Эта работа подробно подготовки 3D фибрина лесов для культивирования и дифференциации plutipotent стволовых клеток. Такие леса могут быть использованы для скрининга влияние различных биологических соединений на поведение стволовых клеток, а также изменение содержать систем доставки лекарств.
Стволовые клетки находятся в естественных 3D микросреды в естественных условиях, которые часто называют ниши стволовых клеток 1. Культивирование стволовых клеток в 3D-биоматериала лесов дает возможность точно имитировать эти микросреды, обеспечивающие преимущество по сравнению с традиционными методами 2D культуры с помощью полистирола, а также метод для инженерных замена ткани 2. В то время как 2D polystrene культуры ткани была использована для большинства экспериментов клеточных культур, 3D биоматериала лесов может более тесно повторить микросреды обнаружены в естественных условиях, обеспечивая более точное создание клеточной полярности в окружающей среде и обладающих биохимической и механическим свойствам похож на мягкую ткань. 3 различных естественно получены и синтетические леса биоматериал был исследован в качестве 3D-среды для поддержки роста стволовых клеток. В то время как синтетические строительные леса могут быть синтезированы иметь большее тАнж механических и химических свойств, и часто имеют большую воспроизводимость, природных биоматериалов часто состоят из белков и полисахаридов найден в матрице extracelluar и, как следствие содержат сайты связывания для клеточной адгезии и легко поддерживать культуру клеток. Фибрин леса, производится путем полимеризации белка фибриногена полученных из плазмы, были широко исследованы различные ткани инженерных приложений, как в пробирке и в естественных 4. Такие леса могут быть изменены с помощью различных методов включения управляемых систем выпуска для доставки лечебных факторов 5. Предыдущие исследования показали, что такие леса могут быть использованы для успешной культуры эмбриональных стволовых клеток, и это леса на основе культуры система может быть использована для скрининга влияния различных факторов роста на дифференциацию стволовых клеток высевали в 6,7.
Этот протокол детали процесса polymerizinг фибрина из фибриногена леса решений с использованием ферментативной активности тромбина. Процесс занимает от 2 дней до завершения, в том числе ночью шаг диализа для фибриногена решение удалить цитраты, которые препятствуют полимеризации. Эти подробные методы основаны на концентрации фибриногена установлено, что оптимальным для эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток культуры. Другие группы дальнейшего изучения фибрина лесов для широкого спектра типов клеток и приложений – демонстрация универсальности этого подхода 8-12.
Этот протокол обеспечивает описанные выше метод для создания 3D леса фибрин для плюрипотентных стволовых клеток культуры, в частности, для мышиных эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Эта 3D биоматериала на основе системы культуры более точно имитирует ниша…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность NSERC Discovery Грант 402462 "Tissue инженерных леса для управления индуцированных плюрипотентных стволовых клеток поведение".
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
Thrombin (human) | Sigma | T7009 |