Summary
تفاصيل هذا العمل في إعداد الليفين 3D الاطر لزراعة الخلايا الجذعية والتمييز plutipotent. ويمكن استخدام مثل هذه السقالات لفحص آثار المركبات البيولوجية المختلفة على سلوك الخلايا الجذعية كذلك بصيغته المعدلة لاحتواء نظم لتقديم الأدوية.
Abstract
تم العثور على خلايا جذعية في طبيعيا microenvironments 3D في الجسم الحي، والتي غالبا ما يشار الى جذع الخلية المتخصصة 1. زراعة الخلايا الجذعية داخل السقالات مادة بيولوجية 3D يوفر وسيلة لتحاكي بدقة هذه microenvironments، وتوفير ميزة على الطرق التقليدية لثقافة 2D باستخدام البوليسترين، فضلا عن طريقة لاستبدال الأنسجة الهندسة 2. في حين تم استخدام 2D polystrene زراعة الأنسجة لغالبية تجارب زراعة الخلايا، ويمكن 3D السقالات مادة بيولوجية عن كثب تكرار microenvironments وجدت في الجسم الحي من خلال تمكين إنشاء أكثر دقة للقطبية الخلية في البيئة والتي تمتلك الخصائص البيوكيميائية والميكانيكية مماثلة إلى الأنسجة اللينة. (3) ومجموعة متنوعة من مشتقة بشكل طبيعي وجرى التحقيق الاصطناعية السقالات مادة بيولوجية كما بيئات 3D لدعم نمو الخلايا الجذعية. بينما يمكن توليفها السقالات الاصطناعية لديها أكبر Rأنج من الخواص الميكانيكية والكيميائية وغالبا ما يكون أكبر استنساخ، وتتكون غالبا الحيوية الطبيعية من البروتينات والسكريات الموجودة في مصفوفة extracelluar ونتيجة لذلك تحتوي على مواقع الربط للالتصاق الخلايا ودعم ثقافة الخلية بسهولة. وقد تم الليفين السقالات، التي تنتجها البلمره والفيبرينوجين بروتين تم الحصول عليها من البلازما، والتحقيق فيها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من تطبيقات هندسة الأنسجة على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 4. ويمكن تعديل هذه السقالات باستخدام مجموعة متنوعة من وسائل لدمج أنظمة إطلاق للرقابة لتوفير العوامل العلاجية 5. وقد أظهرت الأعمال السابقة التي يمكن أن تستخدم مثل هذه السقالات للخلايا الجذعية الجنينية ثقافة بنجاح، ويمكن استخدامها لهذا النظام القائم على ثقافة سقالة لفحص الآثار المترتبة على عوامل النمو المختلفة على تمايز الخلايا الجذعية داخل المصنف 6،7.
هذه تفاصيل بروتوكول عملية polymerizinز الليفين السقالات من الحلول الفيزيولوجية باستخدام النشاط الأنزيمي من ثرومبين. تستغرق العملية 2 أيام لاستكمال، بما في ذلك خطوة لغسيل الكلى بين عشية وضحاها من أجل حل الفيزيولوجية لإزالة citrates التي تمنع البلمرة. هذه الأساليب مفصلة تعتمد على تركيز الفيبرينوجين مصممة على أن تكون الأمثل لالجنينية الجذعية المحفزة التي يسببها وثقافة الخلية. حققت الجماعات الأخرى مزيد من السقالات الليفين لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتطبيقات - مما يدل على براعة هذا النهج 8-12.
Protocol
ملاحظات قبل البدء في البروتوكول: الفبرينوجين هو بروتين الدم المشتقة ويجب أن تكتمل المناسبة وبالتالي التدريب على السلامة قبل المناولة. هذا البروتوكول يتطلب 2 أيام لاستكمال ذلك الوقت الثقافات الجذعية المطلوبة بشكل مناسب للتأكد من أنهم على استعداد للبذار. من ناحية حساب مقدار الفيزيولوجية لوزن خارج، وثلاثة أطباق بتري 35 ملم من تريس مخزنة المالحة (TBS، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 110-130 ملغ من الفيبرينوجين حل في 3 مل من TBS ستكون كافية لانتاج 1 24 لوحة تحتوي على 400 جيد السقالات الليفين ميكرولتر في كل بئر.
1. يوم واحد: جعل الحلول الفيزيولوجية وغسيل الكلى بين عشية وضحاها
- أخذ الفيزيولوجية مجفف بالتجميد من الثلاجة واتركه لمدة 20 دقيقة للسماح له أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
- مخزنة أضف 3 مل من تريس المالحة (TBS) إلى كل طبق بيتري 35 مم. كل لوحة من غلة الفيزيولوجية 2-3 مل من محلول الفيزيولوجية التي تتراوح في تركيز 12-20ويمكن حساب ملغ / مل، وبلغ مجموع الفيزيولوجية اللازمة بناء على هذه تقريبية.
- تزن حوالي 100-130 خارج الفيزيولوجية ملغ (FG) وترش على سطح الحاضر TBS في كل طبق. انتظر 5 دقائق للالفيزيولوجية للبدء في الخوض في حل. تغطية صحن بيتري مع غطاء.
- احتضان أطباق بتري في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للالفيزيولوجية للذهاب بشكل كامل في حل TBS.
- الرطب أنابيب غسيل الكلى (7000 ميغاواط قطع) مع TBS. أضعاف نهاية الجزء السفلي من نهاية الأنابيب وأغلقت المشبك مع المشبك لغسيل الكلى.
- ماصة للحلول الفيزيولوجية من أطباق في أنابيب غسيل الكلى. أضعاف خلال نهاية أعلى ومشبك اغلاق مع المشبك لغسيل الكلى.
- مكان أنابيب غسيل الكلى التي تحتوي على حل الفيزيولوجية في وعاء 4 لتر من TBS. حل المزيج باستخدام لوحة ضجة لتعيين سرعة منخفضة (100 دورة في الدقيقة).
- Dialyze حل بين عشية وضحاها على إثارة لوحة ما لا يقل عن 12 ساعة. الحل TBS لا تحتاج إلى أن تتغير خلال هذه الفترة الزمنية. 2. يوم 2: البلمرة من السقالات الليفين والبذر للخلايا الجذعية في السقالات
- إزالة حل الفيزيولوجية من أنابيب غسيل الكلى ومكان الى انبوب مخروطي الشكل المناسب الحجم (إما 15 مل أو 50 مل).
- مرشح حل الفيزيولوجية مع فلتر ميكرون حقنة 5.0 لإزالة الشوائب الكبيرة في الحل. اعتمادا على حجم من الحل، قد استخدام فلاتر متعددة تكون ضرورية لمعالجة حل كامل.
- مرشح العقيمة الحل الفيزيولوجية مع 0.22 ميكرون مرشح في أنبوب 50mL مخروطي. باستخدام ماصة الحجم المناسب، وتحديد حجم من الحل الفيزيولوجية التي تمت تصفيتها لاستخدامها لاحقا عند القيام الحسابات. اعتمادا على حجم من الحل، قد استخدام فلاتر متعددة تكون ضرورية لمعالجة الأنف والحنجرةغضب حل.
- قياس الامتصاصية من الحل الفيزيولوجية عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف. وثمة عامل تخفيف من 50 غالبا ما يكون ضروريا للحصول على امتصاص أقل من 1.
- حساب تركيز بروتين موجود في حل الفيزيولوجية باستخدام المعادلة التالية: [الفبرينوجين في ملغ / مل] = (280 × عامل تخفيف) ÷ 1،55 1،55 حيث هي معامل الانقراض في 280 لالفيزيولوجية الإنسان 13. حساب القادم من كمية TBS اللازمة لتخفيف تركيز المحلول إلى 11.1 ملغ / مل من الفيبرينوجين على أساس حجم الأولي. وسوف تركز النهائي من البروتين في السقالات الليفين أن يكون 10 ملغ / مل بعد البلمرة.
- الحصول على ثرومبين معقمة وحلول كلوريد الكالسيوم. أولا، إضافة 15 حل ثرومبين ميكرولتر (تركيز: 40 يو / مل - تركيز نهائي في سقالة سيكون يو 2 / مل) على الجانب الأيمن من كل بئر في الصف الأول من لوحة 24 أيضا. المقبل، إضافة 15 ميكرولتر من 50 CHL الكالسيوم مليحل oride إلى الجانب الأيسر من كل بئر. أخيرا، أضف 270 ميكروليتر من الحل الفيزيولوجية للصفيحة. هزة لوحة من جانب إلى آخر تليها تهز الخلف إلى الأمام لضمان اختلاط الحلول.
- اسمحوا الصف الذي يحتوي على خليط تتبلمر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. والسقالات أصبح أكثر غموضا لأنها تتبلمر.
- كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 حتى يتم بلمرة العدد المرغوب فيه من السقالات الليفين.
- بعد حضانة آخر 5 دقائق، ووضع لوحات من داخل الحاضنة 37 درجة مئوية للسماح للبلمرة كاملة من السقالات.
- بعد حضانة مدة ساعة واحدة كاملة، فإن الخطوة التالية هي البذور السقالة مع الهيئات مضغي الشكل. باستخدام pipettemen 20 ميكرولتر، حدد هيئة مضغي الشكل الفردي ومكان في وسط سقالة الليفين. تحقق مع مجهر أن كل بئر يحتوي على جثة مضغي الشكل واحد.
- إضافة 5 ميكرولتر من محلول الثرومبين (تركيز: 40 يو / مل) و 5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 50 مليحل على رأس كل هيئة مضغي الشكل تليها 90 ميكرولتر من حل الفيزيولوجية إلى كل بئر. وينبغي أن الحل تشكيل فقاعة التغليف الهيئات مضغي الشكل.
- لوحة مكان الظهر في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة ساعة إضافية لضمان البلمرة.
- بعد مرور فترة الحضانة، إضافة 1 مل من وسائل الإعلام خلية ثقافة المناسبة لكل لوحة بشكل جيد ومكان العودة الى 37 درجة مئوية الحاضنة.
يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات الموضحة لهذه العملية في غطاء محرك السيارة الأنسجة ثقافة عقيمة كما سيتم المصنف هذه الاطر مع الثقافات الخلايا الجذعية.
3. ممثل النتائج
ويظهر الشكل 1 التخطيطي لعرض الجانب للفرد تحتوي أيضا على ثقافة 3D سقالة الليفين نظام المصنف مع هيئة مضغي الشكل. الشكل 2A معارض الصور ممثل الناجمة الماوس الخلايا الجذعية المحفزة التي يجري تربيتها في الطبقات الجنينية الماوس تغذية الخلايا الليفية. وبفعل هذه الخلايا بعد ذلك لتشكيل هيئات مضغي الشكل، مجاميع من الخلايا التي تحتوي على الأسلاف العصبية، وذلك باستخدام 8 يوم علاج حمض الريتينويك بروتوكول (الشكل 2B) كما previouslووصف ص 14 في حين يبين الشكل 3 مظهر من هيئة IPS-المستمدة مضغي الشكل بعد 3 أيام من داخل الثقافة من السقالات الليفين 3D. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة في السابق باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية 7. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب للثقافة IPS-المستمدة الهيئات مضغي الشكل المنتجة باستخدام بروتوكول المختلفة التي تنطوي على حمض الريتينويك وpurmorphamine 15 من داخل السقالات الليفين 3D، مما يدل على براعة هذا النظام ثقافة.
الشكل 1. تخطيطي يظهر منظر جانبي للفرد التي تحتوي على بئر الليفين 3D سقالة المصنف مع هيئة مضغي الشكل.
الشكل 2. فأر الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) زراعة الخلايا وتمايزها. لتمييز هذه الخلايا إلى neurالظواهر القاعدة ويتم استزراع خلايا الجذع في تعليق لإنتاج الركام من خلايا تسمى الهيئات مضغي الشكل (EBS). ثم يتم التعامل مع هذه EBS مع حمض الريتينويك للحث على تمايز العصبية، وكان يستخدم سابقا هذا البروتوكول للحث على تمايز العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية. أ) خلية غير مميزة الجذع مستعمرة الماوس مثقف على ماوس الجنينية الليفية طبقة المغذية. ب) الهيئات مضغي الشكل مشتقة من خلايا الجذع فأر في الثقافة تعليق اتخذت يوم 8 بعد العلاج مع حمض الريتينويك للحث على تمايز العصبية. شريط المقياس 100 ميكرون.
مضغي الشكل النتائج مثال الشكل 3. من الجذع الماوس الجسم بعد 3 أيام من ثقافة من داخل سقالة الليفين 3D. وبدأت الخلايا على الهجرة وتفرق داخل سقالة الليفين. شريط الحجم هو 500 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول المفصلة أعلاه يوفر طريقة لتوليد 3D السقالات الليفين للالجذعية المحفزة ثقافة الخلية، وتحديدا لالجنينية الماوس والناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة. هذه مادة بيولوجية 3D نظام يستند إلى ثقافة أكثر دقة يقلد محراب الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم الحي، ونتيجة لذلك، يمكن استخدامه لفحص الاشارات البيولوجية لتحديد آثارها على تمايز الخلايا الجذعية 6. وقد أظهرت ملاحظاتنا أن هذه السقالات عندما المصنف مع الخلايا الجذعية المشتقة الهيئات مضغي الشكل تبقى لمدة 2 اسابيع في المختبر قبل ان تصبح متدهورة تماما. وذلك لزيادة استقرار هذه السقالات، ويمكن استخدام أبروتينين (مثبط البروتياز) لإبطاء التدهور من خلال إضافة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية. 7،16 هذه السقالات كما تم استخدامه بنجاح لالعصبية تطبيقات هندسة الأنسجة، وتحديدا جيل من الأنسجة مماثلة لتلك التي وجدت في 17 الجهاز العصبي المركزي. بينما غرام غيرهاoups تضافرت مع الجذع خلايا الغراء الليفين لعلاج السكتة الدماغية 18، هذا العمل يمثل أول تقرير معروف من الجمع بين خلايا الجذع مع السقالات الليفين للتطبيقات هندسة الأنسجة العصبية. هذا العمل أيضا بمثابة نقطة انطلاق لتجمع بين مجموعة من أنواع الخلايا الجذعية مع السقالات الليفين عن غيرها من تطبيقات هندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب يود أن يقر NSERC ديسكفري جرانت 402462 "السقالات الأنسجة المهندسة لمراقبة السلوك الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
