Summary
Denna metod beskriver den användningen av Infraröd-färgämne baserade bildgivande system för detektion av H1N1 i bronchioalveolar sköljning (BAL) fluidum av infekterade möss vid en hög känslighet. Denna metodik kan utföras i en 96 - eller 384-brunnars platta, kräver <10 | il volym av testmaterial och har potential för samtidig screening av multipla patogener.
Abstract
Influensa-virus är en respiratorisk patogen som orsakar en hög grad av morbiditet och mortalitet varje år i multipla delar av världen. Därför, är precisa diagnos av den infekterande-stammen och snabba high-throughput screening av stora skarorna av kliniska prover av största vikt för att kontrollera spridningen av pandemiska infektioner. Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,2.
Här, rapportera vi utvecklingen av en roman diagnostisk teknik användas för att detektera levande influensavirus. Vi använde mus-anpassad människa A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-viruset 3 för att testa effekten av denna teknik att använda MDCK celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 per brunn) odlades i 96 - eller 384-brunnars plattor, infekterade med PR8 och virala proteiner detekterades med användning av anti-M2-följt av ett IR-färgämne-konjugerad sekondary antikropp. M2 5 och hemagglutinin 1 är två stora markörproteiner användas i många olika diagnostiska analyser. Som sysselsätter IR-färgämne-konjugerade sekundära antikroppar minimerat den autofluorescens associerad med andra fluorescerande färgämnen. Den användningen av anti-M2-antikropp tillät oss att använda den antigen-specifik fluorescens intensiteten som en direkt metrisk av viral kvantitet. Att räkna fluorescensintensiteten använde vi LI-COR Odyssey-baserad IR scanner. Detta system använder två kanaler laserbaserade IR detekteringar att identifiera fluoroforer och skilja dem från bakgrundsljud. Den första kanalen hetsar vid 680 nm och emitterar vid 700 nm för att hjälpa kvantifiera bakgrunden. Den 2:a-kanalen detekterar fluoroforer om att exciterar vid 780 nm och emittera vid 800 nm. Scanning av PR8-infekterade MDCK-celler i den IR-scannern indikerade en virala titern-beroende ljusstark fluorescens. En positiv korrelation mellan fluorescensintensiteten för att virus titer med utgångspunkt från 10 2 -10 5 PFU kan vara konkvent observeras. Minimal men detekterbara positivitet ses konsekvent med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitrar visade mycket känsliga nära IR färgämnen. Den signal-till-brus förhållandet bestämdes genom att jämföra de mock-infekterade eller isotyp antikropp-behandlade MDCK-celler.
Med användning av de fluorescensintensiteterna från 96 - eller 384-brunnars formaterar plate, konstruerade vi schablonvärden vid titrerkurvorna. I dessa beräkningar, är den 1:e variabeln det virala titem medan den 2:a variabeln är den fluorescensintensitet. Därför, använde vi den exponentiella distributionen för att generera en kurva-fit-för att bestämma den polynomet relationen mellan de virala titrarna och fluorescens intensiteter. Sammantaget drar vi slutsatsen att IR färgpulverbaserat protein upptäckt system kan hjälpa till att diagnostisera infektera virusstammar och exakt räkna titern av de infekterande patogener.
Protocol
1. MDCK celler kultur
- Kultur 5 miljoner MDCK-celler övernattande i en T-75 cm 2-kolv i 20 ml av RPMI1640-komplett medium med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 5% av 7,5% natriumbikarbonat -lösning och 0,001% β-merkaptoetanol i ett 37 ° C inkubator infunderas med 5,2% CO 2.
2. PR8 infektion och BAL vätskeansamling
- Utmaning C57BL / 6 möss intranasalt med 5000 PFU av PR8-virus i sterilt PBS i en total volym av 30 | il genom den ena näsborren. Utför håna infektioner med enbart steril PBS utan viruset.
- Euthanize möss 0, 2, 4 och 7 dagar efter infektion och skär brösthålan öppnas och gör en 1 parallell cm snitt för att luftstrupen genom päls musen för att avslöja det.
- Göra en mittlinjesnitt på den proximala aspekten av trakea.
- Infundera den luftstrupen med 0,5 ml av PBS-1% BSA och aspirera i BA-L fluidum. BAL-fluider kan lagras i -20 ° C frys tills de användes.
3. Virusinfektion och detektion av viralt matrix protein (M2) med LI-COR Odyssey
- För att kvantifiera de virala titrar som använder infraröda-färgämne-konjugerade antikroppar, skörda de MDCK-cellerna från T-75-cm 2-kolvar och plattan dem i optisk platt botten svart 96-brunn (10.000 celler per brunn) eller 384-brunnars (5,000 celler per brunn )-plattor. Kulturen de MDCK-celler för natten vid 37 ° C i RPMI1640-komplett medium och tvätta två gånger med serum-fri DMEM haltig BSA (0,2%, vikt / volym), penicillin (100 E / ml), streptomycin (100 ig / ml), natrium pyruvat (1 mM), natriumbikarbonat-lösning (5% av 7,5%) och β-merkaptoetanol (0,001%).
- Inkubera de MDCK-celler som fått BAL-vätskan (50 | il för 96-brunn platta eller 10 | il för 384-brunnars platta) eller PR8-virus med kända titrar i varje brunn som fått lika stor volym (50 | il för 96-brunn platta eller 10 | il för 384 - brunnars platta) av DMEM-medium,innehållande L-1-tosylamido-2-fenyletyl klormetyl keton (TPCK)-behandlat trypsin (0,2 ig / ml).
- Följer efter den 1 h av infektion, tillsätt 100 | il (96-brunnars platta) eller 20 jil (384-brunnars platta) av 10% FBS-innehållande RPMI1640-komplett medium till varje brunn.
- Fortsätta odling av MDCK-celler för en annan 16 tim av infektion; tvätta de MDCK-celler två gånger med 100 | il (96-brunnars platta) eller 20 jil (384-brunnars platta) av PBS-1% BSA-lösning och fixera med 100 | il (96-brunn platta) eller 20 jil (384-brunnars platta) av 1% paraformaldehyd under 5 min.
- Efter det om fastställande, inkubera de MDCK-celler vidare för 30 min med 100 | il (96-brunnars platta) eller 20 jil (384-brunnars platta) av PBS-1% BSA under blockering.
- Efter blockering inkubera de MDCK-celler för 1 h med primär antikropp mot M2 proteinet (1:1000, späddes i PBS-1% BSA). Använda 50 | il per brunn och 20 il av utspädda antikropp per brunn i 96-brunn eller 384-brunn-plattor, respektive.
- Tvätta MDCK-celler tre gånger med 100 | il (96-brunnars platta) Eller 20 jil (384-brunnars platta) av PBS-innehållande 1% BSA och inkubera under 1 h med 50 | il (96-brunnars platta) eller 20 jil (384-brunnars platta) get-anti-mus-IRDye @ 800 sekundär antikropp ( 1:200 utspädning).
- Tvätta MDCK-celler tre gånger med 100 | il av PBS-innehållande 1% BSA. Placera de färgade plattorna på den läsningen glaset plattformen av det LI-COR Odysséen IR-scanner och ställ in läsaren för en 96 - eller 384-brunnars platta läsning.
- Tomma negativa kontrollbrunnar kan ställas in med LI-COR Odyssey programvara. Kvantifiera hela plattan eller valda brunnar i plattan med LI-COR Odyssey programvara.
- Genom att använda Auto Shape Tool, dra gränserna för ett målområde (ROI) i mitten av en testbrunn av 96 - eller 384-brunnar. Skapande av ROI gör programvaran att jämföra de definierade bakgrunden brunnarna till de virus-titrerade prover.
- För att ställa in utgångsvärdet för hela analysen, använd en bakgrund ROI. Införa två motsatta hårkorset tillhandahålls av Odyssey mjukvara inom ROI för mätpå nytt intensiteten hos fluorescensen tvärs över brunnen.
- Skanna plattor med 780 nm-kanal för att upptäcka och 680 nm som referens våglängd i en LI-COR Odyssey IR scanner.
- En gång den 'Läs omdömen om'-kommandot är aktiverad, kommer de fluorescerande intensiteter vid likformiga intervaller av de roi mätas och den uppsamlade datapunkterna integrerade. En standardavvikelse multiplikator kommer att bestämma den nivån av signalen över den baslinjen om att är inkluderad i ROI bestämningen.
- Bakgrundsfluorescens kommer att kvantifieras från den falsk-infekterades eller sekundär antikropp ensam kontrollerar och kommer att användas för att uppskatta den integrerade intensiteten i provinstruktioner brunnar.
- Välj "integrerad intensiteten" för beräkningarna eftersom den representerar nätet pixel volymen för en definierad individ plats och är oberoende av funktionen storlek. Använda det standarddokument kurvan från de kända virala titrar för att beräkna de virala titrar av okända prov. Använd en lång interpolation kurva exakt beräkna virustitrar. Beräkna den viral titrar i de provningsförfaranden proverna genom att jämföra intensiteterna hos de testproven med det standardkurvan.
4. Representativa Resultat
Standardisering av IR färgpulverbaserat hög genomströmning viralt system för upptäckt av
PR8 virus kan infektera MDCK celler, och därför använde vi dessa celler att utveckla denna analys. Vi mätt de virala titrarna som använder en primär antikropp mot en influensa viralt matris-protein (M2). I motsats till andra metodologier, använde vi en sekundär antikropp som är konjugerad till en nära-IR-färgämne. Denna metod tillhandahåller en enkel, automatiserad PR8 beslutsamhet-viruset-titer med användning av fluorescens intensitet att genereras medan detektering av M2 proteinet. Efter influensavirusinfektion är M2 protein översatt, transporteras och ackumuleras i värdcellen, inklusive cellytan. Sålunda, representerar kvantiteten av M2 proteinet en mätbar parameter för att bestämma kvantiteten av viruset. Jämföra intensiteterna frånde testproven som fått den standard-kurva tillhandahåller den noggran mätning av virala titrar.
För att bestämma effektiviteten av fluorescensen-baserad metod, vi odlade 10 4 MDCK-celler / brunn i kammare glider över natten. PR8-virala fiskbestånd av kända titrar sattes till duplikatbrunnar med olika plackbildande enheter (PFU) och tilläts att adsorbera på de celler under en timme. Cellerna inkuberades under 16 h för att göra det möjligt för viruset att propagera. Efter att ha detta, kände de MDCK-cellerna i kammargravarna objektglasen fixerades med 1% paraformaldehyd, tvättades och färgades med anti-M2-antikropp för 1 tim, följt av AlexaFluor 488-konjugerad sekundär antikropp under en ytterligare 1 tim. Konfokala mikroskopiska analyser av infekterade MDCK-celler demonstreras den adherenta monoskiktet var i stor utsträckning intakt och den PR8-härledda M2-proteinet var högst närvarande inuti de infekterade MDCK-celler (Figur 1A). Fluorescerande celler kunde detekteras i infektioner med virala titrar så låg som 10 2
Därför att upprätta en noggrann viral skattningsmetod vi använde en IR färgpulverbaserat detektion och kvantifiering system. MDCK-celler (10 4 / brunn) odlades i 96-brunnars plattor, infekterade med PR8 och virala proteiner detekterades med användning av anti-M2-följt av ett IR-färgämne-konjugerad sekundär antikropp. Den användningen av anti-M2-antikropp tillät oss att använda den antigen-specifik fluorescens intensiteten som en direkt metrisk av viral kvantitet. Att räkna fluorescensintensiteten använde vi LI-COR Odyssey-baserad IR scanner. Detta system använder två kanaler laser-based IR upptäckter att identifiera fluoroforer och skilja dem från bakgrundsljud. Den första kanalen hetsar vid 680 nm och emitterar vid 700 nm för att hjälpa kvantifiera bakgrunden. Den 2:a-kanalen detekterar fluoroforer om att exciterar vid 780 nm och emittera vid 800 nm. Scanning av PR8-infekterade MDCK-celler i LI-COR Odysséen indikerade en virala titern-beroende ljusstark fluorescens (Figur 1B). M2 positiva fluorescerande MDCK celler var tydligt inne i brunnarna (Figur 1B). En positiv korrelation mellan fluorescensintensiteten för att virus titer med utgångspunkt från 10 2 -10 5 PFU kunde genomgående observeras. PR8 virala titreringar högre än 10 6 PFU leder till celldöd, som sätter en övre gräns för känsligheten för analysen. Minimal men detekterbara positivitet ses konsekvent med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitrar visade mycket känsliga nära IR färgämnen. Den signal-till-brus förhållandet bestämdes genom att jämföra den moc-k-infekterad eller isotyp antikropp-behandlade MDCK-celler. Båda av dessa kontroller resulterade i försumbara eller odetekterbar nivåer av fluorescens (Figur 1B).
För att ytterligare förbättra känsligheten och för att reducera de provkrav som exempeldata över volymutvecklingen infekterades vi 5 × 10 3 MDCK-celler / brunn i 384-brunnsplattor. Olika PFU av PR8 testades såsom serietillverkade ett log spädningar (Figur 1C). Detekteringskänslighet från 384-brunnars plattor var jämförbar med den för de 96-brunnars plattbaserade analyser. Både 10 1 och 10 2 PFU-konsekvent arbetat för bättre i de 384-brunnsplattor jämfört med 96-brunnars plattor. Med användning av de fluorescensintensiteterna från 96 - eller 384-brunnars formaterar plate, konstruerade vi schablonvärden vid titreringskurvor (Figur 1D). I dessa beräkningar, är den 1:e variabeln det virala titem medan den 2:a variabeln är den fluorescensintensitet. Därför använde vi exponentialfördelningen att generera en kurva-passa determpå aktieägarnas vägnar granska polynomet relationen mellan de virala titrarna och fluorescens intensiteter. Vi har också validerat våra observationer med användning av en annan antikropp som är riktad mot den nukleoprotein (NP) av PR8-virus (data ej visade). Distinkta källor av PR8--stammar var även användes för att infektera MDCK-celler som testades med anti-NP--eller anti-M2 antikroppar (data ej visade). Sammantaget drar vi slutsatsen att IR färgpulverbaserat protein upptäckt system kan hjälpa till att diagnostisera infektera virusstammar och exakt räkna titern av de infekterande patogener.
Matematiska överväganden för beräkning av virala titrar
De matematiska beräkningar av fluorescens intensitet och bestämningar antikroppnivåvärden är klar som beskrivs nedan. Efter färgningsproceduren är hela plattan eller valda brunnar i plattan kvantifieras med hjälp av LI-COR Odyssey programvara. Genom att använda Auto Shape Tool, var gränserna för ett målområde (ROI) som tagits i mitten av testbrunnarna av 96 - eller 384-villa-plattor (Figur 2A och B). Skapande av ROI gör programvaran att jämföra de definierade bakgrunden brunnarna till de virus-titrerade prover. En bakgrund ROI användes för att ställa in utgångsvärdet för hela analysen. Två motsatta hårkorsen (vit) infördes inom ROI-för att mäta intensiteten av fluorescens tvärs över brunn (Figur 2C). Kurvor till den högra sidan och nedanför de representativa brunnarna i Figur 2C representera till intensiteten i de pixlarna som går i denna hårkors. De fluorescerande intensiteter vid likformiga intervallerna för den ROI-mättes och de uppsamlade datapunkter var integrerade. En standardavvikelse multiplikator bestämt nivån signalen över baslinjen som ingick i ROI bestämningen. Bakgrundsfluorescens kvantifierades från den falsk-infekterades eller sekundär antikropp ensam-kontroller och användas för att skatta den integrerade intensiteten i provinstruktioner brunnar. Vi valde integrerade intensiteten för beräkningar därför att det represmedelsingredienser net pixel volymen för en definierad individ plats och är oberoende av funktionen storlek. Som tillägg, är integrerade intensiteten väsentligen oberoende av upplösning. Totala intensiteten / bildpunkt (jag) motsvarar den signal intensiteten som uppstår från den valts brunn i den pixel område (Is) plus den signalen som uppstår från bakgrunden av pixeln område (b). Därför, för pixel "i":
Jag i = jag ar i + b ^
Pixel volymen representerar både storleken på signalen och det område där den distribueras. -Signal område är relaterad till den distributionen av provet som skapar den signalen. Den pixel innervolymen är lika med totala signalen uppmätt i bildpunkt Sammansatta I-i området (en) av pixeln gånger dess höjd (I). Så för pixel "i":
vi = en Ii
Total pixel volym är summan av den totala signalen från hela området så här:
| ; | n | n | |
| V = | Σv i. | = | aΣI i. |
| i = 1 | i = 1 |
Integrerade intensiteten är summan av de intensitetsvärdena värdena av alla pixlar som är inneslutna av funktionen, multiplicerat med den område av den cirkel / rektangeln (grefven mm 2). Därför integrerade intensiteten =
en (ΣI i - b)
Här står b för den genomsnittliga bakgrunden pixel intensitet. Denna formel beräknar de integrerade signalpunkterna intensiteterna av på kontrollen eller experimentella brunnar och därigenom etablerar en standardkurva. Virala titrar i de testproven beräknades med användning av det här inlägget standardkurva. Koncentration (av intensitet) definieras som den kvantitet av fluorescens närvarande i en definierad ROI. Koncentrationer i proverna är beräkningarTed i förhållande till definierade koncentrationerna av standarder i samma bild. För att beräkna de exakta virustitrar, är intensiteten i varje koncentration standard plottas och försedd med en lång interpolation kurva. Av koncentrationerna av ämnena testproverna är beräknade genom jämförelse med intensiteten av området inom den standardkurvan.
Beslutsamhet av virala titrar från BAL-vätskan av influensainfektioner infekterade möss
Detektion av levande influensa viruspartiklar i kliniska och laboratoriemässiga prover är av avgörande betydelse. Därför har vi granskat nästa om vi kan utnyttja denna metod för att bestämma de virala titrar i laboratorieprover. BAL-fluider samlades in från icke-immuniserade möss och spetsades med en känd mängd av PR8-virus. Spetsade BAL fluider linjärt titreras för att räkna de virala titrar. Alikvoter av spetsade BAL-fluider användes för att infektera MDCK-celler i 96-brunnars plattor, fixeras och färgas med anti-M2-och IR färgämne-konjugerad secondary-antikroppar. Resultat som visas i Figur 3A demonstrerar att de virala titrar i den spetsade BAL-vätskan var detekterbara och korreleras med de PR8-titrar i av standardkurvan. Med hjälp av standardkurvan, var exakta virala nummer i spetsat och titreras BAL vätskan kvantifieras. Exponentiell kurva passform beräkningar gav en åtgärd för att beräkna virala titrar i spetsade BAL vätska (figur 3B). Genom denna metod vi som erhållits utmärkta korrelationer mellan De beräknade och de spetsades virala titrar för, validera detta tillvägagångssätt (Figur 3C).
Nästa, analyserade vi den BAL-vätskan från PR8-infekterade möss. PR8 har i stor utsträckning använts i musmodeller för att förstå människans patologi och anti-virala immunitet 3. Grupper av möss intranasalt infekterades med 5000 PFU av PR8. Möss övervakades för viktminskning, utseende hopkrupen tillbaka ruggig päls och andra kliniska symptom. På dagar 0, 2, 4, 7 och 10 av post infektion,möss offrades och BAL-fluider uppsamlades. Att utnyttja dessa laboratorieproven, togs MDCK-celler inkuberades med seriella spädningar av BAL-vätskan i en slutlig volym av 50 | il för 17 h i 96-brunnars plattor. Kontrollåtgärder brunnar av MDCK-celler infekterade med kända titrar av beståndet PR8-virus tjänade till att generera en standardkurva. Efter infektion, tvättades celler, fixeras och färgas med anti-M2-primär antikropp följt av nära-IR färgämne-konjugerad sekundär antikropp. MDCK-celler som var mock-infekterades eller som behandlas med isotypkontrollerna efter infektion förutsatt de intensiteter som bakgrundsnivåer fluorescens-för antikroppnivå beräkningar.
Analyser av den BAL-vätskan demonstrerat att PR8-virus i laboratoriet exemplaret är detekterbar genom den IR-färgämnet-baserad analys-systemet. En betydande ökning i den virala belastningen i BAL-vätskan observerades på dagar 2 och 4 efter infektion (Figur 4A). Beräkningar av integrerade intensitet visade att BAL vätskor från dag 2 och 4 av post infection innehöll signifikanta nivåer av PR8-virus (Figur 4B). Våra resultat visar en gradvis men signifikant viktminskning under den tidiga fasen av PR8 infektion, vilket visar hur allvarlig sjukdomen. Icke desto mindre, startade de flesta möss att återhämta dig från sjukdom symptom-och gå upp i vikt 7 dagar post infektion (Figur 4C). Möss vid dag 10 efter infektion saknade någon påvisbar PR8 anger clearance av viruset, som också korrelerade med ökningen i kroppsvikt och stora minskningar av sjukdomssymptom.
För att ytterligare utvidga tillämpningen av denna analys, testade vi en 2009 A (H1N1) mänsklig influensa isolat med IR färgpulverbaserat antikroppar system för upptäckt och jämfört den med realtids-PCR-analys. Denna kliniska provet isolerades från en kombinerad nasofaryngealt / halsodling erhållet från misstänkt patienten. Isolatet propagerades i MDCK cellinje vid Milwaukee Health Department Laboratory. De testresultaten var bolagenröd för att kontrollera känsligheten hos den IR-färgämne-baserad metod till real-time PCR-analyser (Figur 5). Indikerar resultaten att den IR färgämnet-baserat-antikroppen detektion systemet har potential för att detektera viral belastning så låg som 10 3 TCID 50 / ml, vilket är jämförbart med PCR-baserad-analysen (10 TCID 50 / ml) och faller inom den kliniska relevansen utbud för de flesta patientprover. Dessa resultat ger starka bevis för att IR färgpulverbaserat analyssystem har tillräcklig känslighet och potential att användas för viral titer uppräkningen i forskningslaboratorium och kliniska inställningar.
Klura 1. IR-färgämne-baserad immun detektion av influensa-virus. (A) Konfokala mikroskopiska analyser med influensainfekterade MDCK-celler i 8-brunnars kammare diabilder. Immunofluorescens mikroskopiska analyser visar vidhäftande MDCK monolagret är till stor del intakt och laddad med virus-härledda M2-proteinet. (BC) Kvantifiering av virala titrar baserade på IR färgämne och LI-COR Odyssey system. (D) Generering av standardkurvor och exponentiell kurva-fit profiler. Data som presenteras i e.Kr. är representativa för fem oberoende experiment.
Siffra 2. Metod för bestämning virustitrar med IR färgämnen. (A) integrerade fluorescensintensiteten mätningar. Ett definierat område inne i testbrunnarna (ROI) präglades för att mäta fluorescensintensiteterna. Med användning av Tool Auto Shape-, togs Gränserna för den ROI teckningar i en mitt över de test-brunnar av 96 - eller 384-brunn-plattor. Fluorescens mättes som enskilda pixlar (pixel = n) inom ROI. Integrerade intensiteten är summan av de intensitetsvärdena värdena av alla pixlar som är inneslutna av funktionen, multiplicerat med den område av den cirkel / rektangeln (grefven mm 2). (B) Fastställande de integrerade fluorescensintensiteterna i analysbrunnarna. Skapande av ROIlät LI-COR scanner för att jämföra de definierade bakgrunden brunnarna till de virus-titrerade prover. Bakgrundsfluorescens kvantifierades från den falsk-infekterades eller sekundär antikropp ensam-kontroller och användas för att skatta den integrerade intensiteten i provinstruktioner brunnar. (C) Insamling av data punkter inom ROI. Två motsatta hårkorsen (vit) infördes inom ROI-för att mäta intensiteten av fluorescens tvärs över brunnen. Kurvor till höger och under de representativa brunnar representerar intensiteten av pixlarna längs dessa hårkors.
Siffra 3. Detektion och kvantifiering av virustitrar i PR8-spetsade BAL-fluider. (A) togs MDCK-celler odlades i 96-brunnars plattor över natten och tillsattes med PR8-spetsat BAL-vätskan. Plattorna lästes i LI-COR Odyssey system. (B) Exogent broddad BAL-vätskan jämfördes med vanliga kurvor. (C) Jämförelse av beräknad förväntas vir al-titrar. Exponentiell kurvan montering förutsatt y = 9.4784e 0.0014x. Data som presenteras i AC-är representativa för tre oberoende experiment.
Klura 4. Detektion och kvantifiering av influensa-virus i BAL-fluider från PR8-infekterade möss. (A) Grupper av möss intranasalt infekterades med 5000 PFU av PR8. MDCK-celler inkuberades med serieutspädningar av BAL-vätskan i en slutlig volym av 50 | il för 17 h i 96-brunnars plattor. Efter infektion, tvättades celler, fixeras och färgas med anti-M2-primär antikropp följt genom IR färgämne-konjugerad sekundär antikropp. Längst till höger panelen representerar den standardkurvan. (B) Kvantifiering av virala titrar i den BAL-vätskan av infekterade möss. (C) Viktminskning hos möss under PR8 infektion korrelerade med virusmängd. Data som presenteras i AC-är representativa för tre oberoende experiment.
Re 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
Siffra 5. Detektering och kvantifiering av 2009 A (H1N1)-pandemin (PDM) influensa isolat från en mänsklig patient. (A) IR färgpulverbaserat antikroppar fluorescens systemet upptäcka en halv gånger titrering av infekterat MDCK cellinje. De fluorescensdata Resultaten tyder på att analysen har potential till att detektera viral belastning så låg som 10 3 TCID 50 / ml. (B) Nukleinsyra ur kulturen isolat tillsammans med tiofaldiga utspädningar av en känd titer H1N1 isolat analyserades med CDC realtids-PCR-analys 12. Detektionsgränsen för realtids-PCR var 10 TCID 50 / ml.
Discussion
Den senaste epidemin utbrott av fågelinfluensa i Sydostasien och en global rädsla för svininfluensan pandemin innebära enorma problem för människors hälsa och säkerhet. Kritisk fokus har ägnats att skapa vaccin för befintliga och nya stammar av influensavirus. Tillgång till snabba teknik med hög kapacitet för exakt detektering och noggranna virala beräkningar titer kommer oerhört förbättra behandlingen. De mest vanligen använda tekniker som utnyttjas för att beräkna-virus-titer inkludera plackbildande-och influensa hemagglutination-analyser. Plattan bildar analysen utvecklades först för att uppskatta bakteriofag titer och antogs av Renato Dulbecco för att beräkna djurens virustitrar 4. För att utföra denna analys, är 10-faldiga spädningar av influensa lager eller exemplar djur såsom BAL-vätska förberedd och 0,1 ml alikvoter inokuleras på monoskiktet av MDCK celler i 6-brunnsplattor. Det virus tillåts att adsorbera på de MDCK-celler följt av den adskicket av ett näringsmedium och agaros. Under inkuberingen, de ursprungliga infekterade cellerna frisätta viral avkomma som spred endast till de angränsande celler. Den cytopatogena effekten av den influensapositiva viral infektion producerar en cirkulär zon av infekterade celler som kallas ett plack. Varje plack är förmodligen bildad efter infektion av en enda cell med en enda virus partikel följt av replikation av-virus. Kontrast mellan de levande celler och de plaketter kan förstärkas genom att färgämnen såsom kristallviolett. En stor nackdel med denna analys är brist på reproducerbarhet och enorma variationer inom experiment. En annan analys som användes för att bestämma den influensa virala titern är den hemagglutineringsanalys. Den hemagglutininproteinet närvarande på ytan av det influensa-virus binder effektivt till N-acetylneuramin-syra-haltiga proteiner på däggdjurs-och aviär röda blodkroppar 1. Denna interaktion mellan det influensavirus och de erytrocyterna leder till agglutinering i form av ett gitter. Den l.Evel av agglutinering används för att uppskatta den titer av den influensa viruset i provkroppar. Erytrocyt agglutination assay används endast för att bestämma titrering av ett känt virus och kan inte användas för stammarnas registreringsnummer. Eftersom denna analys inte skilja mellan levande och de döda virus, är det svårt att få en exakt beräkning av virala titrar.
Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,6. Den nya metoden som beskrivs här också har klinisk och laborativ diagnostiska potential. Influensa upptäckt kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) och BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) använder immunokromatografi analys för att upptäcka viralt antigen såsom nukleoprotein 7. Med hjälp av dessa kit, detektion av virus kan uppnås inom 15 minuter, men alla negativa prover måste ytterligare screened genom att den cell kulturen-metoden. Olika studier har också rapporterat låg sensitivitet av dessa kit, i synnerhet när infektion var milt eller låg 8. I vår metod, detektera vi konsekvent så låg som 100 PFU av-virus. Detta tyder på vår teknik är användbar för att upptäcka H1N1-viruset i kliniska prover, även när infektionen är mild. En fluorescens-baserad metod för att upptäcka virala antigener har rapporterats, där antingen nasofaryngeala aspirat prover analyseras direkt eller ympades på ett monoskikt av mottagliga celler för virus förökning och efterföljande analyser 9. Men dessa metoder begränsade för diagnostiska ändamål och är inte lämpliga för beräkningar virustiter. Q-PCR-hjälper till att identifiera närvaron av viralt RNA och går inte uppskatta den infektiviteten av levande virus. Jämfört med dessa analyser kommer IR färgpulverbaserat analyssystem hjälp i att upptäcka och virustiter uppräkningen i kliniska och laboratorieprover. I händelse av influensa utbrott, är detkritisk för att diagnostisera tusentals prover i en kort tidsperiod. Vår metod bygger på en 384-brunnar och IR scanner kan scanna 6-plattor åt gången (> 2000 prover), och således erbjuder ett större fördel jämfört med andra direkta fluorescerande metoder. Genomförbarheten av en snabb behandling av tusentals kliniska prover kan minska testet variation, längd av analys tid och kostnader. Användningen av ett M2--specifik antikropp erbjuder fördelen av att vara oberoende av stamskillnader i H-och N-proteiner. M2-proteinet är relativt bevarad i de flesta influensastammar infekterar människor. Om så antikroppar som är specifika för att cirkulerande fläckar tas kombineras med vårt system en kan mäta både den titem av viruset och identifiera den-stammen. Eftersom M2 är målet för Amantadin-liknande läkemedel kan mutanter uppstå som kan ändra bindningsstället för mAb som används här. Detta representerar en potentiell begränsning för den här system i individer som håller på att behandlade genom dessa droger.
Multipelanalyser används för att räkna influensa titrar i testprover. För att beräkna-virus-titer, 50% vävnadskultur infektiös dos (TCID 50) och sektorn för ägg allantoiska fluidum-baserade analyser användes i stor utsträckning 1,10. Men kraven på flera dagar att göra dessa metoder mindre tillförlitlig. Vidare, i dessa metoder beräkningar som baseras på 50% förändring av antalet plack ge teoretiska, men inte exakt virala titreringar. Plackbildande analyser kan utföras inom 96 timmar, men är bristen på reproducerbarhet ett stort problem i virustiter beräkningar. Den föreliggande teknik som beskrivs här har flera distinkta fördelar. Först, är det en höggradigt reproducerbar teknik med konsekventa utfall. Andra, den virala antikroppnivåvärden Beräkningarna är baserade på enkel kvantifiering av fluorescensintensiteter som jämförs mot definierade standardkurvor. Tredje, kan två eller flera primära antikroppar användas för att diagnostisera multipla serotyper i ett givet prov. Också, IR-färgämne-konjugerade antikroppar har halvpausfl autofluorescens och har använts för cell imaging 11. UV-eller visuell strålning (300-600 nM) resulterar i hög cellulär autofluorescens på grund av närvaron av höga quantum avkastningsvalutor endogena fluoroforer. Dessa inkluderar aromatiska aminosyror, Lipo-pigment, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, kollagensjukdomar och flavin koenzymer. Den här inneboende egenskapen hos celler gör det svårt att utnyttja dessa källor till strålning som prober för att kvantifiera den expressionen av specifika proteiner. I motsats nära-IR färgämnen väcka och släpper mellan 670-1000 nm. Många värd cellulära molekyler och polyaromatiska kolväten inte hetsas inte denna våglängd och på grund av minskad ljusspridning, släpper extremt låg bakgrundsfluorescens. Ytterligare, är fönstret mellan bakgrunden och specifika detektionen vastly förbättrades på grund av en hög extinktionskoefficient av de i närheten av-IR-fluoroforer. Fotostabilitet, överlägsen signal-till-brus-förhållande, är extremt relevant i den kvantifiering av virala titrar. Bruk av microfluidic kamrar automatiserar screening processen genom robot kontroller och kunde tillåta oss att testa mycket smittsamma kliniska prover med lätthet. Sålunda, är utnyttjandet av i närheten av-IR-färgämnena i dessa metoder idealisk och mycket tillförlitlig att uppräkna virala titrar i vävnadsprover.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis NIH bidrag R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (till SM). Vi tackar våra laboratorium medlemmar för diskussion och teknisk hjälp, Tina Heil för kritisk granskning av manuskriptet. Vi vill tacka David Bina, Milwaukee Health Department Laboratoriet för virusodling och PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A.
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
