Summary
وهناك طريقة بسيطة وفعالة وقوية لتزامن وصول عناصر فيروسية متعددة لخلايا النبات عن طريق
Abstract
في الفيروسات مع إيجابي، بمعنى الممرضة الجينوم الحمض النووي الريبي على البشر والحيوانات والنباتات، وencapsidation ذرية في virions ناضجة ومستقرة هي مرحلة الكاردينال خلال إنشاء عدوى في مجموعة معينة. وبناء على ذلك، ودراسة encapsidation يحل المعلومات المتعلقة الدراية لآلية تنظم الجمعية فيروس لتشكيل virions المعدية. مثل هذه المعلومات أمر حيوي في صياغة أساليب جديدة لكبح انتشار الفيروس والسيطرة على الأمراض. يمكن دراستها encapsidation الفيروس في والمجراة في المختبر. encapsidation الجينوم في الجسم الحي هو عملية منظمة للغاية الانتقائية التي تنطوي على تفاعلات الجزيئات التحت خلوية والتقسيم. لذلك، مما يؤدي إلى دراسة تشريح أحداث تشمل encapsidation الفيروس في الجسم الحي من شأنه أن يوفر المعارف الأساسية لفهم كيفية الفيروسات تتكاثر والتجمع. في الآونة الأخيرة في encapsidation المختبر تم استغلال للبحوث في مجال الطب الحيوي IMAجينج والتطبيقات العلاجية. الفيروسات النباتية غير يلفها يقف متقدما بفارق كبير في هذا المشروع من encapsidation في المختبر من المواد الخارجية السالبة. وقد استخدمت Brome فيروس فسيفساء (BMV)، وهو غير يلفها فيروس RNA متعدد المكونات المسببة للنباتات، ونظام نموذجي لدراسة الجينوم في التعبئة والتغليف والمجراة في المختبر. لفحوصات encapsidation في محطات benthamiana نيكوتيانا، الأجرعية بوساطة التعبير عابرة، تشير إلى مثل agroinfiltration، وهي تقنية فعالة وقوية لتسليم متزامنة والتعبير عن مكونات متعددة إلى نفس الخلية. في هذا النهج، هو تسلل تعليق من الخلايا الأجرعية المورمة الناقلة البلازميد ثنائي تحمل cDNAs من mRNAs desiredviral إلى ورقة الفضاء withina بين الخلايا باستخدام أي شيء أكثر تعقيدا من حقنة القابل للتصرف 1 مل (بدون إبرة). هذه نتائج عملية في نقل إدراج الحمض النووي في الخلايا النباتية، وT-DNAإدراج يبقى عابر في النواة وكتب بعد ذلك من قبل المضيف الثاني بوليميريز، مما يؤدي إلى التعبير عابر. ويتم تصدير ثم نص مرنا الناتج (المغطاة ومذيل بعديد الأدينيلات) إلى السيتوبلازم للترجمة. بعد ما يقرب من 24 إلى 48 ساعة من الحضانة، ويمكن أخذ عينات من أجزاء الأوراق مخترقة للتحاليل الكيميائية الحيوية microscopyor. Agroinfiltration يسمح بأعداد كبيرة (مئات الآلاف) من الخلايا لtransfected في وقت واحد. لفي المختبر encapsidation، virions تنقيته من BMV هي نأت إلى البروتين قفيصة بواسطة dialyzing ضد كلوريد الكالسيوم تفارق العازلة التي تحتوي على تليها إزالة الحمض النووي الريبي وvirions برنامج الأمم المتحدة للفصل عن طريق الطرد المركزي. يتم تجميعها ثم الجينوم مفارز المنضب قفيصة البروتين المطلوب مع مكونات الجينوم الفيروسي أو غير الفيروسية مكونات مثل indocyanine صبغ.
Protocol
1. المواد النباتية
- وينبغي أن نيكوتيانا benthamiana النباتات لاستخدامها في فحص encapsidation تكون في مرحلة أوراق 4 (3-4 أسبوع تقريبا النباتات القديمة).
2. تسليم والتعبير عن وظيفية مكونات الجينوم الفيروسي لزرع الخلايا agroinfiltration
- يوم 1: وتزرع سلالة الأجرعية (مثل EH 105 أو GV 3101) إيواء RNA pCass BMV-1، 2 BMV RNA والحمض النووي الريبي BMV 3 1،2 على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ملغ / مل من الكانامايسين (تحديد لل الموجه pCASS) و100mg/ml من ريفامبيسين (يختار لالأجرعية). ويجري تنفيذ حضانة بها في 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- يوم 3: مستعمرة واحدة تطعيم من لوحة LB أجار إلى 2 مل من مرق LB يحتوي على 50 ملغ / مل من الكانامايسين و 100 ملغ / مل من الريفامبيسين لمدة 1 يوم عند 28 درجة مئوية في مجموعة شاكر المداري في 250 دورة في الدقيقة.
- يوم 4: تطعيم 50 مل من LB الملحق مرقإد مع 50 ملغ / مل من الكانامايسين و 100 ملغم / لتر من مادة ريفامبيسين، 10 ملي زارة التربية والعلم درجة الحموضة 5.6 و 100 ملم acetosyringone مع واحد مل من ثقافة في 250 مل من دورق مخروطي لمدة 16 ساعة على 28 درجة مئوية على مدار شاكر في 250 دورة في الدقيقة .
- يوم 5: نقل الثقافة (OD 600 عندما وصلت 1.0) لأنبوب أوك ريدج أو معقم الصقر الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 5000 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية.
- حل بيليه في 10 مل من 10 ملي MgCl (2) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 5000 دورة في الدقيقة في درجة مئوية 4، كرر هذه الخطوة مرة أخرى لضمان الاستئصال الكامل للمضادات الحيوية.
- تعليق بيليه في المخزن 10 مل تحتوي على 10 MgCl 2 مم و 10 مللى زارة التربية والعلم (درجة الحموضة 5.6).
- قياس OD 600 لكل ثقافة من الحمض النووي الريبي BMV 1، 2 RNA والحمض النووي الريبي (3) وضبط إلى 0.1 OD 600 باستخدام 10 ملي MgCl (2) وزارة التربية والعلم 10MM (درجة الحموضة 5.6).
- مزيج 1 مل كل كل ثلاثة 0،1 تعليق OD ثقافة 600.
- إضافة 100 ملم من acetosyringone، مزيج جنتلاي والحفاظ على مزيج دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
- رسم تعليق الثقافة في 1 مل. حقنة من دون إبرة.
- التسلل الى تعليق ثقافة أعلاه إلى جانب مجافي المحور الأوراق جيدا الموسع 2-3 ن. benthamiana (5 أوراق المرحلة، والنباتات الاسبوع 3-4 سنة) عن طريق الضغط بلطف على حقنة واحدة من نصف سطح مجافي المحور من ورقة.
- كرر هذا الإجراء تسلل إلى أوراق أخرى.
- الحفاظ على النباتات تسلل في البيت الأخضر مع 24 درجة مئوية.
- تسللت حصاد أوراق 3-4 تسلل آخر أيام (نقطة في البوصة).
3. تنقية virions BMV
- جمع ن. benthamiana يترك agroinfiltrated مع خليط يحتوي كل ثلاثة البرية نوع agrotransformants BMV.
- تطحن الأوراق في مدقة وهاون عقيم مع حجم مساو (ث / ت) من BMV استخراج العازلة (0.5 م NAAC؛ 0.08 متر MgAc، ودرجة الحموضة 4.5 و حجم 1/100 المؤرخ المركابتويثانول-β التي هي التي يمكن ان تضاف فقط قبل الاستخدام) 3. لتعظيم العائد فيروس، فمن المستحسن لإضافة الرمل المغسول حامض (~ 0،5-1 ز) التي تسهل سهل طحن وكفاءة تمزيق الخلايا.
- تصفية المستخلص من خلال 2-3 طبقات من القماش الشاش وجمع فورة.
- طحن مرة أخرى في جزء الإبقاء على قماش الشاش مع حجم مساو من عازلة استخراج BMV لوزن المواد الأولية من ورق.
- كرر الإجراء الترشيح باستخدام قطعة قماش الشاش. وينبغي القيام بها في هذه الخطوات 4 درجة مئوية.
- نقل الحل الترشيح لأنبوب الطرد المركزي وإضافة حجم مساو من قبل مبرد الكلوروفورم ودوامة (أو هزة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى لون تعليق يتحول الضوء الأخضر.
- منبذة الحل المستحلب لمدة 15 دقيقة في 12000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- جمع المرحلة المائية ويحرك لمدة 30 دقيقة على محرك مغناطيسي لإزالة أي بقايا الكلوروفورم.
- نقل تعليق على أنبوب منبذة فائقة العقيمة.
- الطرد المركزي في 30000 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات في منبذة فائقة بيكمان في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف ووقف بيليه في حجم المطلوب من عازلة تعليق BMV (لإعداد تعليق العازلة استخراج BMV المخففة العازلة إلى 10/1 مع الماء المقطر عقيم).
- يتعرض إعداد الفيريون تنقية جزئيا من الخطوة أعلاه إلى 10-40٪ سكروز الطرد المركزي المتدرج الكثافة لمدة 150 دقيقة في 28000 دورة في الدقيقة في درجة مئوية 4
- جمع الفرقة فيروس إما يدويا أو بواسطة fractionator. والفرقة فيروس تظهر زرقاء تحت إضاءة الضوء الأبيض.
- تمييع الحل السكروز التي تحتوي على عينة الفيروس ما لا يقل عن 50٪ مع عازلة تعليق فيروس.
- منبذة المخفف حل فيروس السكروز التي تحتوي على لمدة 3 ساعات في 30000 دورة في الدقيقة في منبذة فائقة بيكمان في 4 درجات مئوية.
- تعليق أخيرا عالي النقاء فيروس بيليه في حجم المطلوب من VIRلنا تعليق العازلة.
- قياس تركيز الفيريون (ملغم / لتر) باستخدام مقياس الطيف في التطوير التنظيمي 260.
ملاحظة: وبناء على محتوى الحمض النووي الريبي، ومعامل للانقراض BMV هو 5 4.
- التحقق من نقاء virions عن طريق عرض تحت TEM (الشكل أ)
4. إعداد مفارز البروتين قفيصة في المختبر عن الجمعية
- تحضير 1 لتر من 1X فيروس التفكك العازلة (0.5 م CaCl 2، 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 1.0 ملم EDTA، 1.0 ملم و 0.5 DTT PMSF ملي) 5.
- تعد غشاء غسيل الكلى وفقا لسامبروك وآخرون 6.
- الاستغناء عن التركيز المطلوب لتنقية الفيروس في كيس غسيل الكلى.
- ضع كيس يحتوي على فيروس غسيل الكلى في دورق يحتوي على 1X العازلة تفارق فيروس.
- Dialyze 24 ساعة في 4 whil درجة مئويةه التحريك.
- جمع الحل من كيس غسيل الكلى بعد 24 ساعة، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وهذا فصل الحمض النووي الريبي BMV من virions فصلها.
- جمع وطاف والطرد المركزي في 35000 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي بيكمان لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية لتكوير أي جسيمات الفيروس من الامم المتحدة وفصلها.
- جمع وطاف.
- في هذه المرحلة لا بد من إزالة أي تلوث من الحمض النووي الريبي الفيريون فصل مفارز البروتين قفيصة. للقيام بذلك، ينبغي أن يتعرض لها طاف من الخطوة 8 لجولة أخرى من خلال إعادة التجميع ليلة من مفارز البروتين قفيصة دون إضافة أي الحمض النووي الريبي (RNA العازلة في الجمعية 1X، انظر أدناه) تليها الطرد المركزي عالية السرعة (30،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات في 4 درجة مئوية) لبيليه أي virions تجميعها. بعد هذه الخطوة إعادة التجميع، وطاف بروتين معطف تحتوي على وحدات فرعية تكون خالية من أي تلوث RNA المتبقية. ومع ذلك، للتأكد من هذا، فإنه من المستحسن إجراء إضافي في الخامسitro إعادة التجميع مع مفارز فقط بروتين معطف باستخدام الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية 1X. بعد أكثر من ليلة إعادة التجميع، يجب أن تكون خالية من إعداد virions تجميعها (تحقق من استخدام تيم).
- تحديد تركيز مفارز البروتين قفيصة عن طريق قياس في التطوير التنظيمي 254 و 280 نانومتر أو بواسطة وسائل أخرى مثل فحص برادفورد.
- اداء 12-15٪ SDS-PAGE تليها طخة غربية لتحديد سلامة مفارز البروتين قفيصة فصلها.
5. في الجمعية المختبر من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على virions
- إعداد النصوص الحمض النووي الريبي ليعاد تجميعها في virions وحساب تركيز 7.
- مزيج مفارز البروتين قفيصة والجيش الملكي النيبالي نص في نسبة 01:05 (وزن / وزن) 5.
- الاستغناء عن الخليط السابق للكيس غسيل الكلى وتأمين بشكل صحيح لتجنب أي تسرب.
- إعداد 1000 مل. من الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية 1X (50 ملم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.2 و 10 بوكل مم؛ 5 مم MgCl 2، 1.0 ملم DTT) 5.
- وضع كيس غسيل الكلى الذي يحتوي على خليط رد فعل ضد العازلة الجمعية 1X إلى الدورق ويحرك.
- Dialyze رد الفعل إعادة التجمع في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بواسطة التحريك لطيف.
- جمع خليط من كيس غسيل الكلى بعد 24 ساعة، وإضافة 1.5 مل من الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية.
- تمرير هذا الخليط من خلال عمود-100 Centricon بواسطة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (2،000 x ج) لمدة 30 دقيقة.
- غسل العمود مرة واحدة مع 1.5 مل من عازلة الجمعية العامة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- كرر الخطوة الغسيل فوق مرتين.
- أخيرا، وأزل virions إعادة تجميعها بواسطة الطرد المركزي في 10000 ز ب 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية.
- ويقدر تركيز الفيريون في 260 نانومتر OD.
6. تلفيق من أشباح الفيروسية البصرية (OVGs)
- إضافة خضرة الإندوسيانين (ICG) 8 إلى البروتين قفيصة تنقيته في نسبة تركيز المطلوب (نسبة الوزن من Indocyanine البروتين الأخضر وقفيصة المستخدمة في هذا التقرير هو 1:10) 1 د مزيج دقيق من قبل pipetting.
- Dialyze البروتين قفيصة وحل جنة الدولية ضد المنطقة العازلة الجمعية OVG (1 M كلوريد الصوديوم، و 50 NAAC مم؛ 1 ملم EDTA، و 1 DTT مم، pH4.8) في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة، وجمع من حل لحقيبة غسيل الكلى (12 كيلو دالتون حجم المسام)، وأجهزة الطرد المركزي في 90000 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية (الشكل B)
- إزالة طاف ووقف بيليه في تعليق العازلة BMV بواسطة vortexing أو تركها على تعليق نفسه في تعليق BMV العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- التحقق من مورفولوجية OVGs بواسطة TEM (الشكل ج).
- قياس الامتصاصية من 240 نانومتر إلى 950 نانومتر باستخدام مقياس الطيف (كاري 50، فاريان شركة)، ويتأكد من وجود مجموعة الازمات الدولية من قبل قمم الامتصاصية توقيع نحو 700 نانومتر و 790 نانومتر 8. (الشكل D)
- يمكن رؤية نموذجية قمم مضان ICG في نانومتر 700 ~ ~ ونانومتر 800 نانومتر على إثارة 620 من حل OVG (الشكل د) استخدام مقياس التألق الطيفي (Fluorolog 3، Jobin إيفون).
صورة شخصية تيم ألف virions BMV الملون سلبا على تنقيته من ن. agroinfiltrated النباتات benthamiana مع مزيج من كل ثلاثة البرية نوع agroconstructs BMV (شريط مقياس = 100 نانومتر).
تجميعها الرقم ب بيليه من في المختبر جنة الدولية OVGs المحتوية على بعد عالية السرعة الطرد المركزي.
صورة شخصية تيم جيم من OVGs سلبا جنة الدولية الملون التي تحتوي على (شريط مقياس = 100 نانومتر).
الشكل دال الامتصاصية (الأعلى)، ومضان (القاع) أطياف OVGs. طول الموجة المستخدمة لإثارة OVG انبعاث ثكما 620 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن مقاربة Agroinfiltration المقدمة هنا يكون على نطاق واسع ينطبق على مجموعة واسعة من الفيروسات النباتية. وتزامن وثمة سمة مميزة لهذا النهج تسليم agroconstruct متعددة إلى خلية واحد في نفس العيب الرئيسي المرتبطة عادة مع التلقيح الميكانيكي تستخدم بشكل روتيني من الفيروسات النباتية. يمكن أن تجرى في والمجراة في المختبر باستخدام دراسات الجمعية brome فيروس فسيفساء كنموذج فعال من قبل بعض النصائح التالية. (ط) للتسلل ناجحة من ن. benthamiana يترك، لا المياه والنباتات لمدة 24 ساعة قبل تسلل، (الثاني) الأجرعية ثقافة التعليق سوف تنتشر في مساحات داخل الخلايا بسهولة، إذا تم تنفيذ عمليات التسلل بين الساعة 4-5، (الثالث) وكثافة بصرية للثقافة لا ينبغي أن تتجاوز 1.0 في التطوير التنظيمي 600. ومن المعروف تسلل agrocultures مع كثافة أعلى خلية للحث على سمية الخلايا والشيخوخة ورقة 9،10 يمكن أن تؤثر بشدة على تكاثر الفيروس والفيريون لاحقوينبغي تطبيق (رابعا) خلال تسلل لطيف الضغط على الجانب مجافي المحور من ورقة لمنع إلحاق أضرار جسيمة في ورقة، ما قد يثير استجابة مناعية في النبات؛؛ تشكيل ويمكن إجراء (V) التدرج كثافة السكروز من 10٪ إلى 40٪ في أنبوب عن طريق جعل 25٪ من السكروز في عازلة تعليق BMV (بإضافة أعلى تركيز وأقل تركيز وتقسيمه على 2 أي 10٪ + 40٪ / 2 = 25٪) وعلى الفور تجميد في -80 درجة مئوية لمدة 2 -4 ساعة والسماح لمزيد من السكروز إلى ذوبان الجليد ببطء عن طريق الحفاظ على ليلة وضحاها في 4 درجة مئوية في وضع مستقيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر العديد من أعضاء مختبر لإبداء اقتراحاتهم القيمة في تطوير agroinfiltration والمقايسات في الجمعية المختبر. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من جامعة كاليفورنيا. وأيد هذه الدراسة في أجزاء من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET-1144237).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES Sodium salts | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| Indocyanine green | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Model: L8-70M | |
| Centricon-100 column | EMD Millipore | YM-100 | |
| Spectrophotometer | Varian, Inc. | Part number 10068900 | |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L. Plant Virology Protocols. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
