Musen Tvingad Simma Test

Summary

De tvingas simma test valideras som en experimentell metod för att utvärdera potentiella antidepressiva effekten hos gnagare. Försöksdjur placeras i en tank med vatten och fly-relaterade rörlighet beteende är kvantifieras. Den gemensamma förfaranden för musen versionen av detta test beskrivs.

Abstract

De tvingas simma test är en gnagare beteende test som används för utvärdering av antidepressiva läkemedel, antidepressiva effekten av nya föreningar och experimentella manipulationer som syftar till att göra eller förhindra depressiva-liknande stater. Möss placeras i ett ofrånkomligt genomskinlig tank som är fylld med vatten och deras flykt relaterade rörlighet beteenden mäts. De tvingas simma testet är enkelt att göra tillförlitligt sätt och det kräver minimalt specialutrustning. Ett framgångsrikt genomförande av den påtvingade simma test kräver anslutning till vissa processuella detaljer och minimering av obefogade stress till möss. I protokollet beskrivning och tillhörande video, förklarar vi hur man genomför musen versionen av detta test med betoning på potentiella fallgropar som kan vara skadliga för tolkning av resultat och hur man undviker dem. Dessutom förklarar vi hur de beteenden visar sig i testet bedöms.

Protocol

1. Material och Metod

1,1. Vattnet tankar

Den cylindriska tankar (30 cm höjd x 20 cm diameter) som krävs för den påtvingade mus simma test (FST) i vårt laboratorium är konstruerade av transparent plexiglas, eftersom detta material kan motstå frekventa förflyttningar av stridsvagnar och olyckor bättre än glas. Vattennivån är 15 cm från botten och skall märkas på tanken att se till att den volym vatten är enhetlig i möss. Antalet tankar bör helst vara minst dubbelt så många som antalet möss testas på en gång, så att den andra vattentank som kan fyllas medan den första enheten är i bruk. Måtten på tankarna bör väljas på ett sätt som mössen inte kommer att kunna röra vid botten av tanken, antingen med fötterna eller deras svansar, under simtest. Höjden på tanken bör vara tillräckligt hög för att hindra möss från att fly från tanken. Vänligen noteraatt diametern på tanken och vattendjupet är viktiga parametrar som kan justeras för att ändra beteendet hos möss (för en detaljerad analys av dessa frågor, se ^1-3).

1,2. Termometer

En vattentät infraröd termometer är att föredra, eftersom snabb mätning av temperatur minskar den tid som krävs för att genomföra testet. Kommer dock ett glas kvicksilvertermometer också räcker för denna uppgift.

1,3. Timer

1,4. Videoinspelningsenhet

Vi använder oss av en videokamera som stöds av ett stativ. Eftersom denna test vanligtvis innebär flera djur testas samtidigt, kommer att leva scoring vara mycket svårt och är inte tillrådligt. Videokameran ska spela in i tillräckligt hög upplösning för att göra en bildkvalitet som kommer att användas senare för beteende-poäng. Se alltid till att det finns tillräckligt med inspelning minne i kameran innan Starting testet. Vi använder oss av en videokamera som registrerar digitalt utan användning av mekaniska medier (dvs videokassett), vilket möjliggör för digital överföring av video. Om det finns alltför reflektioner kring tankar, som kan uppstå i laboratoriemiljö med överliggande fluorescerande belysning, kanske du vill använda en polariserande lins filter med kameran.

1,5. Avdelare

I vårt labb har vi två uppsättningar avdelare (35 cm höjd x 22 cm bredd x 22 cm djup). Dessa är rektangulär med tre väggar och används som både bakgrund och som avdelare mellan stridsvagnar för att hindra möss från att se varandra under testet och eventuellt ändra deras beteenden. En uppsättning kan vara svart för albino och ljusa djur, det andra som kan vara ljusa för mörka djur för att göra hög kontrast. Försöksledaren bör se till att ytorna på avdelare inte är alltför reflekterande så att de ändrar kamerabilder, eller göra stora differences mellan belysning nivåer.

1,6. Vitt brus generator

Detta behövs i laboratoriemiljöer där plötsliga höga ljud kan höras som potentiellt skulle skrämma djuren. Bullret generator kommer masken sådant intermittent störande ljud. Volymen av vitt brus generator bör väljas att vara över andra omgivande och oväntade ljud. I vårt testrum den omgivande ljudnivån (utan vitt brus aktiveras generator) är 60 dB. Den totala ljudnivån med vitt brus generator aktiveras på den plats där tankarna är placerade är 70-72 dB. Det bör dock noteras att dessa siffror ges som exempel bara, och varje laboratorium bör välja rätt bullernivåer enligt deras unika miljö och omständigheter.

1,7. Torkning papper och värmelampa

Innan djuren sänds tillbaka till deras hem burar, är det viktigt att torkadem med mjukt hushållspapper och det är bra att använda en värmelampa (vara säker exponering temperaturen inte överstiger 32 ° C) för att förebygga hypotermi.

2. Behavioral Rutiner

1. Den övergripande experimentell design ska spegla ordentlig motvikt mellan variabler som är specifik för ditt experiment. Till exempel i våra experiment försöker vi att representera varje grupp lika i alla FST session (dvs om det finns fyra behandlingsgrupper kommer varje vara representerade i varje session). Även möss roteras, är sådana att möss från varje behandlingsgrupp placeras i en annan tank i varje session.
2. Placera kameran och avdelare i position. Kameran ska vara så nära som möjligt för att uppnå högsta möjliga upplösning av möss.
3. Tankarna bör fyllas med kranvatten som fastställdes vid rumstemperatur (23-25 ​​° C) till den fastställda nivån, som är utmärkt på tankens väggar. Om din anläggning inte har konstant varm / kall water, kanske du vill bereda varmvatten och / eller is för att snabbt få vattnet till rätt temperatur. Kontrollera temperaturen med IR-termometer. Alternativt, om temperaturer på varmt och kallt vatten är konstant på din anläggning kan du rita på tanken två märken - ett för nivån av varmvatten och en andra varumärket för tillsättning av kallt vatten - att komma nära den korrekta slutgiltiga vattentemperaturen snabbt.
4. Starta vitt brus generator, om det används, innan möss införs den testning rummet. Nivån av vitt brus bör endast vara tillräckligt för att maskera yttre ljud. Undvik hög volym och se till att samma nivå av vitt brus används för alla djur.
5. Ta med djur till test rummet. Om kolonin rummet där djuren bor och testning rummet ligger intill eller mycket nära varandra, de omgivande förhållandena är likartade och störningar under de rörliga av buren är minimal, då ingen acklimatisering periOD kommer att bli nödvändiga. Annars, placera djur i tester rum för en period av acklimatisering (i allmänhet minst en timme). Om en acklimatisering period är nödvändigt, se till att acklimatiserad djuren inte kommer att påverkas av möss testas samtidigt i samma rum. Observera att lukt-och ultraljud ledtrådar kan uppfattas av de andra djuren placeras i samma rum.
6. Starta videoinspelning innan du placerar djuren i vattnet tankar.
7. Håll animaliska sin svans, och sakta och försiktigt placera i vattnet. När möss är i vattnet, sakta släpper svansen. Vanligtvis kommer att använda detta förfarande förhindra att djurets huvud från att vara nedsänkt under vattnet.
8. Placera möss i tankarna i en ordning som obstruktion av inspelningen kommer att minimeras. Denna order är naturligtvis bör beslutas i samband med motverkande av grupper och andra krav specifika för din experimentell design.
9. När alla möss är i tankarna, starta nedräkningen på stoppuret. Den vanliga testar längd för möss är sex minuter i FST.
10. Under testet vara säker du är på ett rimligt avstånd från djuren och inte göra några rörelser eller brus som kan märkas av djuren. Möss kan lätt flyta i vatten, men om antingen en ny stam av möss eller en ny förening som testas utan tidigare kunskap om deras effekt på simning beteende, bör försöksledaren övervaka djuren närmare. I motsats till råttor, inte möss normalt inte dyka under FST, men i händelse av dykning på musen bör tas bort från tanken. Om experimentatorn lämnar rummet mössen bör övervakas av video i händelse av att en mus inte kan upprätthålla simning och flytande beteende och för att stoppa testet om det behövs.
11. Vid slutet av sex minuter testperioden stoppa inspelningen. I vårt labb, visar vi en anteckning i framför kameran som identifierar djuren i slutetför varje inspelning. När du använder denna metod den enskilde därefter poäng inspelningen inte vet identiteten av djuren eftersom identiteten visas endast i slutet av inspelningen. Detta förhindrar identifiering och registrering problem som kan uppstå senare i samband med inspelningarna. Oavsett vilken registrering strategi som används, bör det tydligt identifiera djuren och även förhindra den enskilde senare poäng testet från att ha kunskap om grupparbeten.
12. Ta bort djur från vattnet genom sina svansar i samma ordning som du lägger dem i och försiktigt torka dem med en torkning av papper och placera tillbaka till sina homecage.

3. Beteende Analys

1. Musen version av FST är normalt, från början till slut, sex minuter lång. Men i allmänhet bara de sista fyra minuterna av testet analyseras. Detta beror på att de flesta möss är mycket aktiva i början av FST, och Potential effekterna av behandlingen kan skymmas under de första två minuterna.
2. I vårt laboratorium har vi ladda upp videofiler direkt från kameran till en dator och göra en analys på datorn.
3. Under beteendeanalys, är den tid som varje möss spenderar mobil mätas. Den totala mängden mobilitet tid sedan subtraheras från 240 sekunder av testtiden och sedan anges som orörlighet tiden. Även om det är möjligt att mäta orörlighet tid direkt, i vårt laboratorium har vi funnit det lättare att upptäcka och mäta aktiva rörelser snarare än brist på sådana rörelser.
4. Den viktigaste aspekten av beteendeanalys och oftast den största källan till variation mellan observatörer i FST är korrekt identifiering av rörelser som räknas som god tro rörlighet. Vår operativ definition av rörlighet i FST är alla rörelser än vad som krävs för att balansera kroppen och hålla huvudet ovanför vattnet ⁴. Möss flyta i allmänhet i vatten lätt, men de fortfarande uppenbara små rörelser för att balansera sina kroppar och hålla huvudet ovanför vattnet. Dessa beteenden är inte ett försök att fly och ska inte protokollföras som rörlighet. Dessutom, efter en våg av rörlighet, trots huvudsak orörlig, kan möss driva fortfarande i vattnet som en följd av fart. Dessa rörelser ska inte heller protokollföras som rörlighet.
5. I vårt laboratorium använder vi en on-screen stoppur programvara (XNote Stoppur, dnSoft Research Group) för tid mätningar. Två separata stoppur används på skärmen. Den första stoppur räknar ner från 240 sekunder och varnar observatör när beteendeanalys är slut. Det andra stoppuret mäter tid mobil. Vissa stoppur mjukvara har möjlighet att överlåta nycklar att starta och stoppa funktioner, så att på skärmen stoppur kan styras av tangentbordet. I vårt labb, i stället för ett vanligt tangentbord, använder vi en inmatningsenhet som allmänt kallasen "gamepad" att kontrollera stoppur.
6. När du använder en dator för att kvantifiera orörlighet, om det finns mer än en mus testas och som finns på skärmen är det en bra idé att täcka andra djur (du kan använda ett annat program fönster eller fysiskt täcka skärmen med papper), så att deras rörelser kommer inte att distrahera betraktaren.
7. Om en på skärmen stoppur används, vara säker på att täcka alla men millisekund decimaler av stoppuret. Anledningen till detta är att förhindra bias i betraktaren, samtidigt tillåta möjligheten att avgöra om klockan är igång eller inte igång. Sedan observatör, medan blinda för den grupp uppdrag av djuren kommer att ha en allmän uppfattning om graden av rörlighet i möss, kan det finnas fördomar uppstår om hon får se den totala rörligheten tid förflutit för just denna mus före slutförandet av analysen sessionen. Genom att täcka stoppuret kommer hon vet bara om stoppuret är på eller av vid någon punkt, men tilJag vet inte den totala tid som förflutit och kan därför inte ske genom någon bias.
8. En inter-observatör tillförlitlighet prov bör utföras för varje ny observatör innan man börjar samla in data från försöksdjur. I vårt laboratorium, klockor varje ny observatör först en erfaren observatör scoring. Efter ny observatör vinner förtroende att skilja rörlighet från orörlighet, poäng de sedan med erfarna betraktare att titta på och peka ut eventuella misstag. När denna fas är avslutad kommer den nya observatör analysera en specifik uppsättning FST videor som vi håller i vårt laboratorium i utbildningssyfte. Först efter en hög grad av inter-observatör korrelation erhålls med erfaren observatör gör en utredare börja analysera FST videor i verkliga experiment. Vi arkivera data från dessa utbildning analyser att utgöra en intern standard för laboratoriet för framtida bruk. Vi har sett skillnader mellan stammar i det sätt på vilket de uttrycker Mobility (och orörlighet) beteenden och menar orörlighet tid mellan könen. När en ny stam, kön eller genförändrad mus modell testas i laboratoriet är det nödvändigt att återigen göra den här typen av tillförlitlighet analys.

4. Representativa resultat

Det finns markanta skillnader mellan genetiskt distinkta inavlade och utavlat musstammar i termer av deras baslinje orörlighet och svara på en viss medicin ^5-11. Till exempel identifierade vi differential antidepressivliknande svar på litium i en panel av mus-stammar (Figur 1) ^5. Experimentell detaljerna i detta experiment publiceras i Can et al. 2011 ^5.

Figur 1. Orörlighet tid (i sekunder) i den påtvingade simma test, fem timmar efter en enda IP injektion av saltlösning, 200, 300 eller 400 mg / kg i olika inavlade och OUtbred musstammar. *: P <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001 beteckna en betydande skillnad jämfört med saltlösning grupp Dunnetts post hoc test. Uppgifterna är uttryckta som medelvärde ± SEM. Antal djur per grupp för varje stam är 6-8 (figur återges av ^5).

Inte alla musstammar är lämpliga för FST. Vissa stammar, såsom Black schweiziska, NIH schweiziska och FVB / NJ visar liten eller nästan ingen orörlighet under kontroll förutsättningar och att därmed utgör ett golv effekt (Figur 1) ^5. Bristen på baslinjen orörlighet förhindrar effektivt att upptäcka en anti-depressiv effekt av experimentella manipulationer. Det är också möjligt, men mycket sällsynt, att vissa mus stammar kan uppföra sig abnormt och dyka i tanken under testet trots att de kan flyta. En sådan stam är DBA/1OlaHsd (opublicerad observation i vårt laboratorium). Sådana stammar är inte lämpliga för FST. På grund av detta dykning risk, men small, vid provning av en ny stam som inte har tidigare testats i FST eller en mus hyser en roman genetisk manipulation är det absolut nödvändigt att noga följa de första försöken att rädda möss om de bedriver potentiellt skadliga beteenden.

I experimentell design som beskrivs här, flera djur (upp till fem) testas på samma gång. Medan avdelare vi använder hindra möss från att se varandra under testet, och vitt brus generator undertrycker hörbara läten, hindrar vår inställning inte alla ultraljud eller lukt signaler från överförs. Även osannolik tanke på den typ av testet kan dessa påverka beteenden hos möss. En lösning på detta problem skulle vara att testa djuren individuellt. Dock har denna metod sina egna problem. Till exempel brukar det djur som testats i varje session kommer från samma homecage. Detta gör att randomisering och motverkande av den experimentella variabler. Testa möss enskildaly skulle innebära att ta bort en mus i taget från homecage. Detta kommer att orsaka upprepade stress och störningar av social hierarki i buren bland de andra lämnat efter sig. En annan fråga med testning är ensamma på tidsbrist. Testa en mus i taget kommer att förlänga försöket i många timmar vilket resulterar i en situation där möss testas vid olika tidpunkter av dygnsrytm cykel. Detta kan skapa störande tid på dygnet effekter. Forskarna bör hålla dessa frågor i åtanke när de utformar sina experiment.

Discussion

FST (som ibland kallas Porsolt simma test) utvecklades först för råttor och sedan modifierats för möss med Porsolt och kollegor ^12,13. Förutom de ovan beskrivna protokoll framgångsrika i vårt laboratorium, har ett antal till stor del subtila testa ändringar har publicerats (se Hascoët och Bourin för en komplett recension ^1). Det är ett vanligt test som används för utvärdering av effekten av antidepressiva läkemedel och effekterna av olika beteenden och neurobiologiska manipulationer inom grundforskning och preklinisk forskning ^3,14-16. Det har beskrivits som gör en situation där "beteende förtvivlan" är inducerad, det vill säga förlorar djuret hoppas att fly den stressiga miljön ^13. Musen version av tvingas simma test är en relativt kort och låg kostnad beteendemässiga test som inte kräver någon utbildning av möss och kan utföras med minimal utrustning. Detta står i kontrast till råttan versionen av testet, som i allmänhet innebärexponering till vattentanken en dag före testet dag ^17.

På grund av dess popularitet finns det en mängd data om effekterna av olika antidepressiva läkemedel i FST. Detta tillåter forskare att jämföra sina egna resultat med andra (se Hascoët och Bourin för 2009 granska ^1). Dessa egenskaper FST gör den till ett viktigt verktyg inom akademisk forskning och läkemedelsutveckling i industriella miljöer där tillförlitlighet och hög throughput screening av nya föreningar är viktiga. Ett annat inslag i FST är tillgången på kommersiella automatiserade system beteendeanalys som kan påskynda insamlingen av uppgifter ^18-20. Men i vår erfarenhet, dessa automatiserade system kräver omfattande validering av mänskliga poäng. Dessutom kan automatiserade parametrar behöva justeras vid användning av olika stammar, speciellt när nivån av förändringar bakgrund kontrast, eller med möss av olika sizes eller beteendemässiga.

Ett annat område där FST används är neurogenetiska forskning i vilken den genetiska grunden för depressionsrelaterade beteenden undersöks. Dessa typer av studier innebär jämförelse av olika musstammar med eller utan användning av antidepressiva läkemedel och jämförelser av genetiskt modifierade eller selektivt fötts upp möss och deras vilda motsvarigheter typ ^6,21-23. I detta sammanhang har FST visat sig vara användbart i grundforskning relaterad till neurobiologi och genetik av affektiva störningar. Är dock FST inte ett fullt spektrum analog mänskliga depression. Även om det finns undantag, har FST en betydande nivå av prediktiv validitet, eftersom det är någorlunda känslig för föreningar som är effektiva på människor som anti-depressiva och okänsliga för de som inte är effektiva ^24,25. Sedan beteende resultatet av FST är endimensionella den kan bara ange antidepressiva effekten av sammansatta eller exexperimentell manipulation, men det kan inte skilja mekanistiska skillnader mellan dem. Detta står i kontrast med råttan versionen av FST, där råttor uppenbara både simning och klättring beteenden som kan skilja mellan serotonin och noradrenalin agerar föreningar ^26. Även eventuella manipulationer som kan påverka den totala aktiviteten skulle kunna förändra orörlighet i FST leder till falska slutsatser. Därför är det viktigt att kontrollera resultaten av FST med separata beteendevetenskaplig tester som mäter totala aktivitet, t.ex. friland testa ^1,27. Det är bra att hålla i minnet att FST inte representerar människans villkor, och omfattning som underliggande neurobiologiska mekanismer beteenden visar sig i modell djur i FST och mänskliga depression överlappar varandra är inte helt klar ^28. Dock bör dessa typer av begränsningar devalvera inte nyttan av FST som läkemedelsutveckling och validering verktyg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water tanks
Thermometer
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Drying Paper