Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular
Summary
Estos detalles del trabajo de la preparación de la fibrina andamios 3D para el cultivo y diferenciación de las células madre plutipotent. Tales andamios puede ser utilizado para cribar los efectos de diversos compuestos biológicos sobre el comportamiento de células madre, así como modificado para contener los sistemas de suministro de fármacos.
Abstract
Las células madre se encuentran en forma natural microambientes 3D in vivo, que se refieren a menudo como el nicho de células madre 1. El cultivo de células madre en el interior de 3D biomateriales proporciona una manera de imitar con precisión estos microambientes, proporcionando una ventaja sobre los métodos tradicionales de cultivo 2D utilizando poliestireno, así como un método para tejidos de reemplazo de ingeniería 2. Mientras poliestireno 2D cultivo de tejidos se ha utilizado para la mayoría de los experimentos de cultivo celular, 3D biomateriales puede replicar más estrechamente los microambientes encontrados in vivo, permitiendo establecimiento más preciso de la polaridad celular en el medio ambiente y que posee propiedades bioquímicas y mecánicas similares a los tejidos blandos. 3 Una variedad de de origen natural y sintéticos biomateriales han sido investigados como entornos 3D para apoyar el crecimiento de células madre. Mientras andamios sintéticos pueden ser sintetizados a tener una mayor range de propiedades mecánicas y químicas y, a menudo tienen una mayor reproducibilidad, biomateriales naturales a menudo están compuestos de proteínas y polisacáridos que se encuentran en la matriz extracelular y, como resultado contienen sitios de unión para la adhesión celular y fácilmente apoyar el cultivo de células. Andamios fibrina, producido por la polimerización del fibrinógeno proteína obtenida a partir de plasma, se han investigado ampliamente para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, tanto in vitro como in vivo 4. Tales andamios se pueden modificar mediante una variedad de métodos para incorporar los sistemas de liberación controlada para la entrega de factores terapéuticos 5. Trabajos previos han demostrado que tales andamios puede ser utilizado con éxito para cultivar células madre embrionarias y este sistema de cultivo basado en andamio puede ser utilizado para cribar los efectos de diversos factores de crecimiento sobre la diferenciación de las células madre sembradas en el interior 6,7.
Este protocolo detalles el proceso de polymerizing fibrina andamios a partir de soluciones de fibrinógeno utilizando la actividad enzimática de la trombina. El proceso de toma de 2 días para completar, incluyendo una etapa de diálisis durante la noche para la solución de fibrinógeno para eliminar citratos que inhiben la polimerización. Estos métodos se basan en detalle las concentraciones de fibrinógeno decididos a ser óptimo para el cultivo de células pluripotentes embrionarias y pluripotentes. Otros grupos han seguido investigando andamios fibrina para una amplia gama de tipos de células y aplicaciones – demostrar la versatilidad de este enfoque 8-12.
Protocol
Discussion
Este protocolo detallado anteriormente proporciona un método para generar 3D andamios fibrina para el cultivo de células madre pluripotentes, específicamente para embriones de ratón y células madre pluripotentes inducidas. Este sistema 3D biomaterial cultura basada más reproduce con precisión el nicho de células madre encontradas in vivo y, como resultado, se puede utilizar para rastrear las señales biológicas para determinar sus efectos sobre la diferenciación de células madre 6.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer NSERC Discovery Grant 402462 "andamiaje de tejido de ingeniería para el control de células madre pluripotentes inducidas comportamiento de las células".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
References
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