiske analyser demonstrere heftende MDCK monolayer er stort sett intakt, og lastet med virus-derived M2 protein. (BC) Kvantifisering av virale titere basert på IR fargestoff og LI-COR Odyssey system. (D) Generasjon av standard kurver og eksponentiell kurve-fit profiler. Data presentert i AD er representative for fem uavhengige eksperimenter.
Figur 2. Metodikk for fastsettelse virale titere via IR fargestoffer. (A) Integrerte fluorescensintensiteten målinger. Et definert område inne i testbrønner (ROI) ble markert for å måle fluorescens intensiteter. Bruke Auto Shape Tool, ble grensene til ROI trukket i midten av testbrønner på 96 - eller 384-brønnen plater. Fluorescens ble målt som individuelle bildepunkter (pixel = n) innenfor ROI. Integrert intensitet er summen av intensitet verdier av alle piksler omsluttet av funksjonen, multiplisert med arealet av sirkelen / rektangel (count mm 2). (B) Fastsette integrerte fluorescens intensiteter i mikrotiterbrønnene. Opprettelse av ROItillot LI-COR skanner å sammenligne de definerte bakgrunnen brønnene til virus-titrerte prøver. Bakgrunnsfluorescens ble tallfestet fra modellvaksinen infiserte eller sekundært antistoff alene kontroller og brukes til å estimere den integrerte intensiteten i testbrønner. (C) Samling av datapunkter innen ROI. To motstridende trådkors (hvit) ble introdusert i ROI for å måle intensiteten av fluorescens over brønnen. Kurver til høyre side og under de representative brønnene representerer intensiteten av piksler langs disse trådkors.
Figur 3. Påvisning og kvantifisering av virus titer i PR8 piggete BAL væsker. (A) MDCK cellene ble dyrket i 96-brønners plater over natten og lagt med PR8-spiked BAL væske. Plater ble lest i LI-COR Odyssey system. (B) eksogent spiked BAL væske ble sammenlignet med standard kurver. (C) Sammenligning av beregnet forventet Vir al titere. Eksponentiell kurvetilpasning gitt y = 9.4784e 0.0014x. Data presentert i AC er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Figur 4. Påvisning og kvantifisering av influensavirus i BAL væsker fra PR8 infiserte mus. (A) Grupper av musene ble intranasalt smittet med 5000 PFU av PR8. MDCK celler ble inkubert med serielle fortynninger av BAL væske i en endelig volum på 50 mL for 17 h i 96-brønners plater. Etter infeksjon ble cellene vasket, fikset og farget med anti-M2 primære antistoff etterfulgt av IR dye-konjugert sekundært antistoff. Lengst til høyre panelet representerer standardkurve. (B) Kvantifisering av virale titere i BAL væske av infiserte mus. (C) Vekttap av mus i løpet PR8 infeksjon korrelert med virusmengde. Data presentert i AC er representative for tre uavhengige eksperimenter.
re 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
Figur 5. Påvisning og kvantifisering av 2009 A (H1N1) pandemi (PDM) influensa isolere fra et menneskelig pasient. (A) IR dye-basert antistoff fluorescens system deteksjon for halv ganger titrering av infiserte MDCK cellelinje. Fluorescens Resultatene indikerer at analysen har potensial til å oppdage virusmengde så lavt som 10 3 TCID 50 / ml. (B) nukleinsyre hentet fra kultur isolere sammen med serielle ti-fold fortynninger av en kjent titered H1N1 isolat ble analysert med CDC real-time PCR assay 12. Deteksjonsgrense for real-time PCR var 10 TCID 50 / ml.
Discussion
Den nylige epidemi utbrudd av aviær influensa i Sørøst-Asia og en global frykt for svineinfluensa pandemien pålegge enorme bekymringene til offentlig helse og sikkerhet. Kritisk fokus har vært dedikert i å generere vaksiner for eksisterende og nyere varianter av influensavirus. Tilgjengelighet av raske high-throughput teknologier for presis påvisning og nøyaktige virale titer beregninger vil enormt forbedre behandlingen. De mest brukte teknikkene benyttes til å beregne virus titer inkluderer plakk forming og influensa hemagglutination analyser. Den plakk danner analysen ble først utviklet for å beregne bakteriofag titere og ble adoptert av Renato Dulbecco å beregne dyr viral titere 4. For å utføre denne analysen, er 10-fold fortynninger av influensa lager eller dyr prøvene som BAL væske forberedt og 0,1 ml alikvoter er inokulert på monolayer av MDCK celler i seks-brønns plater. Viruset er lov til å adsorberes på de MDCK cellene etterfulgt av annonsendition av et næringsstoff medium og agarose. Under inkubasjon de opprinnelige infiserte cellene slipper viral avkom som spres bare til nabocellene. Den cytopathogenic Effekten av influensa virusinfeksjon produserer en sirkulær sone av infiserte celler som kalles en plakett. Hver plakk er trolig dannet etter infeksjon av en enkelt celle med en enkelt virus partikkel etterfulgt av replikering av virus. Kontrasten mellom de levende cellene og plaketter kan bli styrket ved fargestoffer som krystallfiolett. En stor ulempe med denne analysen er manglende reproduserbarhet og store variasjoner innenfor eksperimenter. En annen test som benyttes til å bestemme influensa viral titer er hemagglutination analysen. Den hemagglutinin protein som finnes på overflaten av influensavirus binder effektivt til N-acetylneuraminic syre-holdige proteiner på pattedyr og aviær røde blodlegemer 1. Dette samspillet mellom influensavirus og erytrocytter fører til agglutinasjon i form av et gitter. Det lEvel av agglutinasjon brukes til å anslå titer av influensavirus i prøvestykkene. Erytrocytt agglutinasjon analysen brukes kun til å bestemme titrering av en kjent virus og kan ikke brukes for belastning identifikasjon. Siden denne analysen ikke skiller mellom levende og døde virus, er det vanskelig å få en presis beregning av viral titere.
Aktuelle kliniske diagnoser av influensa infeksjoner er basert på serologisk testing, polymerase kjedereaksjon, direkte prøven immunfluorescens og cellekultur 1,6. Den nye metoden som beskrives her har også klinisk og laboratoriemessig diagnostikk potensial. Influensa deteksjon kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) og BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) bruk immunochromatography analyse for å påvise viral antigen som nucleoprotein 7. Ved hjelp av disse pakkene, påvisning av virus kan oppnås innen 15 min, men alle negative prøver å være ytterligere screened av cellekultur metoden. Ulike studier har også rapportert lav følsomhet av disse pakkene, spesielt, da infeksjon var mild eller lav 8. I vår metode, vi konsekvent oppdage så lavt som 100 PFU av virus. Dette tyder på vår teknikk er nyttig i å avdekke H1N1-viruset i kliniske prøver, selv når infeksjonen er mild. En fluorescens-basert metode for å oppdage virus antigener har blitt rapportert, hvor enten nasofaryngeale aspirer prøvene ble direkte analysert eller ble inokulert på en monolayer av mottakelige celler for virus multiplikasjon og påfølgende analyser 9. Imidlertid er disse metodene begrenset for diagnostiske formål og er ikke egnet for virus titer beregninger. Q-PCR bidrar til å identifisere tilstedeværelsen av virus RNA og ikke anslå ikke smittsomhet av levende virus. Sammenlignet med disse prøvene, vil IR dye-basert analysen system bidra i deteksjon og viral titer telling i kliniske og laboratorieprøver. I tilfelle av influensa utbrudd, er detkritisk for å diagnostisere tusenvis av prøver i en kort tidsperiode. Vår metode basert på en 384-brønns plate og IR skanner kan skanne 6-plater i en tid (> 2.000 prøver), derfor tilbyr en større fordel fremfor andre direkte fluorescerende metoder. Mulighetsstudie av rask behandling av tusenvis av kliniske prøver kan redusere test variasjon, lengde på analysen tid og kostnader. Bruken av en M2-spesifikt antistoff har den fordelen av å være uavhengig av belastningsskader forskjeller i H og N proteiner. M2-protein er relativt bevart i de fleste influensastammer infiserer mennesker. Hvis antistoffer som er spesifikke for sirkulerende flekker er kombinert med vårt system kan man måle både titer av virus og identifisere belastningen. Men siden M2 er målet for de Amantadin-lignende medikamenter, kan mutanter oppstå som kan endre bindingssetene for MAB brukt her. Dette representerer en potensiell begrensning for dette systemet hos personer som behandles med disse legemidlene.
Multippelanalyser brukes til å nummerere influensa titere i stikkprøvene. For å beregne virus titer, 50% vevskultur smittsom dose (TCID 50) og egg allantoic væske-baserte analyser er mye brukt 1,10. Men kravene i flere dager gjør disse metodene mindre pålitelig. Videre i disse metodene beregninger basert på 50% endring i antall plakk gir teoretiske, men ikke nøyaktig viral titreringer. Plakk forming analyser kan utføres innen 96 timer, men er mangel på reproduserbarhet en stor bekymring i viral titer beregninger. Den nåværende teknikken som beskrives her har flere klare fordeler. Først er det en svært reproduserbar teknikk med konsistente resultater. Sekund, virale titer Beregningene er basert på enkle kvantifisering av fluorescens intensiteter som blir sammenlignet mot definerte standard kurver. Tredje, kan to eller flere primære antistoffer brukes til å diagnostisere flere serotyper i en gitt prøve. Også IR dye-konjugerte antistoffer har minimal autofluorescens og har vært brukt til celle bildebehandling 11. UV eller visuell stråling (300-600 nM) resulterer i høy mobilnettet autofluorescens grunn av tilstedeværelsen av høye quantum avkastning endogene fluorophores. Disse inkluderer aromatiske aminosyrer, Lipo-pigmenter, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, kollagen og Flavin koenzymer. Dette iboende egenskap av celler gjør det vanskelig å utnytte disse kildene til stråling som prober å kvantifisere uttrykket av spesifikke proteiner. I kontrast, nær-IR fargestoffer begeistre og slipper ut mellom 670-1000 nm. Mange vert cellulære molekyler og polyaromatiske hydrokarboner ikke opphisse på dette bølgelengde og på grunn av redusert lysspredning, avgir svært lav bakgrunnsfluorescens. Videre er vinduet mellom bakgrunnen og spesifikk påvisning kraftig forbedret på grunn av en høy utryddelse koeffisient av de nær-IR fluorophores. Fotostabilitet, overlegen signal-til-støy-forhold, er svært relevant i kvantifisering av viral titere. Bruk av microfluidic kamre vil automatisere screening prosessen gjennom robot kontroller, og kan tillate oss å teste svært smittsom kliniske prøver med letthet. Dermed er bruken av nær-IR fargestoffer i disse metodene ideelle og svært pålitelig for å spesifisere viral titere i vevsprøver.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis NIH tilskudd R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (til SM). Vi takker våre laboratorier medlemmer for diskusjon og teknisk hjelp, Tina Heil for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi ønsker å takke David Bina, Milwaukee Health Department Laboratorium for virus kultur og PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A.
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
