Summary
Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi <10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.
Abstract
Grip virüsü Dünyanın birçok yerlerinde her yıl morbidite ve mortalitesi yüksek derecede neden olan bir solunum yolu patojen. Bu nedenle, kesin tanı klinik örneklerden çok büyük sayıda bulaşmasını gerginlik ve hızlı yüksek verimlilik tarama pandemik enfeksiyonların yayılmasını kontrol etmek için her şeyden önemlidir. Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,2 dayanmaktadır.
Burada, canlı grip virüsleri tespit etmek için kullanılan yeni bir teşhis tekniği geliştirme sunduk. Biz MDCK hücreleri kullanarak 4 Bu tekniğin etkinliğini test etmek için fare-uyarlanmış insan A/PR/8/34, (PR8, H1N1) virüsü 3 kullanılır. MDCK hücreleri (yanı 10, 4 ya da 5 - başı gecelik x 10 3) Mayıs,, 96 aşağıdakilerle in kültürlenen edildi - ya da,, PR8. Ve viral proteinler sentezlenir ile birlikte bulaşmışsa 384-well bir plakaları,,,,, bir IR bir dye-konjuge edilmiş sec tarafından, anti--M2 izledi kullanarak algıladı 'de edildisekonder antikor. , M2 5 ve - hemagglutinin 1,,,,, pek çok farklı bir tanısal deneyleri in kullanılan iki adet major işaretleyici proteinleri şunlardır. Istihdam IR-boya-konjuge sekonder antikorlar, diğer floresan boyalar ile ilişkili otofloresans en aza indirir. , Anti--M2 antikor of kullanımını,,, bize,, viral bir nicelik of, bir doğrudan bir bir bir metrik gibi antijen-belirli bir bir bir floresans bir yoğunluğunu kullanmak etmek, izin verilen. Floresan yoğunluğu numaralandırmak için, biz LI-COR Odyssey tabanlı IR tarayıcı kullanılır. Bu sistem florofor tespit ve arka plan gürültüsü onları ayırt etmek için iki kanal lazer tabanlı IR tespitlerde kullanır. Birinci kanal, 680 nm dalga boyunda heyecanlandıran ve arka plan ölçmek yardımcı olmak üzere 700 nm dalga boyunda yayar. Ikinci kanal 780 nm florofor heyecanlı bir şekilde algılar ve 800 nm dalga boyunda yayar. IR tarayıcı, PR8-enfekte MDCK hücrelerin viral titre-bağımlı parlak floresan Tarama belirtti. 10 2 -10 5 PFU itibaren virüs titresi floresans şiddetinin pozitif bir korelasyon con olabilirsistently gözlenmiştir. 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titreler yakın-IR boyalar yüksek hassasiyet göstermiştir Minimal fakat fark pozitifliği ile tutarlı görülmektedir. Sinyal-gürültü oranı mock-enfekte veya izotip antikor tedavi MDCK hücreleri karşılaştırarak tespit edilmiştir.
96 floresan yoğunluklarına kullanarak veya 384-plaka biçimleri, standart titrasyon eğrileri inşa edilmiştir. Bu hesaplamalarda, ilk değişken İkinci değişken floresan yoğunluğu ise viral titre. Bu nedenle,, polinom viral titreleri ve floresan yoğunluklarına arasında ilişkiyi belirlemek için bir eğri-fit oluşturmak için üstel dağılım kullanılır. Topluca, IR boya bazlı protein algılama sistemi viral suşlar bulaşmasını teşhis ve hassas bulaşmasını patojenlerin titresi numaralandırmak yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.
Protocol
1. MDCK hücreleri kültürünün
- ,,,% 10 oranında FBS,-100 U / - ml 'penisilin,-100 ug / ml streptomisin ile korunurlar, 1 mM sodyum piruvat,, (5)% 7.5' i dahil olduğu sodyum bikarbonat of%: ile birlikte, 20, ml, RPMI1640 komple medium of in, bir T-75 cm 2 flask in bir gecede Culture, 5.000.000 MDCK hücreleri % 5.2 CO 2 ile 37 ° C inkübatör çözüm ve% 0.001 β-merkaptoetanol aşılamıştır.
2. PR8 enfeksiyon ve BAL sıvı toplanması
- Mücadelesi C57BL / 6 farelerinde, intranazal olarak, in PR8 virüs:,, birini nostril bu aracılığıyla ise mikrolitre 30, of, bir total bir bir hacim in steril bir PBS of 5000 PFU ile birlikte. Virüs olmadan sadece steril PBS kullanarak sahte enfeksiyonlar yürütmek.
- Euthanize fareler 0, 2, 4 ve 7 gün sonra enfeksiyon ve göğüs boşluğu açmak ve kürk maruz fare ile trakea bir 1 cm kesi paralel kesilmiş.
- Trakea proksimal yönü ensizyon olun.
- ,, PBS-1% BSA, of 0,5 ml 'ile birlikte trachea infüze ediniz ve, BA emdiriniz.L sıvı. Önceki,, kullanılıncaya kadar BAL sıvılarıyla ile,,, -20 ° C derin dondurucuda in depolanan uygulanmaz edebilirsiniz.
3. Virüs enfeksiyonu ve viral matriks protein (M2), algılama LI-COR Odyssey
- Kızıl ötesi boya-konjuge antikorları kullanarak viral titreler ölçmek için, T-75 cm 2 matara ve optik düz dipli siyah plakası ile MDCK hücreleri hasat 96 (10.000 de başına hücreleri) veya 384 (5.000 hücreleri başına ) plakaları. At 37 Culture,,, for overnight MDCK hücreleri ° RPMI1640 komple üzerine medium ve, serum-ücretsiz DMEM ihtiva eden BSA, (% 0.2 'si, ağırlık / hacim,) toplam, penisilin (-100 U / ml' '), streptomisin (-100 ug / ml' '), sodyum ile birlikte iki kat daha olarak yıkamak in C piruvat (mM 1),,, sodyum bikarbonat bir çözüm (Tüm mesajların 5% 7.5 'i of%) ve β-mercaptoethanol (% 0,001).
- , BAL akışkan (,, 384-well plate için, 96-well bir plate ya da 10 mikrolitre için mikrolitre 50) ya da, her bir kuyunun eşit hacim ile birlikte in da bilinir edilebilir titreleri (, 96-well bir plate ya da 384 için mikrolitre 10 olarak için mesajların 50 mikrolitre ile birlikte, toplam PR8 virüs ile birlikte MDCK bir bir hücreleri inkübe edin. - DMEM orta) pleyt, iyi,, ihtiva eden L alanı-1-tosylamido-2-feniletil klorometil ketonla, ve, tripsin (0,2 ug / ml ''), (TPCK)-tedavi edilen.
- Enfeksiyon 1 saat sonra, 100 ul (96-well levha) veya% 10, her iyi RPMI1640 tam orta FBS içeren 20 ul (384-plaka) ekleyin.
- ,,, Enfeksiyona of başka bir 16, h için kültürleme MDCK hücreleri Continue (Devam);;, ', PBS-1% BSA, bir çözüm. Of-100 mikrolitre (96-well plate) ya da kontrol grubundaki kadınların, 20, mikrolitre (, 384-kuyu plate) ile birlikte iki kat daha,,, MDCK hücreleri yıkamak ve e ile birlikte-100 mikrolitre (96-well düzeltebilirim plate) ya da Şu (20), 5 min için% 1 oranında bir paraformaldehite of mikrolitre (384-well plate),.
- ,, Sabitleme da takiben,,, bloke etmek için PBS-1% BSA, of-100 mikrolitre (96-well plate) ya da, 20, mikrolitre (, 384-kuyu plate) ile birlikte daha ileri çok 30, min için MDCK hücreleri inkübe edin..
- , Primer antikor M2 protein karşı Şu ile birlikte 1 h (1:1000 lik, # PBS-1% BSA, bölgesindeki seyreltildi.) Için MDCK bir bir hücreleri inkübe edin. Bloklama sonra,. , Sırasıyla olarak, 50,,, seyreltilmiş antikor of, kuyu ve 20, mikrolitre başı gecelik mikrolitre,, başı gecelik yanı 96-well ya da 384-well plakaları olarak kullanın ve.
- 100 ul (96-kuyucuklu plaka ile üç kez MDCK hücreleri yıkayın) Ya da Şu (20) PBS-ihtiva eden, ise 50 mikrolitre (96-well plate) ya da 20, mikrolitre (, 384-kuyu plate), goat anti--için fare IRDye @ 800 ikincil bir antikor ile birlikte,, 1 h için% 1 oranında BSA, kadar vorteksleyin ve oda ('mikrolitre (, 384-kuyu plate) 1:200 dilüsyon).
- ,, PBS-ihtiva eden 1% BSA, of 100 ul'lik ile birlikte üç kez olarak MDCK hücreleri yıkayın. Veya 384-sıra plaka okuma - 96 LI-COR Odyssey IR tarayıcı okuma cam platform lekeli tabak yerleştirin ve okuyucu ayarlayın.
- Boş negatif kontrol kuyusu LI-COR Odyssey yazılımı kullanılarak ayarlanabilir. LI-COR Odyssey yazılımı kullanarak plağındaki bütün plaka veya kuyulardan seçilen ortaya koydu.
- Auto Shape Tool kullanarak bir test ortasında 96, hedef bölge (ROI) sınırları çizmek ya da 384-kuyucuğu. ROI oluşturulması, yazılım tanımlı arka plan kuyularının virüs titre örnekleri karşılaştırmak için sağlar.
- Tüm tahlil için temel değerini ayarlamak için, bir arka plan ROI kullanın. Measu ROI içinde Odyssey yazılım tarafından sağlanan iki karşıt çapraz kıllar tanıtımı,, kuyu genelinde floresans of yoğunluğunu re.
- Tespiti için 780 nm kanal ve LI-COR Odyssey IR tarayıcı referans dalga boyu olarak 680 nm kullanarak plakaları tarayın.
- 'Salt' komutunu aktive edildiğinde,, ROI düzgün aralıklarla floresan yoğunlukları ölçülebilir ve toplanan verilerin entegre noktaları. Standart sapma çarpanı, ROI tespitinde yer alan taban üzerinden sinyal seviyesi belirler.
- Arkaplan floresan tek başına kontrol mock-enfekte veya sekonder antikor miktarı edilecek ve test kuyularda entegre yoğunluğunu tahmin etmek için kullanılır.
- Net tanımlanmış bir tek spot piksel hacmi temsil eder ve özelliği boyutu bağımsız olduğundan hesaplamalar için 'entegre yoğunluğu' seçti. ,,, Bilinmeyen bir numuneleri of viral bir bir titreleri, hesaplamak etmek bilinen bir bir viral bir titreleri> from standart bir bir bir eğrisi> kullanın ve. Tam viral titreler hesaplamak için uzun bir interpolasyon kullanın. V hesaplayın,,, standart bir bir eğrisi ile birlikte,,, 'test numuneleri of şiddetlerinin karşılaştırırken kullanıcısı tarafından,' test numuneleri in iral titreleri.
4. Temsilcisi Sonuçlar
IR boya bazlı, yüksek verimlilik viral algılama sistemi Standardizasyon
PR8 virüs MDCK hücreleri enfekte edebilir, bu nedenle, biz bu testte geliştirmek için bu hücreleri kullanıldı. Biz,,,,, bir influenza, viral bir bir matrix protein (M2), karşı, bir birincil bir bir antikor kullanarak viral bir titreleri ölçülen. ,, Diğer metodolojileri etmek kontrast In, biz,,,,, bir yakınındaki-IR bir dye etmek konjuge edilmiş konumundadır, bir ikincil bir bir antikor kullanılan. Bu, yöntemini,,,,,, M2 protein saptamada ederken oluşturulur edilir Değerlendirilmemiş floresans yoğunluğunu kullanarak basit bir, bir, otomatikleştirilmiş PR8 virüs titresinde tayini sağlar. , Influenza virüs enfeksiyon sonra,, M2 protein,, çevirilmiş, olarak taşınabilmekte ve,, hücre yüzey de dahil olmak üzere: konak hücre in: birikir edilir. Böylece,, M2 bir protein of nicelik,,,,, virüs of nicelik, belirlemek etmek, bir ölçülebilir bir bir parametre, temsil eder. From şiddetlerinin Karşılaştırılmasıstandart eğri ile test örnekleri viral titreleri hassas ölçüm sağlar.
Floresans tabanlı yöntemin etkinliğini belirlemek için, kültürlü 4 MDCK hücre / odasında 10 gece boyunca kayar. Bilinen bir titreleri of PR8 viral bir stokları,, farklı bir bakteri plağını şekillendirme üniteleri (PFU) ile birlikte ilgili kuyulara çoğaltmak etmek da eklendi, ve,,, birini saatlik için hücreleri üzerine adsorbe etmek etmek tanesine izin verilen edildi. Hücreler bir düzen içinde,, virüs yaymak etmek izin vermek etmek,, 16 h için kuluçkalandı edildi. , Bu bir çalismadan sonra,,,,, odacık slaytları in MDCK hücreleri - AlexaFluor kullanıcısı tarafından için 488-konjuge edilmiş bir ikincil bir antikor +, bir ek bir 1 h izledi, için, 1 h,,, 1% paraformaldehite ile birlikte giderilen yıkandı ve, anti--M2 antikor ile lekelendirilmişti edildi. Enfekte MDCK hücreleri Konfokal mikroskopik analizler yapışık tek tabaka büyük ölçüde sağlam ve, PR8-kaynaklı M2 proteini enfekte MDCK hücreleri (Şekil 1A) içinde bol miktarda gösterdi. Floresanlama hücreleri gibi düşük viral titreler enfeksiyonlar tespit edilebilir 10 2
Bu nedenle, doğru bir viral tahmin yöntemi kurmak için bir IR boya bazlı saptama ve miktar tayini sistemi istihdam. MDCK hücreleri (10 4 / kuyu üretim) Mayıs,,,, PR8. Ve viral proteinler sentezlenir ile birlikte bulaşmışsa 96-well bir plakaları, in kültürlenen edildi,, anti-M2,,, bir IR bir dye-konjuge edilmiş bir ikincil bir antikor, kullanıcısı tarafından izledi. Kullanarak algıladı edildi. , Anti--M2 antikor of kullanımını,,, bize,, viral bir nicelik of, bir doğrudan bir bir bir metrik gibi antijen-belirli bir bir bir floresans bir yoğunluğunu kullanmak etmek, izin verilen. Floresan yoğunluğu numaralandırmak için, biz LI-COR Odyssey tabanlı IR tarayıcı kullanılır. Bu sistem iki kanallı lazer bas kullanıred IR tespitlerde florofor belirlemek ve bunları ayırt etmek için arka plan gürültü. Birinci kanal, 680 nm dalga boyunda heyecanlandıran ve arka plan ölçmek yardımcı olmak üzere 700 nm dalga boyunda yayar. Ikinci kanal 780 nm florofor heyecanlı bir şekilde algılar ve 800 nm dalga boyunda yayar. LI-COR Odyssey, PR8-enfekte MDCK hücrelerin viral bir, titrede-bağımlı parlak floresans (Şekil 1B) Tarama belirtti. M2 pozitif floresan MDCK hücreleri kuyular (Şekil 1B) içinde açıkça görülüyordu. Floresans şiddetinin 10 2 -10 5 PFU itibaren virüs titresi pozitif korelasyon, sürekli olarak gözlenebilir. PR8 virüs titrasyonları testin duyarlılığı için bir üst sınır ayarlar 10 6 hücre ölümüne PFU kurşun, daha yüksektir. 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titreler yakın-IR boyalar yüksek hassasiyet göstermiştir Minimal fakat fark pozitifliği ile tutarlı görülmektedir. Sinyal-gürültü oranı, moc karşılaştırılarak tespit edildik-enfekte veya izotip antikor ile tedavi edilen MDCK hücreleri. Bu denetimlerin her ikisi de, floresans ihmal veya belirlenemeyen düzeyleri (Şekil 1B) sonuçlandı.
,, Daha ileri, bir hassaslık iyileştirmek etmek için ve,, test edilen numunenin hacim ihaleler, azaltmak etmek, biz 5 bulaşmışsa × 10 3 MDCK hücreleri / kuyu üretim,, 384-well plakaları in. PR8 Farklı PFUs seri bir günlük dilüsyonları (Şekil 1C) olarak test edilmiştir. (, 384-well plakaları from) Detection hassaslık,, 96-well bir plate deneyleri of olduğunu etmek-laştırılabilir düzeyde idi. PFU 2 10 1 ve 10 Her ikisi de 96-well plakaları etmek karşılaştırıldığında,,, en 384-well plakaları in tutarlı bir şekilde olarak daha iyi bir çalıştı. 96 floresan yoğunluklarına kullanma - ya da 384-plaka formatları, standart titrasyon eğrileri (Şekil 1D) inşa edilmiştir. Bu hesaplamalarda, ilk değişken İkinci değişken floresan yoğunluğu ise viral titre. Bu nedenle, bir eğri-fit determ oluşturmak için üstel dağılımviral titreleri ve floresan yoğunluklarına arasındaki - polinom ilişki ine. Biz de PR8 virüs nükleoprotein (NP) (veriler gösterilmemiştir) yöneltilen başka bir antikor kullanarak gözlemler valide. , PR8 suşlar of Distinct kaynaklardan, aynı zamanda aşağıdakilerle,,,,, anti--NP ya da anti--M2 antikorlar (veri gösterildiği değil.) Ile birlikte test edilmiş edildi MDCK hücreleri, infect etmek kullanılan edildi. Topluca, IR boya bazlı protein algılama sistemi viral suşlar bulaşmasını teşhis ve hassas bulaşmasını patojenlerin titresi numaralandırmak yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.
Viral titreler hesaplamak için matematiksel irdelemeler
Floresans yoğunluğu ve titresi tespitler matematiksel hesaplamalar aşağıda açıklandığı gibi yapılır. Boyama işlemi sonrasında, bütün plaka veya levha içi kuyulardan seçilen LI-COR Odyssey yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir. Otomatik Shape Aracı kullanarak, hedef bölge sınırları (YG) 96 test kuyularının ortasında çekildi - veya 384-bizll plakaları (Şekil 2A ve B). ROI oluşturulması, yazılım tanımlı arka plan kuyularının virüs titre örnekleri karşılaştırmak için sağlar. Bir arka plan ROI tüm tahlil için başlangıç değeri ayarlamak için kullanılır. Kuyu (Şekil 2C) arasında floresans yoğunluğunu ölçmek için ROI içinde iki karşıt çapraz kıllar (beyaz) tanıtıldı. Sağ tarafına ve Şekil 2C temsilcisi kuyu altında Eğriler Bu çapraz kıllar birlikte piksel yoğunluğunu temsil eder. , ROI düzgün aralıklarla floresan yoğunlukları ölçüldü ve toplanan veri noktaları entegre edildi. Bir standart sapma çarpanı, ROI belirlenmesi dahil edildi başlangıçtan sinyal seviyesi belirlenir. Arkaplan floresan mock-enfekte olmuş ya da ikincil yalnız antikor kontrolleri ölçülebilir ve test kuyularda entegre yoğunluğunu tahmin etmek için kullanılmıştır. Bu repres çünkü hesaplamalar için entegre şiddeti seçtitanımlanmış bir tek spot ve veliler net piksel hacmi özelliği boyutu bağımsızdır. Buna ek In,, entegre bir yoğunluğunu,, çözünürlük of önemli ölçüde bağımsız bir konumundadır. , Total yoğunluğunu / pixel (I) ',, from kaynaklanan sinyal intensiteli etmek tekabül etmektedir,, pixel area (Is.), Plus,,, pixel area (b), of arka plan from kaynaklanan sinyali in yanı olarak seçili olan. Bu nedenle, piksel için 'i':
I i = I s i + b i
Pixel hacim,, hem, sinyali of magnitude, ve it dağıtılmıştır edilir hangi in area, her ikisi de, temsil eder. Signal area,,, sinyali getirici edilir numune of dağıtım etmek ile ilgili edilir. Piksel hacmi piksel alanında 'i' (a) kat yüksekliği (I) piksel cinsinden ölçülen sinyal toplamına eşittir. Yani piksel için 'i':
vi = ben
Total pixel Ses (volume),, böylece tamamını bir area from total isareti kullanılarak kestirilmesinde kul-lanılabilir of değer sumasyon, konumundadır:
| ; | n | n | |
| V = | Σv i | = | aΣI i |
| i = 1 | i = 1 |
Entegre yoğunluğu daire / dikdörtgen (sayı mm 2) alanı ile çarpılır özelliği içine tüm piksellerin yoğunluk değerleri toplamı,. Bu nedenle olarak, entegre bir yoğunluğunu =
(ΣI i - b)
Here olarak, b,, Puan ortalaması bir arka plan pixel yoğunluğunu, için standları. Bu formül, kontrol veya deneysel kuyu entegre sinyal intensitesi hesaplar ve böylece standart bir eğri oluşturur. Test örnekleri içinde Viral titreleri Bu standart eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır. Concentration (yoğunluğunu of),,,,, tanımlandığı, bir Yatırım Getirinizi in floresans bir şimdiki of nicelik olarak bir tanımlandığı edilir. Test örnekleri içinde konsantrasyonları hesaplamaAynı görüntü standartları tanımlanmış konsantrasyonlarını ted akrabası. , Hassas bir viral bir titreleri, hesaplamak etmek için>,,, her biri konsantrasyon standart bir of yoğunluğunu, çizilen ve,,, bir uzun süre bir enterpolasyon eğrisi ile birlikte takılmıştır edilir. ,, 'Test numuneleri of Kullanılacak konsantrasyonlar,,, standart bir bir eğrisi mesafede olan area of yoğunluğunu, karşılaştırırken kullanıcısı tarafından hesaplanmış uygulanır.
Grip bulaşmış farelerin BAL sıvısında viral titreleri Belirlenmesi
Klinik ve laboratuvar örneklerinde canlı grip viral parçacıkların Algılama kritik önem taşımaktadır. Bu nedenle, sonraki laboratuvar örneklerinde viral titreler belirlemek için bu yöntemi kullanan olup olmadığını inceledi. , BAL sıvılarıyla,,, non-aşı yaptırmamanız fareler from toplanan ve,,,,, PR8 virüs of, bir da bilinir bir miktarını ile birlikte spike edilmiş edildi. Tırnaklı BAL sıvılarında doğrusal viral titreler sıralandıran için titre edilmiştir. Kirpi BAL sıvılar alikotlan, 96-kuyucuğu MDCK hücreleri enfekte etmek için kullanılan sabit ve anti-M2 ve IR boya-konjuge secondar ile boyandıy antikorlar. , Şekil 3A in gösterildiği göster Sonuçlar,,,, çivili bir BAL akışkan in viral bir titreleri saptanabilen idi ve, standart bir bir eğrisi in PR8 titreleri bir ile birlikte korele olduğunu, göstermelidir. Standart eğrisi kullanılarak, çivili ve titre BAL sıvısında hassas viral sayıları ölçüldü. Üstel eğri uygun hesaplamalar kirpi BAL sıvısında (Şekil 3B) viral titreler hesaplamak için bir tedbir sağladı. Bu yöntem sayesinde biz bu yaklaşımı (Şekil 3C) onaylayarak, hesaplanır ve çivili viral titreleri arasında mükemmel bir korelasyon elde edilmiştir.
Sonra, biz, PR8-enfekte olmuş fareler BAL sıvısının analiz edilmiştir. PR8, yaygın bir biçimde,,,, insan patoloji ve, anti-viral bir bir bir dokunulmazlığının 3 anlamak için, faregillere ait diğer modelleri in kullanılan edilmiştir gelmiştir. Farelerin Gruplar intranazal PR8 5.000 PFU ile enfekte edildi. Fareler kilo kaybı, kambur arka görünüm, karıştırdı kürk ve diğer klinik belirtiler yönünden takip edildi. Days,,: 0, 2, 4, 7 ve yazılan mesaja enfeksiyon olması of 10 yazın üzerinde,fareler sakrifiye edildi ve BAL sıvılarında toplanmıştır. , Bu laboratuvar numuneleri yararlanmak etmek için, MDCK hücreleri,, 96-well plakaları in 17 h için,, 50 mikrolitre of, bir nihai bir bir hacim in, kan veya BAL sıvısından of seri bağlantı seyreltiler ile birlikte enkübe edildi. MDCK hücreleri bilinen titreleri stok PR8 virüs ile enfekte Kontrol kuyuları, standart bir eğri oluşturmak için görev yaptı. Enfeksiyondan sonra, hücreler, yıkanmış, sabit ve-IR yakın boya-konjuge sekonder antikor, anti-M2 primer antikor ile boyandı. MDCK hücreleri mock-enfekte olmuş veya enfeksiyon titresi hesaplamalar için arka plan floresan yoğunluklarına sonra sunulan izotip kontrolleri ile tedavi edildi.
BAL sıvısının Analizleri laboratuvar numunesi PR8 virüs, IR boya temelli analiz sistemi aracılığıyla tespit olduğunu gösterdi. Gün 2 ve 4 post enfeksiyonu (Şekil 4A) viral yük BAL sıvısında önemli bir artış gözlendi. Entegre yoğunluk Hesaplamalar gün 2 ve 4 BAL sıvılarında i aktardığımızdannfection PR8 virüs önemli düzeyde (Şekil 4B) içeriyordu. Bizim sonuçlarımız hastalığın şiddetini gösteren yavaş ama belirgin kilo kaybı,, PR8 enfeksiyon erken aşamasında göstermektedir. Bununla birlikte, en farelerin 7 gün sonra enfeksiyon (Şekil 4C) hastalığı belirtileri kurtarma ve kilo başladı. 10 gün, enfeksiyondan Fare, klirensi virüs, aynı zamanda vücut ağırlığı artışı ve hastalık belirtileri önemli ölçüde azalma ile korelasyon gösteren herhangi bir saptanabilir PR8 yoksundu.
Bu testin uygulama daha da genişletmek için, A (H1N1) insan influenza IR boya bazlı antikor algılama sistemi ile izole etmek ve 2009 test real-time PCR yöntemi ile karşılaştırdık. Bu klinik örnek şüpheli hastadan elde edilen bir kombine, nazofarenks / boğaz sürüntü izole edildi. Milwaukee Sağlığı Anabilim Dalı Laboratuvarı'nda izole MDCK hücre hattı yayılır. Test sonuçları iştigalIR boya temelli bir yöntem gerçek zamanlı PCR (Şekil 5) hassasiyetini kontrol etmek için kırmızı. IR boya bazlı antikor algılama sistemi klinik ilişkisi içinde PCR tabanlı assay (10 TCID 50 / ml) ve sonbahar karşılaştırılabilir 10 3 TCID 50 / ml gibi düşük viral yükü tespit etmek için bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Çoğu hasta numunelerinin aralığı. Bu sonuçlar, IR boya bazlı analiz sistemi yeterli duyarlılık ve araştırma laboratuar ve klinik ortamlarda viral titre numaralandırma için uygulanacak potansiyel olduğuna dair kuvvetli kanıtlar sağlar.
Şekil 1. Influenza virüsünün IR boya bazlı bağışıklık algılama. (A) 8-iyi oda slaytlar influenza ile enfekte MDCK hücreleri Konfokal mikroskopik analizler. İmmünofloresan mikroskopik analizler yapışık MDCK tek tabaka büyük ölçüde sağlam ve yüklü M ile virüs kaynaklı olduğunu göstermektedir2 protein. (BC), IR boya ve LI COR Odyssey sistemi dayanan viral titreleri NİCELLEME. (D) standart eğrileri ve üstel eğriyi-fit profilleri üretimi. MS sunulan veriler, beş bağımsız deneyler temsilcisi vardır.
Şekil 2. Viral titreler IR boyalar kullanarak belirlenmesi Metodolojisi (A) Entegre floresan yoğunluğu ölçümleri. Test kuyusu (ROI) içinde tanımlanmış bir bölgesi floresan yoğunluklarına ölçmek için kutlandı. Otomatik Shape Tool kullanarak, ROI sınırları ortasında 96 test kuyularının çizildi veya plakaları 384-iyi. Floresans ROI içinde bireysel piksel (piksel = n) olarak ölçüldü. Entegre yoğunluğu daire / dikdörtgen (sayı mm 2) alanı ile çarpılır özelliği içine tüm piksellerin yoğunluk değerleri toplamı,. (B) testi kuyu entegre floresan yoğunluklarına belirlenmesi. ROI YaratılışLI-COR tarayıcı tanımlı arka plan kuyularının virüs titre örnekleri karşılaştırmak için izin verdi. Arkaplan floresan mock-enfekte olmuş ya da ikincil yalnız antikor kontrolleri ölçülebilir ve test kuyularda entegre yoğunluğunu tahmin etmek için kullanılmıştır. (C), ROI içinde veri noktaları Koleksiyonu. Iyi genelinde floresans yoğunluğunu ölçmek için ROI içinde iki karşıt çapraz kıllar (beyaz) tanıtıldı. Sağ tarafına ve temsilcisi kuyu altında Eğrileri Bu çapraz kıllar birlikte piksel yoğunluğu temsil eder.
Şekil 3,. , PR8 kirpi BAL sıvılarında virüs titreleri Algılama ve miktar (A) MDCK hücreleri bir gecede 96-kuyucuğu kültüre ve, PR8-kirpi BAL sıvı ile eklendi edildi. Tabaklar LI-COR Odyssey sistemi okundu. (B) Eksojen kirpi BAL sıvısında standart eğrileri ile karşılaştırıldı. Hesaplanmış etmek beklendiği bir Vir of (C) karşılaştırmamızda ve ve al titreleri. Üstel eğri y = 9.4784e 0.0014x sağladı. , AC in sundu Veri,,,, üç bağımsız bir deneyler of temsilcinizle şunlardır.
Şekil 4. Grip virüsü, PR8 enfekte farelerden alınan BAL sıvılarında tespiti ve ölçümü (A) farelerin Gruplar intranazal, PR8 5.000 PFU'nun ile enfekte edildi. MDCK hücreleri,,,, 96-well plakaları in, 17 h için 50 mikrolitre için of, bir nihai bir hacim in,,,, kan veya BAL sıvısından of seri bağlantı seyreltiler ile birlikte kuluçkalandı edildi. Enfeksiyondan sonra, hücreleri, yıkandı,, giderilen ve, IR, dye-konjuge edilmiş ikincil bir antikor: tarafından izledi,,, anti-M2 bir birincil antikor ile birlikte boyand edildi. Sağdaki paneli standart eğri temsil eder. (B) enfekte olmuş fareler BAL sıvısında viral titreleri belirlenmesi. (C), PR8 enfeksiyonu sırasında fareler Kilo kaybı viral yük ile ilişkili. , AC in sundu Veri,,,, üç bağımsız bir deneyler of temsilcinizle şunlardır.
yeniden 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
Şekil 5,. 2009 tespiti ve miktar A (H1N1) pandemisi (pdm), grip, insan bir hastadan izole eder. (A) enfekte MDCK hücre hattı yarım kat titrasyon IR boya bazlı antikor floresan sistem algılama. Floresans sonuçları ölçüm 10 3 TCID 50 / ml gibi düşük gibi viral yükü tespit etmek için bir potansiyele sahiptir. (B) kültür çıkarılan Nükleik asit CDC real-time PCR 12 ile analiz edildi izole bilinen titre H1N1, seri on kat seyreltme ile birlikte izole. Real-time PCR için algılama sınırı 10 TCID 50 / ml idi.
Discussion
Güneydoğu Asya'da kuş gribi ve domuz gribi salgını küresel bir korku son salgın patlak kamu sağlığı ve güvenliği için çok büyük endişeleri empoze. Eleştirel odak noktası mevcut ve yeni influenza virüs suşları için aşılar üretmek ithaf edilmiştir. Hassas algılama ve doğru viral titresinde hesaplamalar için hızlı, yüksek verimli teknolojilerin mevcudiyeti muazzam tedavi artıracaktır. Virüs titresi hesaplamak için kullanılan en sık kullanılan teknikler, plak oluşumu ve grip hemaglütinasyon testleri içerir. Plak oluşturan deneyi ilk bakteriyofaj titreleri tahmin etmek için geliştirilen ve hayvan viral titreler 4 hesaplamak için Renato Dulbecco tarafından kabul edilmiştir. ,, Bu assay gerçekleştirdiğinizde etmek için>,, 6-well plakaları in,,, influenza hisse senedi ya da hayvansal numuneler:, bu tür BAL akışkan gibi of 10-fold seyreltiler hazırlanır uygulanır ve 0,1 ml '> alikotları,,, MDCK hücreleri of monolayer hızda aktarılması gibi son derece önemli özellikler inoküle edilmiş uygulanır. Virüs reklam takip MDCK hücreleri üzerine adsorbe izin verilirbir besin ortamında ve agaroz olduğunu belirtmektedir. İnkübasyon sırasında, orijinal enfekte olmuş hücrelerde sadece komşu hücrelere yayılan viral döl bırakın. : Sitopatojenik bir efekti:,, influenza viral bir enfeksiyon of,, bir teşekkür plaketi olarak adlandırılan, enfekte olmuş hücreleri of, bir dairesel bir bir bir dilimini oldu üretir. Her plak muhtemelen virüs çoğaltma tarafından tek bir virüs parçacık tek bir hücrenin enfeksiyonu sonrası oluşur. Canlı hücreler ve plaklar arasındaki kontrastı kristal viyole gibi boyalarla artabilir. Bu testin önemli bir dezavantajı, tekrarlanabilirlik ve deneyler içinde büyük farklılıklar olmaması. ,,, Influenza viral bir titresinde belirlemek etmek kullanılan Başka bir assay,,, bir hemaglüsinasyon assay konumundadır. ,,, Influenza virüs of yüzey on The hemagglutinin bir protein şimdiki, verimli bir şekilde,,,,, memeli ve avian bir, kırmızı kan hücreleri 1 on N-asetilnöraminik ait, asit-ihtiva eden proteinleri etmek de de bağlar. ,,,,: Influenza virus: ve da aglütinasyon, eritrositlerde tarihleri arasında Bu, bir etkileşim,,, bir lattice of arama formunu, in agglutination etmek yol açar. The Lagglutinasyon evel test örneklerinde influenza virüsü titresi tahmin etmek için kullanılır. Eritrosit agglutination assay, Malzemenin, bir için, da bilinir bir virüs of titrasyon belirlemek etmek,, yalnızca olarak kullanılan edilir ve,, strain tanımlama amaçlarla için kullanılan uygulanmaz değil edebilirsiniz.. Bu deneyde canlı ve ölü virüsler arasında ayrım yapmaz bu yana, viral titreleri kesin bir hesaplama elde etmek zordur.
Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,6 dayanmaktadır. Burada açıklanan yeni bir yöntem, aynı zamanda klinik ve laboratuvar tanı potansiyeline sahiptir. Grip algılama kitleri Directigen FLU-A,, nükleoprotein 7 gibi viral antijen tespit etmek için (BD Biosciences, San Jose, CA) ve BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) kullanımı immunakromatogrfi tahlil. , Virüs tespiti, bu kitleri kullanılarak 15 dakika içinde elde edilebilir, ancak tüm olumsuz örnekleri daha s olmasıDiğer: hücre kültürü: İçerikler üzerine yöntemini kullanıcısı tarafından creened. Çeşitli çalışmalar da enfeksiyon hafif veya 8 düşük olduğunu, özellikle bu kitler düşük hassasiyet, bildirdin. Geliştirilen yöntemde, sürekli olarak virüs gibi düşük olarak 100 PFU algılar. Bu,, bulaşmasına hafif bir konumundadır hatta, ne zaman bizim tekniktir,,, klinik numuneleri in H1N1 bir virüs saptamada in yararlı bir, konumundadır, da anlaşılacağı. ,, Ya da nazofarengeal bir aspirat, numuneler doğrudan doğruya olarak analiz edildi, ya da,,,, virüs çarpma ve müteakip analizler 9, için yatkındır hücreleri of, bir monolayer üzerine inoküle edilmiş edildi nerede,, viral bir antijenleri algılamak kullanıcılar etmek A floresans-tabanlı bir yöntemini, bildirdin, edilmiştir. Bununla birlikte,, bu yöntemlerden,,, tanısal amaçlarla için sınırlıdır ve, virüs titresinde hesaplamalar için uygun bir değil şunlardır? Uygulanır. , Q-PCR ile,,,, viral bir RNA, of varlığında tanımlamak etmek yardımcı olur ve,, canlı bir virüsler of enfektivite tahmin ediyoruz değil bulunmamış. Bu testler karşılaştırıldığında, IR boya bazlı analiz sistemi, klinik ve laboratuvar örnekleri algılama ve viral titre numaralandırma, yardımcı olacaktır. Grip salgını durumunda, bukısa bir süre içinde binlerce örnek teşhis etmek önemlidir. 384-plaka ve IR tarayıcı dayalı Bizim yöntemi, bu nedenle diğer direkt floresan yöntemlerine göre daha fazla avantaj sunan bir süre (> 2.000 örnekleri) 6 plakaları tarayabilir. Binlerce klinik örneklerin hızlı işlem Fizibilite testi zaman ve maliyet test değişkenliği, süresini azaltabilir. ,, Bir M2-belirli bir bir antikor of kullanımını,,,,,, H ve N proteinleri in strain farklılıkları of bağımsız bir olmanın of avantajı, sunmaktadır. M2 proteini nispeten insanlara bulaşmasını en influenza suşlarına korunur. Dolaşan lekeler için özel antikorlar sistemi ile kombine edilmesi durumunda bir virüs titresi ölçmek ve zorlanma tespit edebilir. Ancak,, M2 Amantadin benzeri ilaçlar için bir hedef olduğundan, mutantlar, burada kullanılan, mAb için bağlayıcı bir site değişebilir ortaya çıkabilir. Bu, bu ilaçlarla tedavi edilen bireylerde bu sistem için potansiyel bir sınırlama ifade eder.
Çokludeneyleri,,,, test örnekleri içinde influenza titreleri numaralandırılamadı kullanıcılar etmek kullanılır uygulanır. Virüs titresi,% 50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID 50) ve yumurta allantoik sıvı tabanlı testleri hesaplamak için yaygın olarak 1,10 kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla gün gereksinimleri bu yöntemler daha az güvenilir olun. Dahası,, bu yöntemlerden, in,,,,,, plaklarla of numarasını in% 50 oranında değişikliği on dayanır hesaplamalar,, teorik bir, ancak doğru bir değil viral bir titrasyonlarını sağlamak. Plak testleri oluşturan 96 saat içinde yapılabilir, ancak tekrarlanabilirliği eksikliği, viral titre hesaplamalarda önemli bir husustur. Burada anlatılan bu tekniği birkaç belirgin avantajları vardır. İlk olarak, tutarlı sonuçlar ile yüksek oranda tekrarlanabilir bir tekniktir. İkincisi, viral titre hesaplamaları tanımlanmış standart eğrileri karşılaştırılarak floresan yoğunluklarına basit miktar dayanmaktadır. Üçüncü olarak,,, iki ya da daha fazla çok birincil antikorlar,,, verilen, bir numune in birden çok serotiplerinin tanılamanıza kullanıcılar etmek kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. Ayrıca, IR boya-konjuge antikorların damlaark otoflöresansının değerlendirilmesi ve hücre imajlama 11, için kullanılan> edilmiştir> adres. Varlığı yüksek kuantum verimli endojen florofor nedeniyle yüksek hücresel otofloresans UV veya görsel radyasyon (300-600 nM'den) sonuçları. Bunlar,,,, aromatik bir amino asitler, lipo-pigmentleri, pyridinic. Nükleotidlerle (NADPH.), Elastin, kollajen ve flavin koenzimlerinin şunlardır. Hücreleri of Bu, intrinsik bir bir mülkiyet,,, spesifik proteinlerin of, probes bir ekspresyonu quantify etmek gibi dolu sunucular, it zor bir,, radyasyon of, bu kaynaklardan yararlanmak olan etmek hale getirir. Kontrast yılında,, yakınındaki-IR boyalar,,, heyecanlandırabilir ve 670-1000 nm tarihleri arasında yayarlar. Birçok konağın hücresel moleküllerin ve poliaromatik hidrokarbonlar bu dalga boyunda heyecanlandırmak ve düşük ışık saçılması nedeniyle, son derece düşük eşiğe yaymaz. Dahası,,, arka plan ve belirli bir bir algılama tarihleri arasında window,,, büyük ölçüde,,,, yakınındaki-IR florofor gruplarının, of, bir, yüksek bir soyu tükenme katsayısı, etmek nedeniyle artırıldı edilir. , Üstün sinyal-gürültü oranı, Fotostabilite viral titreleri nicelleştirmesinde son derece uygundur. Microfl of kullanınuidic odaları robotik kontroller aracılığıyla tarama işlemi otomatik olacak ve kullanım kolaylığı ile bize son derece bulaşıcı bir klinik test etmek için izin verebilir. Böylece, bu yöntemlerin yakın IR boyaların kullanımı doku örneklerinde viral titreleri numaralandırmak için ideal ve son derece güvenilir.
Disclosures
Biz ifşa şey var.
Acknowledgments
Bu çalışmanın bir parçası NIH hibe R01 A1064826-01 U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM için) desteklenir. Biz yazının eleştiri, tartışma ve teknik yardım için Tina Heil bizim laboratuar üyelere teşekkür etmek isterim. Biz David Bina, Milwaukee Sağlığı Anabilim Dalı Laboratuvarı virüs kültürü ve PCR için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A.
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
