Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

doi: 10.3791/3636 Published: January 25, 2012

Summary

En beskrivning av bildandet av en polymer med användning av microarray en on-chip fotopolymerisation tekniken. Den höga genomströmning ytkarakterisering användning atomkraftsmikroskopi, vattenkontaktvinklar mätningar vinkel, röntgen fotoelektronspektroskopi och flygtid sekundär jonmasspektrometri och en cellvidhäftning analys beskrivs också.

Abstract

Blandning är en enhet operation som kombinerar två eller flera komponenter till en homogen blandning. Detta arbete innefattar blandning av två viskösa vätskeströmmar med en in-line statisk bländare. Biandaren är en split-och-rekombinera konstruktion som använder skjuvning och töj flöde för att öka gränsytan kontakt mellan komponenterna. En prototyp delad och-rekombinera (SAR) bländare konstruerades genom att rikta en serie av tunna laserskurna Poly (metylmetakrylat) (PMMA)-plattor som hålls på plats i ett PVC-rör. Blandning i denna anordning illustreras i fotografiet i fig.. 1. Rött färgämne tillsattes till en del av testvätskan och användas som den mindre komponenten som blandas in i större (ofärgade) komponenten. Vid inloppet hos biandaren, är den injicerade skiktet av spårämne vätska delas i två skikt när den strömmar genom blandningssektionen. På varje efterföljande blandningssektion, är antalet horisontella skikt dupliceras. Ytterst är det enda ström av färg likformigt throughout tvärsnittet av anordningen.

Med hjälp av en icke-Newtonsk testvätska av 0,2% Carbopol och en dopad spårämne vätska med liknande sammansättning, blandning i enheten visualiseras med magnetisk resonanstomografi (MRT). MRT är en mycket kraftfull experimentell sond molekylär kemiska och fysikaliska miljö samt exempel struktur på längdskalor från mikron till centimeter. Denna känslighet har resulterat i en bred tillämpning av dessa tekniker för att karakterisera fysiska, kemiska och / eller biologiska egenskaper hos material, från människa till livsmedel till porösa medier 1, 2. Den utrustning och förhållanden som används här är lämpliga för avbildning av vätskor som innehåller avsevärda mängder av NMR mobil 1 H såsom vanligt vatten och organiska vätskor, inklusive oljor. Traditionellt MRT har utnyttjat super ledande magneter som inte är lämpliga för industriella miljöer och inte bärbar inom ett laboratorium (Fig. 2). Senaste framstegen iN magnet teknologin har gjort det möjligt att bygga stora volymer industriellt kompatibla magneter lämpliga för flöden avbildningsprocessen. Här ger MRT rumsligt upplösta komponenter koncentrationer vid olika axiella lägen under blandningsprocessen. Denna arbetsdokument realtid blandning av högviskösa vätskor genom distributiv blandning med en ansökan till personliga hygienprodukter.

Protocol

1. Beredning av låg-fouling bakgrund

  1. Väg upp 2 g av poly (hydroxietylmetakrylat) (PHEMA) (Sigma - cellkultur testas) i en 50 ml centrifugrör. Lös i 50 ml 95% (volym / volym) etanol i vatten. Detta tar normalt 24 timmar av sonikering.
  2. Dip-coat epoxifunktionell glasskiva (Genetix) med PHEMA lösningen. Epoxigrupperna kommer snabbt bilda kovalenta bindningar med PHEMA beläggningen. Doppbeläggning uppnås genom att hålla glasskivan med pincett och doppa sliden i lösningen. Typiskt 5 mm av sliden lämnas obelagd, som är användbar för orientering av sliden och kan också fungera som en positiv kontroll som en vidhäftande yta. Sliden är sedan bort från PHEMA lösningen under en period av 1 s, inverteras och lämnas att torka i en nära horisontellt läge under 10 minuter innan de placeras i en hållare.
  3. PHEMA belagda objektglas lämnas sedan vid atmosfäriska betingelser under 1 vecka för att medge fullständig förångning av than lösningsmedel.

2. Beredning av monomerlösning

  1. Väg 120 mg av fotoinitiatorn 2,2-dimetoxi-2-fenylacetofenon och lägg till 3 ml dimetylformamid (DMF) för att göra en 4% (vikt / volym) lösning fotoinitiator. Detta görs bäst färska före varje upplaga, så massan och volymen av färdig lösning kan varieras för att passa hur mycket fotoinitiator lösning krävs. Lösningen är stabil upp till en månad.
  2. Monomerlösningar framställs genom att tillsätta 1 del av fotoinitiatorn lösningen till 3 delar av den rena monomeren. Detta uppnås genom att pipettera 5 | il av fotoinitiator-lösning och 15 | il av monomeren i en 384 väl källplatta. En total volym av 20 | il är idealisk för fläckbildning. Högre volymer kräver ytterligare blotting innan enhetliga fläckar kan produceras. Mindre volymer kan resultera i ofullständig belastning av tappen.
  3. Denna metod är för närvarande begränsad till användningen av akrylat / metakrylatmonomerer som är lösliga i DMF genom VIrtue av dessa är de enda kombinationer som har utforskats, akrylamider och andra lösningsmedel kommer sannolikt att vara mottaglig för tryckprocessen. För att uppnå monomerkoncentrationen föreslagit (75% vikt / vikt) flytande monomerer även krävs, även om lägre monomerkoncentrationer kan användas för fasta monomerer (den reducerade monomerkoncentrationen inte verkar ogynnsamt förändra ytkemin hos den erhållna polymeren är det dock sannolikt att molekylvikten och glasövergångstemperatur förändras). Höggradigt flyktiga monomerer är också svåra att använda på grund av den snabba förångningen av monomeren före den UV-härdande steg när polymerisering. Beroende på antalet monomerlösningar en körning kan ta så länge som 6 timmar och mot slutet av körningen flyktiga monomererna kommer att ha avdunstat från källan plattan. Användning av flyktiga monomerer kan uppnås genom kylning av tryckeriet och med korta upplagor endast.
  4. Med undantag av ett fåtal mycket hydrofila monomerersåsom poly (etylenglykol) akrylat, upplösningen av den resulterande polymeren fläckarna i vattenhaltiga buffertar har inte observerats, sålunda, är användningen av en tvärbindande monomer inte krävs, men är inte uteslutet.

3. Polymer microarray bildning

Det typiska förfarandet för polymer-bildning microarray visas schematiskt i figur 1.

  1. Microarray bildning uppnås med hjälp av en kontakt robot (Biodot) med användning av en XYZ-steg (figur 2). Slitsade stift 220 nm diameter används (Arrayit 96B). Alla stift bör rengöras med ultraljud i diklormetan under 10 minuter före upplaga och likaså stiftet innehavaren bör också rengöras.
  2. Stift laddas in i hållaren, blotting och array objektglas laddas och sedan hela kammaren är fylld med argon för att reducera syrehalten till under 2000 ppm, vilket är tillräckligt låg för att undvika släckning av polymerisationen radikaler av syre. Luftfuktigheten är maintained till mellan 30-40%. Inklusive fuktighet tillåter PHEMA sväller tillåter den bildade polymeren att tränga PHEMA skiktet och bli fysikaliskt infångas till ytan 2.
  3. Trycket körningen påbörjas. Varje körning består av:
    • Laddar prov från källan plattan. Stiften sänks in i lösningarna vid en hastighet av 25 mm / s, som hölls i lösning under 2,5 s och sedan ut vid en hastighet av 25 mm / s (fig 2).
    • Stift måste läskas före utskrift avlägsna monomerlösningen från utsidan av tappen. Därefter monomer leverans sker från den quilled delen av stiftet för att uppnå konsekvent fläckbildning. Den blotting sekvens som används består av 33 kontakt med en ren glasskiva. För de första fyra positionerna antalet gjorda kontakter är 10, 5, 4 respektive 3. De nästa fyra positionerna 2 kontakter knyts och under de senaste 3 lägen 1 kontakt. Total kontakttid för varje kontakt är 10 ms och förhållningssätt och tillbakadragande hastighet är 175mm / s. Genom denna punkt de bildade fläckar bör ha en enhetlig form och geometri. Fel vid denna tidpunkt visar orena stift eller damm föroreningar i monomeren lösningarna.
    • De monomerlösningar därefter trycks på PHEMA belagda glasskivor (figur 2). En kontakt sker per fläck vid ett stift rörelse på 175 mm / s och kontakttid av 10 ms, vilket beroende på viskositeten och ytenergi av monomerlösningen ger en genomsnittlig fläckdiameter av 400 um. Typiskt 3 upprepade arrayer trycks på varje glasskiva och totalt 10 bilder skrivs ut på en enda körning. Detta motsvarar 30 platser per cykel.
    • Stift tvättas i DMF. 2,5 L av färsk DMF tillhandahålls för hela tvätt körningen. Stift tvättas i ett flöde bad med omrörning.
    • Parallellt med tvätten, de nytryckta objektglasen bestrålades med en kortvågig UV (365 nm)-källa med en densitet på 30 mV / cm 2 under hela tvätt period som varar 30 sekunder.
  4. ENfter alla monomerlösningar trycks uppsättningarna bestrålas med UV (365 nm) för ytterligare 10 minuter.
  5. De nytryckta arrayer hålls vid lågt tryck (<50 mTorr) under 1 vecka för att avlägsna opolymeriserade monomer och lösningsmedel.

4. Hög genomströmning ytkarakterisering (HTSC)

Ett allmänt system för HTSC teknikerna visas i figur 3. Centralt för den automatiserade, hög genomströmning metod är inriktningen av polymeren microarray med karakterisering apparaten. I samtliga fall uppnås detta med hjälp av en kamera som ger en topp vy av matrisen. Initialt är arrayen roteras för att anpassa med XY rörelse scenen. Ett hörn plats i arrayen sedan placerade och utformade specifika koordinater. Positionen av varje polymer fläck kan därefter förutsägas med dimensionerna i uppsättningen.

  1. Vattenkontaktvinkel (WCA) mätningar
    1. WCA mätningarna utförs med den fastsittande släpp-metoden på enautomatiserad Kruss DSA 100 instrument. En enda droppe vatten med en volym av ~ 400 pL utmatas med användning av en piezo-driven skrivhuvudet på varje polymer fläck. Diametern av en polymer fläck är typiskt 300 | im och basdiametern av vattendroppen på polymer platsen är typiskt 100 um, sålunda kan endast en mätning kan erhållas per polymer-fläck.
    2. Ett XY-steget möjliggör automatisk positionering av varje polymer fläck under skrivhuvudet 7. Detta uppnås med hjälp av en kamera placerad ovanför provet som ger en topp vy av matrisen. Initialt måste kamerans position justeras för att anpassa utlämnandet av vattendroppen till centrum av kamerans vy och sedan uppsättningen kan anpassas till skrivarhuvudet.
    3. En höghastighetskamera registrerar sidoprofil av droppen vid träffar ytan och därefter indunstning. Ramen som fångar den initiala effekten av droppe används för att mäta kontaktvinkeln. En cirkel är monterad på nedgången profile och kontaktvinkeln bestäms senare.
  2. Time-of-Flight Secondary lon Mäss Spectrometry (ToF-SIMS)
    1. Prov laddas på scenen. Detta innebär för det första foder scenen med rent Al-folie, som hjälper till med laddning ersättning och sedan hålla bilden på plats genom användning av flikar plåtskruven.
    2. Prov steg placeras i överföringen kammare ToF-SIMS och får pumpa tills 1,6 × 10 -6 mbar. Provet överförs sedan till den huvudsakliga analysen kammare, som typiskt har ett vakuumtryck av 1,0 x 10 -8 mbar.
    3. TOF-SIMS mätningarna utförs med en jon-TOF IV instrumentet manövreras med en monoisotopisk Bi 3 + primär jonkälla drivs vid 25 kV i "knippen läge". En pulsad 1 pA primär jonstrålen rastered över analysen området, med både positiva och negativa sekundära joner uppsamlade från en 100 x 100 | im område av varje polymer plats i mikromatris för en 10-sekOND insamlingstid. Ion massorna bestämdes med användning av en högupplösande Time-of-Flight analysator tillåter exakt massa uppdrag. Den typiska massa upplösning (vid m / z 41) var drygt 6000. Lågenergielektroner (20 eV) användes för att kompensera för ytan laddning orsakad av den positivt laddade primära jonstråle på de isolerande ytorna 8.
  3. Atomkraftsmikroskopi (AFM)
    1. En stor scen AFM med ett automatiserat steg krävs för att analysera arrayer på glasskivan. En dimension eller ikon mikroskop är perfekt för detta ändamål.
    2. Provet placeras på scenen och scenen position homing till övre högra hörnet av matrisen.
    3. Placeringen av det nedre vänstra hörnet av matrisen hittas tillåter vilken position alla andra platser att interpoleras.
    4. En position lista genereras och matas in i automatisk provtagning i programvaran.
    5. AFM mätningar utförs enligt en NanoScope 3000A instrument knacka mode. Silicon tips med en resonansfrekvens på ungefär 300 kHz och en styrka av konstant 40 N / m användes (Tap300Al, Budget Sensorer). 5x5 um regioner av polymeren mäts 9.
    6. Det kvadratiska medelvärdet (RMS) ojämnhet mäts över denna region för varje bild med SPIP programvara batchbearbetning. Varje bild är från början tillplattad innan ojämnhet mätningar.
    7. Alla bilder kräver en manuell visning för att identifiera imaging artefakter som kan behöva tas bort från ojämnhet mätningar. Under detta steg bilder kan också kategoriseras baserat på gemensam yta funktioner 9.
  4. Röntgen fotoelektronspektroskopi (XPS)
    1. En microarray bild är fäst på ett prov bar med dubbelhäftande tejp och därefter laddas in i provkammaren en Kratos Axis Ultra XPS instrumentet.
    2. Gå in provkammaren och vänta tills den når ett tryck under 10 -8 Torr.
    3. Lämplig funktionparametrar, såsom en monochromated röntgenkälla (Al, 1486,6 eV), anod potential och ström (10kV och 15mA), bländare storlek (110μm), Godkänd energi (80 eV för bred skanning och 20 eV för hög upplösning skanning) är valts. Röntgen källa fokuserad med två motsatta hörn av mikromatrisen och optimera syret signalen från provet. X-och y-positioner individuella fläckar bestäms sedan och loggas som en ställning lista.
    4. Ett program diagram skrivs och sedan köra för förvärvet av data, inklusive det breda skannar och höga skannar upplösning för specifika element.
  5. Raman-spektroskopi
    1. Raman spektra tas för varje polymer fläck med en ramanmikroskop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Initialt Ramansignalen kalibreras med användning av en kiselskiva och Raman förskjutning av Si vid 520,7 cm -1.
    2. Provet placeras sedan på scenen och i fokus för laser (våglängd = 523 nm) justeras för att maximera CH Raman skiftvid 2950 cm -1.
    3. Positionen för centrum av den övre vänstra platsen på microarray sedan in som ursprung och en karta över microarray är inställt med arrayen funktionen på labRAM HR programmet.
    4. 10 spektra förvärvas kumulativt för varje prov med en bestrålningstid av 0,5 sekunder.

5. Bakteriell analys

Matrisen kan utsättas för många olika biologiska analyser, inklusive fastsättning och proliferation av stamceller, andra celler typer och bakterier 3,10,4. Här beskriver vi en bakteriell infästning analys, vilket visas schematiskt i figur 4.

  1. En bakteriestam transformerad med GFP uttryckt plasmid odlas över natten vid 37 ° C i 10 ml LB-medium i en 50 ml Falcon-rör med skakning vid 200 varv per minut.
  2. OD 600 av bakteriekulturen mäts och tillräcklig natten kulturen ympades i 15 ml definierade RPMI-1640 medium för att ledai en slutlig OD 600 av 0,01.
  3. Arrayer förtvättades i steriliserat destillerat vatten för 10 minuter för att avlägsna eventuella lösliga komponenter från uppsättningarna (unpolymerised monomer, oligomerer och lösningsmedel)
  4. Tvättade array bilder placeras i en ren petriskål och UV steriliseras i 10 min.
  5. En bild med matrisen placeras i en petriskål och 15 ml av de inokulerade RMPI-1640 medium tillsätts. Samtidigt annan bild placeras i en petriskål och inkuberades med icke-innoculatd RPMI-1640 som en kontroll.
  6. Objektglasen inkuberas vid 37 ° C under 72 timmar med skakning vid 60 varv per minut.
  7. Objektglasen tvättas två gånger med 15 ml steril PBS.
  8. Objektglasen tvättas två gånger med 15 ml sterilt destillerat vatten.
  9. Bilderna är lufttorkas.
  10. Diabilder avbildas med en GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) med en 488 nm excitation laser och standard blå emissionsfilter (510-560 nm). En representativ polymer autofluorescens bild ärvisas i figur 2. Detta bör göras så snart som möjligt för att undvika förfall GFP. Om detta inte är möjligt bör de celler genomgå fixering. Vidare är införandet av lämpliga positiva kontroller med en känd bakteriell svar absolut nödvändigt att kunna normalisera resultaten och tillåta experiment utförda på olika dagar för att vara kvantitativt jämförbara. Den totala fluorescensintensiteten från polymera fläckar förvärvas med GenePix Pro 6 programvara (Molecular Devices, USA). Detta görs för båda bilderna inkuberade med bakterier och bara media. För att hitta den fluorescens på grund av tillväxt av bakterier fluorescensen på mediakontrollen subtraheras från fluorescensen mätt på objektglaset inkuberas med bakterier.
  11. Objektglas kan också färgas med 20 M SYTO17 nukleinsyra färgämne (Invitrogen, Storbritannien) vid rumstemperatur i 30 minuter och avbildas med en Carl Zeiss LSM 700 laserskanning mikroskop med ZEN 2009 bildbehandlingsprogram (Carl Zeiss, Tyskland). Täckningen av bakterierpå ytan bestäms med öppen källkod Image J 1,44 mjukvara (National Institute of Health, USA).

6. Representativa resultat

Villkoren för utskrift har optimerats för att skriva ut de högsta mikroarrayer kvalitets polymer. Fuktigheten bör hållas på mellan 30-40%. Delamineringen av polymera fläckar i vattenhaltiga miljöer observerades ofta för arrayer tryckta vid en fuktighet under 30%, vilket tyder på att denna fukt är otillräcklig för att svälla PHEMA skiktet och möjliggöra för den fysiska infångningen av polymeren till substratet. Fuktigheten kan ökas ytterligare för att ändra diametern hos de polymera fläckarna, men detta beror på monomeren kemi. Till exempel, där lika volymer av polymerisationslösningen trycktes och som fukt ökades från 40 till 80% av fläckdiameter minskade från 430 ^ m till 370 | im för en monomer innehållande en hydrofil etylenglykol grupp lika volym medan den för en monomer innehållande en hydrofob alifatisk struktur kolring plats diametern ökade från 290 ^ m till 350 | im (figur 5).

Graden av polymerisation kan övervakas med användning av Raman-spektroskopi för mätning av C = C Raman skift som detekteras vid 1640 cm -1, som bör normaliseras med C = O Raman skift vid 1720 cm -1. Raman-spektra mättes för polymera fläckar polymeriserade för varierad UV-exponering (figur 6). C = C: C = O-förhållande minskade UV-exponering ökade från 0 till 50 s, varefter ingen ytterligare minskning i C = C: C = O-förhållande observerades med ytterligare UV-bestrålning (Figur 6). Raman-spektra mättes även för polymera fläckar polymeriseras vid varierande O 2 nivå och C = C-Raman-skift observerades O 2 nivån minskade till 2000 ppm, men ingen ytterligare minskning observerades för en O 2 nivå under detta (Figur 7A ). Ramanspektroskopi visade också förmågan hos vakuumextraktion sTEP att avlägsna opolymeriserad monomer. Före sugklocka C = C-Raman skift var större för polymeren polymeriserades vid 3300 ppm jämfört med 2000 ppm (figur 7A), emellertid, efter sugklocka höjden av den Raman-skiftningen är särskiljas (figur 7B), vilket antyder alla opolymeriserad monomer har avlägsnats under vakuum extraktionssteget. Sammanfattningsvis, polymerisationsbetingelser inkluderar en fuktighet av 30-40%, UV-exponering är större än 50 s vid en O 2 nivå under 2000 ppm med ett vakuum extraktionssteg efter utskrift för 7 dagar.

Efter tryckning och sugklocka framgång polymerisation av polymera fläckar kan bedömas genom en enkel ljusmikroskop för att identifiera och onormala morfologier plats. Typiskt bör fläckar cirkulär och jämn, såsom visas i figur 8 till vänster. Den troliga orsaken till en förändring i geometri är en skadad eller oren stift. För ett litet antal monomera kombinationer vi sett missbildade fläckar, för example en central plats med en satellit små fläckar, som visas i figur 8 till höger, eller ett stekt ägg form där det finns en central plats på toppen av stora plattare plats. Detta kan orsakas av fasseparation före utskrift avseende skillnader i viskositet, hydrofilicitet, flyktighet eller ytspänning av monomererna och föreslår att monomeren kombinationen inte är kompatibel med detta format. Ytterligare kemisk kartläggning av polymera fläckar av tekniker såsom ToF-SIMS är också en viktig och ibland nödvändigt kvalitetskontroll steg för att bestämma fördelningen av material "kemiska över fläckarna och matrisen. Denna teknik kan identifiera överdriven spridning av vissa material inte synliga i ljusmikroskop och identifiera fasseparation inom enskilda polymer fläckar.

Figur 1
Figur 1. Schematisk visar de olika steg som ingår i bildandet av en poLymer plats.

Figur 2
Figur 2. Schematisk av metodologin av tappen tryckning involverar initialt laddas stiftet med monomer i en källplatta och därefter avsätta monomeren på ett substrat genom att ta kontakt. Stiftet styrs av en XYZ robotarm. Den infällda bilden visar en typisk bild av autofluorescens från en array efter produktionen.

Figur 3
Figur 3. Schematisk belyser de tekniker som är förknippade med HTSC och även bioanalyser tillämpas på studiet av polymera mikromatriser.

Figur 4
Figur 4. Schematisk av den bakteriella fäste analysen.

Figur 5
Figur 5. Polymer fläckdiameter tryckt vid varierande luftfuktighet för två olika monomerer: 4-tert-butylcyklohexyl akrylat och di (etylenglykol) etyleter metakrylat.

Figur 6
Figur 6. Förhållandet mellan Raman-intensiteten för C = C-Raman skift vid 1640 cm -1 och C = O Raman skift vid 1720 cm -1 från polymera fläckar av 4-tert-butylcyklohexyl-akrylat med varierande UV-exponering. Felstaplarna motsvarar en standardavvikelse (n = 3).

Figur 7
Figur 7. Raman spektra mättes för polymera fläckar av 4-tert-butylcyklohexyl akrylat tryckt på olika O 2 våningar, anges till vänster om varje spektrum (A) före och (B) efter sugklocka. Förhållandet mellan den Raman-intensiteten för C = C-Raman skift vid 1640 cm -1 och C = O Raman skift vid 1720 cm -1

Figur 8
Figur 8. En ljusmikroskop bild av två polymer fläckar. Platsen till vänster visar en välformad plats, medan platsen till höger är ett exempel på en plats som innehåller ett mycket ojämnt fördelning av monomer. Skalan baren är 500 nm.

Discussion

Polymer microarrays har framgångsrikt använts för upptäckten av nya material genom screening hundratals nya polymeren i en biologisk analys och identifiering träff material som senare kan skalas upp till användbara enheter. I detta fall kan ytkarakterisering beskrivna användas efter den biologiska analysen och uteslutande på träff material att studera dessa material mer i detalj. Denna strategi kan vara av intresse om HTSC inte tillgänglig för experimentalist använder detta tillvägagångssätt. Men att till fullo utnyttja polymera microarrays att studera biologiskt-materiella interaktioner hela utbud av hundratals material bör analyseras innan biologiska analyser med HTSC metoder, som sedan kan användas för att följa de allmänna struktur-funktion trender.

Kontakttryckning bygger på metallstift glider upp och ned fritt inom stifthållaren. Stift och stift hållare renlighet är av största vikt är att säkerställa pUTSKRIFT sker framgångsrikt och bör noggrant genomföras. Innan en utskrift kör lämplig rörelse av tappen inuti stifthållaren kan testas genom att utföra en torrkörning, utan närvarande monomerer. Rengöring steget bör fortsätta tills stiftet rörelsen uppnås reproducerbart.

Betydande man bör gå in i utformningen av monomerblandningen. För att lätt framställa ett kombinatoriskt bibliotek av polymerer, är hundratals sampolymerer bildas genom att blanda några monomerer vid olika förhållanden. Vanligtvis producerar vi 576 medlemsländer bibliotek eftersom detta utgör en 24 x 24 matris, som är lämplig för geometri en glasskiva. För att framställa ett kombinatoriskt bibliotek som utforskar den mest kombinatoriska utrymmet den enklaste metoden är att blanda 24 monomerer parvisa vid förhållandet 2:1. Alternativt införandet av sammansättning gradienter inom arrayen är användbara för att möjliggöra iakttagelser av trender, som ger optimala monomerkompositioner att determined. Som ett exempel på detta 22 monomerer kan användas som den första komponenten i en sam-monomerblandning som sekventiellt späds med 1 av 6 andra komponenter. Om 5 utspädningar används, till exempel blandning av de första och andra komponenterna i förhållanden av 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 och 10:90, skulle detta resultera i 488 unika sampolymer lösningar. Att få den totala upp till 576, replikerar av homopolymerer av de monomerer som används kan införas, vilket ofta är en viktig referens prov. 576 monomer lösningar bör fördelas i 2 384 brunnar. För programmering av roboten är det lättare att ha två identiska plattor i termer av placeringen av monomererna, vilket bör monomerlösningar delas jämnt mellan de två plattorna.

En betydande mängd tid kan sparas i utarbetandet av källan plattorna genom användning av flerkanaliga pipetter, och utformningen av källplattor bör bestämmas för att utnyttja användningen av flerkanaliga pipetter. </ P>

För att uppnå automatiserad HTSC av uppsättningarna avistapositionen måste lyckas i linje med karakterisering apparaten. Typiskt stigningen hos en akrylat array är 500-1000 pm och polymeren fläckdiameter är 300 um. De flesta XY steg har en upplösning under 10 pm, så det finns tillräcklig tolerans för ytkarakterisering apparaten att tillförlitligt tillgång till array positionerna när rätt dimensioner har matats in till provet positionering programvara. Begränsningen av automatiserad positionering är i själva verket exakt utskrift av arrayen. För att säkerställa korrekt utskrift är det viktigt att förhindra rörelse av substratet på tryckeriet antingen genom vakuumsugning eller klämmor våren tillsammans med lämplig diabild mått (observera att både USA och EU-standard bildstorlek finns).

ToF-SIMS är en extremt yta känslig teknik som kommer att följa föroreningar på prov. Sålunda måste översta försiktighet iakttasatt undvika kontakt med ytan. Proven bör endast hanteras, men ytan av intresse inte i kontakt med, med rena handskar (företrädesvis polyeten) och med nyligen rengjorda pincetter. Vi tvättar typiskt med kloroform och hexan. Prov lagring före mätningarna görs bäst i ett prov hållare som håller glasen isär, till exempel 5 hållaren eller 20 hållare.

Uppsättningarna är utformade specifikt för att vara kompatibelt med många biologiska analysformat och avläsning, dvs, är det använda substratet en objektglas idealisk för fluorescens skannrar och ljusmikroskop. Detta innebär att formatet lämpar sig väl att utforska många material-biologiska interaktioner. Dessutom tillåter formatet hundratals material som skall screenas parallellt. Detta gör att många fler material som skall undersökas än konventionella metoder så att varje nytt material kemi screenas individuellt. Den ökade utrymmet för biologisk-materiella interaktioner kans för att klarlägga mekanismerna av biologiska ytinteraktioner, samt att finna det optimala materialet för en given tillämpning.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Finansiering från Wellcome Trust är vänligt erkänt (licensnummer 085245/Z/08/Z). Nottingham nanoteknik och nanovetenskap Centre vänligt erkänd för att ge tillgång till Raman-systemet och för East Midlands Development Agency för finansieringen av denna utrustning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy slides Genetix K2652
Contact printer Biodot XYZ3060 Platform
Metal pin ArrayIt 946MP6B
ToF-SIMS instrument ION-TOF
XPS instrument Kratos Analytical
WCA apparatus Krüss DSA 100
AFM Bruker Corporation Dimension Icon
RPMI-1640 cell culture media Sigma-Aldrich R0883
SYTO17 Invitrogen S-7579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. High throughput methods applied in biomaterial development and discovery. Biomaterials. 31, 187-198 (2010).
  2. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).
  3. Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nature Materials. 9, 768-778 (2010).
  4. Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).
  5. Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays. Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).
  6. Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. High throughput surface characterisation of a combinatorial material library. Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).
  7. Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. Picoliter water contact angle measurement on polymers. Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).
  8. Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability. Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).
  9. Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. Acrylate polymers with hydro-responsive topography. Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).
  10. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (2008).
Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).More

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter