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Bioengineering

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

doi: 10.3791/3641 Published: March 2, 2012

Summary

이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

줄기 세포가 자연스럽게 자주 줄기 세포 틈새 하나라고합니다 생체내에서 3D microenvironments를 발생에서 발견된다. 3D biomaterial 공사장 공중 발판의 내부 Culturing의 줄기 세포는 폴리스티렌뿐만 아니라 엔지니어링 교체 티슈 2에 대한 방법을 사용하여 전통적인 2D 문화 방법을 통해 이점을 제공, 정확하게 이러한 microenvironments을 모방하는 방법을 제공한다. 2D 조직 문화 polystrene은 세포 배양 실험의 대부분에 사용되고 있지만, 3D biomaterial의 공사장 공중 발판 더 밀접하게 환경에서 세포 극성의보다 정확한 창업을 활성화하고 부드러운 조직과 유사한 생화 학적 및 기계적 성질을 가진하여 생체내에서 발견 microenvironments를 복제할 수 있습니다. 3 다양한 자연적으로 파생과 합성 biomaterial의 공사장 공중 발판이 줄기 세포의 성장을 지원하기위한 3D 환경으로 조사되었습니다. 합성 공사장 공중 발판이 큰 R을 가지고 합성 수 있지만기계적 및 화학적 특성 앙과 자주보다 재현성을 가지고는 천연 biomaterials 종종 extracelluar 매트릭스와 세포 부착에 대한 바인딩 사이트를 포함하고 쉽게 세포 배양을 지원하는 결과로 발견된 단백질과 다당류로 구성되어있다. 혈장에서 얻은 단백질 섬유소를 polymerizing 제작한 섬유소 공사장 공중 발판은, 널리 시험 관내 및 생체내 4 두 조직 공학 응용 프로그램의 다양한 혐의로 조사되었습니다. 이러한 공사장 공중 발판은 치료적 요인에게 5를 전달하기위한 제어 릴리스 시스템을 통합하기 위해 다양한 방법을 사용하여 수정할 수 있습니다. 이전 작업은 공사장 공중 발판이 성공적으로 문화 배아 줄기 세포에 사용할 수있는이 발판 기반의 문화 체제가 6,7 내부에 놓는 줄기 세포의 분화에 관한 다양한 성장 요인의 효과를 차단하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜 세부 polymerizin 과정g 섬유소는 트롬빈의 효소 활동을 사용하여 피브리노겐 솔루션에서 공사장 공중 발판. 과정은 중합을 억제 citrates를 제​​거하는 피브리노겐 솔루션을위한 야간 투석 단계를 포함하여 완료 2 일 소요됩니다. 이러한 세부적인 방법은 배아와 유도된 pluripotent 줄기 세포 배양을위한 최적의 것으로 확인된 피브리노겐 농도에 의존하고 있습니다. 다른 그룹은 더 이상 세포 유형과 어플 리케이션의 광범위한 섬유소의 공사장 공중 발판을 조사했습니다 -이 접근법 8-12의 다양성을 보여주는.

Protocol

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프로토콜을 시작하기 전에주의 : 섬유소는 혈액 유래 단백질이며, 따라서 적절한 안전 교육을 처리하기 전에 완료해야합니다. 이 프로토콜은 원하는 줄기 문화가 적절하게 그들이 시딩 준비하기 위해 시간이 딱 2 일 완료해야합니다. 얼마나 많은 섬유소가 트리스 세 35mm 배양 접시를 달다하는 계산의 측면에서 400가 포함된 1 24 잘 플레이트를 생산하기에 충분 될 것입니다 TBS 3 ML에 녹아있는 섬유소의 110-130 밀리그램을 포함 (TBS, 산도 7.4) 염분 버퍼 각 우물에 μl 섬유소의 공사장 공중 발판.

1. 일 하나 : 피브리노겐 솔루션 및 야간 투석 만들기

  1. 냉장고에서 동결 건조된 섬유소를 꺼내서 그것은 실내 온도에 올 수 있도록 20 분 동안 앉아 보자.
  2. 트리스의 추가 3 ML은 각 35mm 배양 접시에 염분 (TBS)을 버퍼. 12에서 20 농도에 이르기까지 피브리노겐 솔루션의 피브리노겐 수율의 각 접시는 2-3 MLMG / ML 및 필요한 섬유소의 총 금액은 이러한 approximations에 근거하여 계산하실 수 있습니다.
  3. 약 100-130 MG의 피브리노겐 (FG)를 밖으로 무게와 각 접시에 TBS 선물의 표면에 뿌린다. 솔루션으로 이동하기 시작하는 피브리노겐 5 분 정도 기다립니다. 뚜껑과 배양 접시를 커버.
  4. 37 품어 배양 접시는 ° C에서 2 시간 피브리노겐 완전히 TBS 용액에 들어갈 수 있습니다.
  5. TBS와 젖은 투석 튜브 (7,000 MW가 잘려). 관 그리고 클램프 끝의 공간 하단 끝은 투석 클램프와 함께 종료합니다.
  6. 투석 튜브로 요리에서 피브리노겐 솔루션을 피펫. 맨 끝 위에 접어 투석 클램프와 함께 종료 클램프.
  7. 장소 투석 튜브는 TBS의 4리터 컨테이너에 피브리노겐 용액이 들어있는. 저속 (100 RPM)로 설정 볶음 플레이트를 사용하여 믹스 솔루션입니다.
  8. 최소한 12 시간 동안 접시에 볶음에 하룻밤 솔루션을 Dialyze. TBS 솔루션은이 기간 동안 변경할 필요가 없습니다.
  9. 2. 주 2 : 공사장 공중 발판으로 섬유소의 공사장 공중 발판 및 줄기 세포의 시딩의 중합

    이 공사장 공중 발판이 줄기 세포 배양에 놓는되므로이 과정에 대해 설명하는 모든 단계가 무균 조직 배양 후드에서 수행해야합니다.

    1. 적절한 크기의 원뿔 튜브 (15 ML 50 ML 중)로 투석 튜브과 장소에서 피브리노겐 용액을 제거합니다.
    2. 솔루션에 큰 불순물을 제거하는 5.0 μm의 주사기 필터로 필터 피브리노겐 솔루션입니다. 용액의 부피에 따라 여러 필터의 사용은 전체 솔루션을 처리 할 수​​ 있습니다.
    3. 50mL 원뿔 튜브로 필터 0.22 μm의 가진 무균 필터 피브리노겐 솔루션입니다. 적절한 크기의 피펫을 사용하여 계산을 수행할 때 나중에 사용할 수있는 필터링 피브리노겐 용액의 볼륨을 결정합니다. 용액의 부피에 따라 여러 필터의 사용은 엔트를 처리하는 데 필요할 수 있습니다분노 솔루션입니다.
    4. 분광 광도계를 사용하여 280 nm의에서 피브리노겐 용액의 흡광도를 측정합니다. 50 희석 요인은 1 아래 흡광도를 얻기 위해 종종 필요합니다.
    5. 다음 방정식을 사용하여 피브리노겐 용액에 단백질 존재의 농도를 계산 : [MG / ML의 섬유소를] = (280 × 희석 계수) 1.55 인간 피브리노겐 13 280의 흡광 계수이다 ÷ 1.55. 다음 11.1 MG / 초기 볼륨을 기준으로 섬유소의 ML에 대한 솔루션의 농도를 희석하는 데 필요한 TBS의 양을 계산합니다. 섬유소 공사장 공중 발판에있는 단백질의 최종 농도는 중합시 10 밀리그램 / ML 될 것입니다.
    6. 멸균 트롬빈과 염화칼슘 솔루션을 구합니다. 첫째, 15 μL 트롬빈 솔루션 추가 (농도 : 40 U / ML을 - 비계의 최종 농도는 2 U / ML 될 것입니다) 24 잘 접시의 첫 번째 행에있는 각 우물의 오른쪽. 다음, 50 MM 칼슘 chl 15 μL를 추가할각 우물의 왼쪽에 oride 솔루션입니다. 마지막으로 접시에 피브리노겐 솔루션의 270 μL를 추가합니다. 측면에서 솔루션의 혼합 수 있도록 전면에 다시 흔들어 뒤에 측면으로 접시를 흔들어.
    7. 혼합물은 상온에서 5 분간 중합이 포함된 행을 보자. 그들이 중합으로 공사장 공중 발판은 더욱 불투명된다.
    8. 섬유소의 공사장 공중 발판의 원하는 번호가 polymerized 때까지 단계 2.6 및 2.7을 반복합니다.
    9. 마지막 5 분 인큐베이션 후, 공사장 공중 발판을 완전히 중합 수 있도록 37 ° C 배양기 안에서 접시를 놓습니다.
    10. 한 시간 배양이 완료되면 다음 단계는 embryoid 시체 씨앗 발판을하는 것입니다. 20 μL pipettemen를 사용하여 섬유소 발판의 중심에서 개별 embryoid 기관과 장소를 선택합니다. 각 우물이 하나 embryoid 본문이 포함된 현미경으로 확인합니다.
    11. 50 MM 염화칼슘 5 μL : 트롬빈 용액 5 μL (40 U / ML 농도) 추가각 잘으로 피브리노겐 용액의 90 μL 다음 각 embryoid 몸 위에 솔루션입니다. 솔루션 embryoid 시체를 캡슐 거품을 형성한다.
    12. 중합을 보장하는 추가적인 시간 동안 다시 37 ° C 배양기에서 개최 플레이트.
    13. 부화 후 37 ° C 배양기에 다시 각각 잘 장소 플레이트에 적절한 세포 배양 매체의 1 ML을 추가합니다.

    3. 대표 결과

    그림 1은 잘 embryoid 몸. 그림 2A와 함께 놓는 3D 섬유소 비계 문화 시스템을 포함하는 개인의 측면의 구조는 마우스 배아 fibroblast 피더 레이어에서 배양해되고 마우스 유도된 pluripotent 줄기 세포의 대표 이미지를 보여줍니다 보여줍니다. 이러한 세포들은 후 팔일 retinoic 산성 치료 프로토콜 (그림 2B) previousl 등을 사용하여 embryoid 기관, 신경 progenitors를 포함하는 세포의 집합체를 형성 유도하고그림 3은 3D 섬유소의 공사장 공중 발판의 내부 문화 3 일 후에 IPS - 파생 embryoid 신체의 모양을 보여주면서 y는 14 설명했다. 유사한 결과는 마우스 배아의 줄기 세포에게 7을 사용 이전에 취득했습니다. 또한이 방법이 문화 시스템의 다양성을 보여주는, retinoic 산성 및 purmorphamine 3D 섬유소의 공사장 공중 발판의 15 내부 관련된 다른 프로토콜을 사용하여 문화 IPS-파생 embryoid 신체에 생산 사용되었습니다.

    1 그림.
    그림 1. 잘 embryoid 시신과 함께 3D 섬유소 비계 씨앗을 포함하는 개인의 측면을 보여주는 도식.

    그림 2.
    그림 2. 마우스 유도 pluripotent 줄기 (IPS) 세포 배양 및 분화. neur로 이들 세포를 차별화하려면야외 phenotypes는 IPS 세포는 embryoid 기관 (EBS)라는 세포의 집계를 생성하기 위해 서스펜션에 배양해 있습니다. 이러한 EBS 나서 신경 분화를 유도하는 retinoic 산성 대우하고이 프로토콜은 이전에 배아 줄기 세포의 신경 분화를 유도하는 데 사용되었다. ) Undifferentiated 마우스 IPS 세포 식민지는 마우스 배아 fibroblast 피더 계층에서 배양해. B) 서스펜션 문화에 마우스 IPS 세포에서 파생된 Embryoid 시체는 신경 분화를 유도하는 retinoic 산성과 치료 후 일 8 일 촬영. 스케일 바는 100 μm의입니다.

    그림 3.
    마우스 IPS의 그림 3. 예제 결과는 3D 섬유소 비계의 내부 문화 3 일 후에 시체를 embryoid. 세포는 섬유소 발판 내에 마이 그 레이션과 차별화하기 시작했다. 스케일 바 500 μm의입니다.

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Discussion

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위에 설명된이 프로토콜은 마우스 배아 및 유도 pluripotent 줄기 세포에 대해, 특히 pluripotent 줄기 세포 배양을위한 3D 섬유소의 공사장 공중 발판을 생성하는 방법을 제공합니다. 이 3D biomaterial 기반의 문화 시스템은보다 정확하게 생체내에서 발견된 줄기 세포 틈새 시장을 모방한 것이었 그 결과로, 그것은 줄기 세포 분화 6 그들의 효과를 결정하기 위해 생물 학적 단서를 차단하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 관찰이 공사장 공중 발판이 embryoid 신체가 완전히 저하되기 전에 체외 2 주 동안 남아 파생 줄기 세포로 놓는 때하는 것으로 나타났습니다. 더 이상이 공사장 공중 발판의 안정성을 높이려면 aprotinin (테아제 억제제)는 세포 배양 매체에 추가로 저하를 느리게하는 데 사용할 수 있습니다. 7,16이 공사장 공중 발판도 특별히 신경 조직 엔지니어링 응용 프로그램, 조직의 발전을 위해 성공적으로 사용되었습니다 중추 신경계의 17에 발견된 것과 비슷합니다. 다른 GR 동안oups은 허혈성 뇌졸중 18 치료를위한 섬유소 아교와 IPS 세포를 결합했습니다,이 작품은 신경 조직 엔지니어링 애플 리케이션을위한 섬유소의 공사장 공중 발판으로 IPS 세포를 결합의 첫 번째 알려진 보고서를 나타냅니다. 이 작품은 다른 조직 공학 응용 프로그램에 대한 섬유소의 공사장 공중 발판으로 줄기 세포 종류의 다양한 결합을위한 출발점을 역임했습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 "유도된 pluripotent 줄기 세포의 행동을 제어하기위한 조직 공학 공사장 공중 발판"NSERC 디스커버리 그랜트 402,462을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
Fibrinogen (human) Calbiochem 341578
Thrombin (human) Sigma-Aldrich T7009

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References

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Kolehmainen, K., Willerth, S. M. Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (61), e3641, doi:10.3791/3641 (2012).More

Kolehmainen, K., Willerth, S. M. Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (61), e3641, doi:10.3791/3641 (2012).

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