Summary
Dette arbeidet detaljer utarbeidelse av 3D fibrin stillasene for dyrkning og differensierende plutipotent stamceller. Slike stillasene kan brukes til å screene effekten av ulike biologiske forbindelser på stamcelleforskningen atferd samt modifisert for å inneholde stoffet leveringssystemer.
Abstract
Stamceller finnes i naturlig forekommende 3D microenvironments in vivo, som ofte omtales som stamcelleforskningen nisje en. Dyrkning stamceller innsiden av 3D biomateriale stillasene gir en måte å nøyaktig etterligne disse microenvironments, som gir en fordel fremfor tradisjonelle 2D kultur metoder ved hjelp av isopor, samt en metode for ingeniør erstatning vev 2. Mens 2D vevskultur polystrene har vært brukt for de fleste av cellekultur eksperimenter, kan 3D biomateriale stillasene nærmere gjenskape microenvironments funnet i vivo ved at mer nøyaktig etablering av celle polaritet i miljøet og er i besittelse biokjemiske og mekaniske egenskaper som ligner på mykt vev. 3 Et utvalg av naturlig utvunnet og syntetiske biomateriale stillasene har blitt etterforsket som 3D-miljøer som støtter stamcelleforskningen vekst. Mens syntetiske stillasene kan syntetiseres å ha en større range av mekaniske og kjemiske egenskaper og ofte har større reproduserbarhet, er naturlige biomaterialer ofte sammensatt av proteiner og polysakkarider som finnes i ekstracellulære matrix og som et resultat inneholde bindingssteder for celle adhesjon og lett støtte cellekultur. Fibrin stillasene, produsert av polymerizing proteinet fibrinogen fremstilt fra plasma, har vært mye undersøkt for en rekke av tissue engineering programmer både in vitro og in vivo 4. Slike stillasene kan endres ved hjelp av en rekke metoder for å innlemme kontrollert frisetting systemer for å levere terapeutiske faktorer 5. Tidligere arbeid har vist at slike stillasene kan brukes til å lykkes kultur embryonale stamceller og dette stillaset-baserte kultur systemet kan brukes til å screene effekten av ulike vekstfaktorer om differensiering av stamceller seeded inne 6,7.
Denne protokollen beskriver prosessen med polymerizing fibrin stillasene fra fibrinogen løsninger ved hjelp av enzymatisk aktivitet av trombin. Prosessen tar 2 dager å fullføre, inkludert en overnatting dialyse steg for fibrinogen løsningen for å fjerne Citrates som hemmer polymerisering. Disse detaljerte metoder avhengige av fibrinogen konsentrasjoner bestemt på å være optimal for embryo-og indusert pluripotent stamcelle kultur. Andre grupper har videre undersøkt fibrin stillasene for et bredt spekter av celletyper og applikasjoner - demonstrere allsidigheten til denne tilnærmingen 8-12.
Protocol
Notater før start protokollen: Fibrinogen er en blod avledet protein og dermed passende sikkerhetsopplæring må være fullført før håndtering. Denne protokollen krever 2 dager å fullføre så tiden de ønskede stamceller kulturer hensiktsmessig å sikre at de er klare for seeding. I forhold til hvor mye fibrinogen til veie ut, tre 35 mm petriskåler av tris saltløsning (TBS, 7,4 pH) som inneholder 110-130 mg fibrinogen oppløst i 3 mL TBS vil være tilstrekkelig til å produsere en 24 vel plate som inneholder 400 mL fibrin stillasene i hver brønn.
1. Day One: Making fibrinogen løsninger og natten dialyse
- Ta lyofilisert fibrinogen ut av kjøleskapet og la den sitte i 20 minutter for å la den få romtemperatur.
- Legg 3 mL Tris saltløsning (TBS) til hver 35 mm petriskål. Hver plate av fibrinogen gir 2-3 ml av fibrinogen løsning varierer i konsentrasjon 12-20mg / ml og den totale mengden av fibrinogen nødvendig kan beregnes basert på disse tilnærmelser.
- Vei ut ca 100-130 mg fibrinogen (FG) og dryss på overflaten av TBS stede i hver rett. Vent 5 minutter til fibrinogen å begynne å gå inn i løsningen. Dekk petriskål med lokk.
- Inkuber petriskåler ved 37 ° C i 2 timer å la fibrinogen til fullt gå inn i TBS løsningen.
- Våt dialyse tubing (7000 MW kuttet) med TBS. Brett den nederste enden av slangen og klemme enden lukket med en dialyse klemme.
- Pipettering de fibrinogen løsninger fra servise i dialyse tubing. Brett over toppen enden og klemme igjen med et dialyse klemme.
- Place dialyse tubing inneholder fibrinogen løsning i en 4 liters beholder med TBS. Bland løsningen ved hjelp av bevegelse plate satt til lav hastighet (100 rpm).
- Dialyser løsning over natten på rør plate i minst 12 timer. Den TBS løsningen trenger ikke å endres over denne tidsperioden. 2. Dag 2: polymerisering av fibrin stillasene og såing av stamceller inn i stillaser
- Fjern fibrinogen løsning fra dialyse rør og sted inn i en passende størrelse konisk tube (enten 15 ml eller 50 ml).
- Filter fibrinogen løsning med en 5,0 mikrometer sprøyte filter for å fjerne store urenheter i løsningen. Avhengig av volumet av løsningen, kan bruken av flere filtere være nødvendig å behandle hele løsningen.
- Sterile filteret fibrinogen løsning med en 0,22 mikrometer filteret i en 50ml konisk tube. Bruk en passende størrelse pipette, bestemme volumet av det filtrerte fibrinogen løsningen å bruke senere når du gjør beregninger. Avhengig av volumet av løsningen, kan bruken av flere filtere være nødvendig å behandle entire løsning.
- Mål absorbansen av fibrinogen løsningen på 280 nm ved hjelp av spektrofotometer. En fortynningsfaktoren av 50 er ofte nødvendig for å oppnå en absorbans under 1.
- Beregn konsentrasjonen av protein som finnes i fibrinogen løsningen ved hjelp av følgende ligning: [Fibrinogen i mg / ml] = (A 280 × fortynningsfaktoren) ÷ 1,55, der 1,55 er utryddelse koeffisient på A 280 for human fibrinogen 13. Neste beregne mengden av TBS nødvendig for å fortynne konsentrasjonen av løsningen til 11,1 mg / ml av fibrinogen basert på den opprinnelige volum. Den endelige konsentrasjonen av protein i fibrin stillasene vil være 10 mg / ml etter polymerisasjon.
- Skaff steril trombin og Kalsiumklorid løsninger. Først legger 15 mL trombin løsning (konsentrasjon: 40 U / ml - endelig konsentrasjon på stillas vil være 2 U / ml) til høyre side av hver brønn i den første raden i 24 brønnen plate. Deretter tilsettes 15 mL av 50 mM kalsium CHLoride løsning til venstre side av hver brønn. Til slutt legger 270 mL av fibrinogen løsningen til plate. Rist plate fra side til side etterfulgt av risting tilbake til fronten for å sikre blanding av løsninger.
- La raden som inneholder blandinger polymerisere i 5 minutter ved romtemperatur. Stillasene blir mer gjennomsiktig som de Polymeriserer.
- Gjenta trinn 2.6 og 2.7 til ønsket antall av fibrin Stillasene er polymerisert.
- Etter siste fem minutt inkubering, plasserer platene innsiden av en 37 ° C inkubator for å tillate fullstendig polymerisasjon av stillaser.
- Etter en times inkubasjon er fullført, er neste skritt å frø stillaset med embryoid organer. Bruke en 20 mL pipettemen, velger en individuell embryoid kropp og plass i sentrum av fibrin stillaset. Sjekk med mikroskop som hver brønn inneholder en enkelt embryoid kropp.
- Tilsett 5 mL av trombin-løsning (konsentrasjon: 40 U / ml) og 5 mL av 50 mM kalsiumkloridløsning på toppen av hver embryoid kroppen etterfulgt av 90 mL av fibrinogen løsning til hver brønn. Løsningen bør danne en boble innkapsle de embryoid organer.
- Sett platen tilbake i 37 ° C inkubator for en ekstra time for å sikre polymerisasjon.
- Etter inkubering, tilsett 1 mL av de aktuelle cellekultur media til hver brønn og sted plate tilbake i 37 ° C inkubator.
Alle trinnene beskrevet for denne prosessen skal utføres i et sterilt vev kultur hetten som disse stillasene vil bli seedet med stilk cellekulturer.
3. Representative Resultater
Figur 1 viser en skjematisk av side view av en enkelt brønn som inneholder 3D fibrin stillaset kultur system seeded med en embryoid kropp. Figur 2A viser representative bilder av mus indusert pluripotent stamceller blir dyrket på mus embryonale fibroblast mater lag. Disse cellene blir deretter overtalt til å danne embryoid organer, aggregater av celler som inneholder nevrale stamceller, ved hjelp av en åtte dagers retinsyre behandling protokollen (figur 2B) som previously beskrev 14 mens Figur 3 viser utseendet av en IPS-avledet embryoid kroppen etter 3 dager med kultur på innsiden av 3D fibrin stillaser. Lignende resultater har blitt oppnådd tidligere ved hjelp av musen embryonale stamceller 7. I tillegg har denne metoden blitt brukt til kultur iPS-deriverte embryoid kropper produsert med en annen protokoll som involverer retinsyre og purmorphamine 15 innsiden av 3D fibrin stillasene, viser allsidigheten til denne kulturen systemet.
Figur 1. Skjematisk viser side view av en enkelt brønn inneholder en 3D fibrin stillas seeded med en embryoid kropp.
Figur 2. Mus indusert pluripotent stilk (IPS) cellekultur og differensiering. For å skille disse cellene inn neural fenotyper, blir iPS cellene dyrkes i suspensjon for å produsere aggregater av celler som kalles embryoid organer (EBS). Disse EBS blir deretter behandlet med retinsyre å indusere nevrale differensiering og denne protokollen ble tidligere brukt til å indusere nevrale differensiering av embryonale stamceller. A) Udifferensiert mus iPS celle koloni kultiveres på en mus embryonale fibroblast mater lag. B) Embryoid organer avledet fra mus iPS celler i suspensjon kultur tas på dag 8 etter behandling med retinsyre å indusere nevrale differensiering. Scale bar er 100 mikrometer.
Figur 3. Eksempel resultatene av en mus iPS embryoid kroppen etter 3 dager med kultur innsiden av en 3D-fibrin stillas. Celler har begynt å migrere og differensiere innsiden av fibrin stillaset. Scale bar er 500 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskrevet ovenfor gir en metode for generering av 3D fibrin stillasene for pluripotent stamcelleforskningen kultur, spesielt for mus embryo-og induserte pluripotent stamceller. Denne 3D biomateriale baserte kultur systemet mer nøyaktig etterligner stamcelleforskningen nisje funnet in vivo og som et resultat, kan det brukes til å screene biologiske signaler for å bestemme deres virkninger på stamcelleforskningen differensiering 6. Våre observasjoner har vist at disse stillasene da seeded med stamcelle avledet embryoid kropper forbli i 2 uker i vitro før de blir helt nedbrutt. For ytterligere å øke stabiliteten av disse stillasene, kan aprotinin (en proteasehemmer) brukes til å bremse nedbrytning gjennom tillegg til de cellekultur media. 7,16 Disse stillasene har også blitt brukt med hell for nevrale tissue engineering applikasjoner, spesielt generasjon av vev lik den som finnes i det sentrale nervesystemet 17. Mens andre groups har kombinert iPS celler med fibrin lim for behandling hjerneinfarkt 18, representerer dette arbeidet den første kjente rapport kombinere iPS celler med fibrin stillaser for nevrale tissue engineering applikasjoner. Dette arbeidet har også fungert som et utgangspunkt for å kombinere en rekke stilk celletyper med fibrin stillasene for andre tissue engineering applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke NSERC Discovery Grant 402462 "tissue konstruerte stillaser for å kontrollere indusert pluripotent stamcelleforskningen atferd".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
