Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen
Summary
Diese Arbeit wird die Herstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für die Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen plutipotent. Solche Gerüste verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen biologischen Verbindungen zur Stammzellforschung Verhalten Bildschirm als auch modifiziert werden, um Drug Delivery-Systemen enthalten sein.
Abstract
Die Stammzellen werden in natürlich vorkommenden 3D Mikroumgebungen in vivo, was oft als Stammzellnische 1 sind gemäß vorhanden. Kultivierung von Stammzellen in der 3D-Gerüste Biomaterial bietet eine Möglichkeit, genau nachahmen diese Mikroumgebungen, was einen Vorteil gegenüber herkömmlichen 2D-Kulturverfahren unter Verwendung von Polystyrol als auch ein Verfahren zur Engineering Ersatzgewebe 2. Während 2D Gewebekultur Polystyrol ist für die Mehrheit der Zellkultur-Experimente verwendet wurde, kann 3D Biomaterial Gerüsten näher replizieren Mikroumgebungen in vivo durch eine genauere strukturellen Zellpolarität in der Umwelt und besitzt biochemische und mechanische Eigenschaften ähnlich weichen Gewebe. 3 Eine Vielzahl von natürlich gewonnenen synthetischen Biomaterialien und Gerüste wurden als 3D-Umgebungen für die Unterstützung Stammzellwachstumsfaktoraktivität untersucht worden. Während synthetische Gerüste synthetisiert, um eine größere r haben werdenAnge von mechanischen und chemischen Eigenschaften und haben oft eine höhere Reproduzierbarkeit werden natürliche Biomaterialien oft von Proteinen und Polysacchariden in der extrazellulären Matrix und als Ergebnis enthalten Bindungsstellen für Zell-Adhäsion und bereitwillig unterstützen Zellkultur gefunden komponiert. Fibrin Gerüste, die durch Polymerisation von Fibrinogen aus Plasma erhalten hergestellt wurden in großem Umfang für eine Vielzahl von Anwendungen in der Gewebezüchtung in vitro und in vivo 4 untersucht. Solche Gerüste können modifiziert werden unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden, um Systeme mit kontrollierter Freisetzung zur Abgabe von therapeutischen Faktoren 5 einzubauen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass solche Gerüste, um erfolgreich Kultur embryonaler Stammzellen verwendet werden kann und das Grundgerüst-basierte Kultur kann verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Wachstumsfaktoren auf die Differenzierung der Stammzellen in 6,7 ausgesät zu screenen.
Dieses Protokoll Details der Prozess der polymerizing Fibrin Gerüste aus Fibrinogen Lösungen mit der enzymatischen Aktivität von Thrombin. Der Prozess dauert 2 Tage in Anspruch, einschließlich einer nächtlichen Dialyse Schritt für die Fibrinogen-Lösung zu Citrate, die Polymerisation hemmen entfernen. Diese Methoden beruhen auf detaillierten Fibrinogenkonzentrationen bestimmt als optimal für die embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen in Kultur. Andere Gruppen haben weitere Fibrin Gerüste für eine Vielzahl von Zelltypen und Anwendungen untersucht – die Vielseitigkeit dieses Ansatzes 12.08.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll oben genannten ein Verfahren zur Erzeugung von 3D Fibrin Gerüste für pluripotente Stammzellen in Kultur, die speziell für embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese 3D-basierte Biomaterial Kultursystem genauer imitiert die Stammzellnische in vivo gefunden und als Ergebnis kann verwendet werden, um biologische Signale zu screenen, um ihre Wirkung auf Differenzierung der Stammzellen zu bestimmen 6 werden. Unsere Beobachtungen haben gezeigt, dass diese Ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem NSERC Discovery Grant 402462 "Tissue Engineering Scaffolds zur Steuerung von induzierten pluripotenten Stammzellen-Verhalten" zu bestätigen.
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
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