זה מפרט עבודה והכנת 3D הפיברין פיגומים culturing ומבדל בתאי גזע plutipotent. פיגומים אלה ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של חומרים ביולוגיים שונים על התנהגות בתאי גזע גם שונה כדי לכלול מערכות אספקת סמים.
בתאי גזע נמצאים באופן טבעי microenvironments 3D in vivo, אשר המכונה לעתים קרובות נישה תא גזע 1. גזע culturing בתוך תאים של 3D ביולוגי פיגומים מספק דרך לחקות במדויק את microenvironments, מתן יתרון על פני שיטות מסורתיות תרבות 2 ד באמצעות קלקר, כמו גם שיטה להחלפת רקמות הנדסה 2. בעוד polystrene 2 ד תרביות רקמה שימש במשך רוב הניסויים תרבית תאים, 3D פיגומים ביולוגי יכול הדוק יותר לשכפל את microenvironments נמצאו in vivo, בכך שהיא מאפשרת הקמת מדויק יותר של הקוטביות בתא בסביבה ובעל תכונות ביוכימיות ומכניות הדומות רקמות רכות. 3 מגוון של נגזרים באופן טבעי סינתטי פיגומים ביולוגי נחקרו כמו 3D סביבות לתמיכה תא גידול גזע. בעוד פיגומים סינתטי יכול להיות מסונתז יש R יותרange של תכונות מכניות וכימיות, ולעתים קרובות יש שחזור גדול, biomaterials טבעיים מורכבים לרוב חלבונים ופוליסכרידים שנמצאו מטריקס extracelluar וכתוצאה מכך מכילים אתרי קישור הידבקות התא בקלות לתמוך תרבית תאים. הפיברין פיגומים, המיוצר על ידי polymerizing פיברינוגן חלבון המתקבל פלזמה, נחקרו נרחב עבור מגוון רחב של יישומים הנדסיים רקמות הן במבחנה in vivo 4. פיגומים אלו ניתן לשנות באמצעות מגוון של שיטות לשלב מערכות שחרור מבוקר עבור אספקת גורמים טיפוליים 5. מחקרים קודמים הראו כי פיגומים כאלה יכולים לשמש בהצלחה בתאי גזע עובריים תרבות וזה פיגום מערכת מבוססת התרבות ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של גורמי גדילה שונים על התמיינות של תאים שנזרעו בתוך גזע 6,7.
פרוטוקול זה מפרט את תהליך polymerizinגרם הפיברין ויוצר תשתית מפתרונות פיברינוגן באמצעות הפעילות האנזימטית של תרומבין. התהליך לוקח 2 ימים לסיים, כולל צעד דיאליזה לילה לפתרון פיברינוגן להסיר citrates המעכבות פילמור. שיטות אלו מפורטות להסתמך על ריכוזי פיברינוגן נחוש בדעתו להיות אופטימלי עבור העובר המושרה תרבות גזע pluripotent התא. קבוצות אחרות חקרו יותר פיגומים הפיברין למגוון רחב של סוגי תאים ויישומים – הוכחת צדדיות של גישה זו 8-12.
זה פרוטוקול כמפורט לעיל מספק שיטה להפקת 3D פיגומים הפיברין לתרבות גזע pluripotent התא, במיוחד עבור עכבר עובריים המושרה בתאי גזע pluripotent. זו מערכת ביולוגי מבוסס 3D התרבות באופן מדויק יותר מחקה את תא גזע נישה למצוא vivo וכתוצאה מכך, הוא יכול לשמש מסך אותות ביולוגיים כדי לקבוע…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר NSERC דיסקברי גרנט 402462 "פיגומים רקמות מהונדסות לשליטה pluripotent המושרה גזע התנהגות התא".
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
Thrombin (human) | Sigma | T7009 |