Подготовка 3D фибрина лесов для стволовых Приложения культуре клеток
Summary
Эта работа подробно подготовки 3D фибрина лесов для культивирования и дифференциации plutipotent стволовых клеток. Такие леса могут быть использованы для скрининга влияние различных биологических соединений на поведение стволовых клеток, а также изменение содержать систем доставки лекарств.
Abstract
Стволовые клетки находятся в естественных 3D микросреды в естественных условиях, которые часто называют ниши стволовых клеток 1. Культивирование стволовых клеток в 3D-биоматериала лесов дает возможность точно имитировать эти микросреды, обеспечивающие преимущество по сравнению с традиционными методами 2D культуры с помощью полистирола, а также метод для инженерных замена ткани 2. В то время как 2D polystrene культуры ткани была использована для большинства экспериментов клеточных культур, 3D биоматериала лесов может более тесно повторить микросреды обнаружены в естественных условиях, обеспечивая более точное создание клеточной полярности в окружающей среде и обладающих биохимической и механическим свойствам похож на мягкую ткань. 3 различных естественно получены и синтетические леса биоматериал был исследован в качестве 3D-среды для поддержки роста стволовых клеток. В то время как синтетические строительные леса могут быть синтезированы иметь большее тАнж механических и химических свойств, и часто имеют большую воспроизводимость, природных биоматериалов часто состоят из белков и полисахаридов найден в матрице extracelluar и, как следствие содержат сайты связывания для клеточной адгезии и легко поддерживать культуру клеток. Фибрин леса, производится путем полимеризации белка фибриногена полученных из плазмы, были широко исследованы различные ткани инженерных приложений, как в пробирке и в естественных 4. Такие леса могут быть изменены с помощью различных методов включения управляемых систем выпуска для доставки лечебных факторов 5. Предыдущие исследования показали, что такие леса могут быть использованы для успешной культуры эмбриональных стволовых клеток, и это леса на основе культуры система может быть использована для скрининга влияния различных факторов роста на дифференциацию стволовых клеток высевали в 6,7.
Этот протокол детали процесса polymerizinг фибрина из фибриногена леса решений с использованием ферментативной активности тромбина. Процесс занимает от 2 дней до завершения, в том числе ночью шаг диализа для фибриногена решение удалить цитраты, которые препятствуют полимеризации. Эти подробные методы основаны на концентрации фибриногена установлено, что оптимальным для эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток культуры. Другие группы дальнейшего изучения фибрина лесов для широкого спектра типов клеток и приложений – демонстрация универсальности этого подхода 8-12.
Protocol
Discussion
Этот протокол обеспечивает описанные выше метод для создания 3D леса фибрин для плюрипотентных стволовых клеток культуры, в частности, для мышиных эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Эта 3D биоматериала на основе системы культуры более точно имитирует ниша…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность NSERC Discovery Грант 402462 "Tissue инженерных леса для управления индуцированных плюрипотентных стволовых клеток поведение".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
