Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l'étude de l'assemblage du virus

Summary

Un moyen simple, efficace et robuste pour synchroniser la livraison de plusieurs composants viraux dans les cellules végétales par le biais

Abstract

Dans les virus avec des génomes ARN de sens positif pathogènes pour les humains, les animaux et les plantes, d'encapsidation descendance dans les virions matures et stable est une phase cardinal lors de l'établissement de l'infection chez un hôte donné. Par conséquent, l'étude de l'encapsidation déchiffre les informations concernant le savoir-faire de l'assemblage du virus mécanisme de régulation pour former des virions infectieux. Cette information est essentielle dans la formulation de nouvelles méthodes de freiner la propagation du virus et de lutte contre les maladies. Encapsidation du virus peut être étudiée in vivo et in vitro. Encapsidation du génome in vivo est un processus hautement régulé sélective impliquant des interactions macromoléculaires et de compartimentation subcellulaire. Par conséquent, l'étude menant à disséquer les événements englobant l'encapsidation du virus in vivo permettrait connaissances de base pour comprendre comment les virus prolifèrent et à assembler. Récemment, dans l'encapsidation in vitro a été exploitée pour la recherche dans le domaine de la recherche biomédicale imaGing et les applications thérapeutiques. Les virus des plantes non-enveloppés situer loin devant dans l'aventure de l'encapsidation in vitro dans de la matière chargée négativement étrangère. Virus de la mosaïque Brome (BMV), un agent pathogène non-enveloppé multicomposant virus à ARN pour les plantes, a été utilisé comme un système modèle pour l'étude du génome dans l'emballage vivo et in vitro. Pour les tests d'encapsidation dans Nicotiana benthamiana, au moyen d'Agrobacterium expression transitoire, reportez-vous comme agroinfiltration, est une technique efficace et robuste pour la livraison synchronisée et l'expression de plusieurs composants à la même cellule. Dans cette approche, une suspension de cellules Agrobacterium tumefaciens portant binaires vecteurs plasmidiques portant des ADNc des ARNm desiredviral est infiltré dans la feuille withina espace intercellulaire en utilisant rien de plus sophistiqué qu'une seringue de 1 ml à usage unique (sans aiguille). Ce processus aboutit à la cession de l'insert d'ADN dans des cellules végétales; l'ADN-Tinsert reste transitoirement dans le noyau et est ensuite transcrit par la polymérase II d'accueil, conduisant à l'expression transitoire. La transcription d'ARNm qui en résulte (plafonnés et polyadénylé) est ensuite exporté vers le cytoplasme pour la traduction. Après environ 24 à 48 heures d'incubation, des sections de feuilles infiltrées peuvent être prélevés pour des analyses biochimiques microscopyor. Agroinfiltration permet un grand nombre (centaines ou milliers) de cellules à transfecter simultanément. À l'encapsidation in vitro, de virions purifiés BMV sont dissociés en protéine de capside par dialyse contre un tampon de dissociation du chlorure de calcium contenant suivie de l'élimination de l'ARN et non dissociés virions par centrifugation. Génome sous-unités appauvries protéine de capside sont ensuite remontés avec souhaités composants du génome viral ou non-viraux tels que les composants indocyanine.

Protocol

1. Le matériel végétal

1. Nicotiana benthamiana à être utilisés dans le test d'encapsidation doivent être au stade de 4 feuilles (plantes semaine environ 3-4 ans).

2. La livraison et l'expression de composants fonctionnels du génome viral à planter des cellules par agroinfiltration

1. Jour 1: La souche d'Agrobacterium (par exemple EH 105 ou GV 3101) hébergeant l'ARN pCass-BMV 1, 2 et BMV ARN BMV ARN 3 ^1,2 sont cultivés sur des plaques d'agar LB supplémenté avec 50 mg / ml de kanamycine (sélectionne pour le vecteur pCASS) et de la rifampicine 100mg/ml (sélectionne pour la Agrobacterium). L'incubation est effectuée à 28 ° C pendant deux jours.
2. Jour 3: Inoculer seule colonie de la plaque de gélose LB dans 2 ml de bouillon LB contenant 50 mg / ml de kanamycine et 100 mg / ml de rifampicine pendant 1 jour à 28 ° C dans un agitateur orbital réglé à 250 RPM.
3. Jour 4: Inoculer 50 ml de bouillon LB le supplémented avec 50 mg / ml de kanamycine et 100 mg / ml de rifampicine, 10 mM MES pH 5,6 et 100 mM acétosyringone avec un ml de culture dans un 250 ml de la fiole Erlenmeyer de 16 heures à 28 ° C sur un agitateur orbital à 250 RPM .
4. Jour 5: Transfert de la culture (quand DO ₆₀₀ a atteint 1,0) à un tube Oak Ridge ou stériles tube Falcon et centrifuger pendant 10 minutes à 5000 rpm à 4 ° C.
5. Dissoudre le culot dans 10 ml de 10 mM MgCl ₂ et centrifuger pendant 10 minutes à 5000 rpm à 4 ° C, Répéter cette étape une fois de plus pour assurer l'élimination complète de l'antibiotique.
6. Suspendre le culot dans 10 ml de tampon contenant 10 mM MgCl ₂ et 10 mM de MES (pH 5,6).
7. Mesurer la DO ₆₀₀ pour chaque culture de BMV ARN 1, 2 et ARN ARN 3 et ajuster à 0,1 DO ₆₀₀ en utilisant 10 mM de MgCl ₂ et 10 mM MES (pH 5,6).
8. Mélanger 1 ml chacun trois tous les 0,1 suspensions OD culture _600.
9. Ajouter 100 mM de acétosyringone, mélange gentment et de garder intact le mélange à température ambiante pendant 3 heures.
10. Dessiner la suspension de la culture dans 1 ml. seringue sans aiguille.
11. Infiltrez la suspension de culture ci-dessus dans le côté abaxial de 2-3 bien élargis feuilles de N. benthamiana (5 feuilles de scène, les plantes semaine 3-4 ans) en appuyant doucement sur ​​la seringue à la moitié de la surface abaxiale de la feuille.
12. Répétez cette procédure pour l'infiltration d'autres feuilles.
13. Gardez les plantes infiltrés dans la maison verte à 24 ° C.
14. Récolte infiltré feuilles de 3 à 4 jours après l'infiltration (dpi).

3. Purification des virions BMV

1. Recueillir N. benthamiana laisse agroinfiltrated avec un mélange contenant toutes les trois de type sauvage agrotransformants BMV.
2. Meuler feuilles dans un pilon stérile et mortier avec un volume égal (p / v) d'extraction BMV tampon (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 et volume de 1/100 de β-mercaptoéthanol, qui doit être ajouté juste avant l'emploi) ^3. Pour maximiser le rendement de virus, il est recommandé d'ajouter du sable lavé à l'acide (~ 0,5-1 g) qui facilite la désintégration cellulaire facile de broyage et efficace.
3. Filtrer l'extrait de feuilles par 2-3 couches de mousseline et de recueillir la bourrasque.
4. Encore une fois broyer la partie retenue sur un tissu en mousseline avec un volume égal de tampon d'extraction BMV au poids initial de matériel foliaire.
5. Répétez la procédure de filtration d'utiliser un chiffon de mousseline. Ces mesures devraient être effectuées à 4 ° C.
6. Transférer la solution de filtrat dans un tube de centrifugeuse et ajouter un volume égal de pré-réfrigérés chloroforme et vortex (ou secouer) pendant 5 minutes à la température ambiante jusqu'à ce que la couleur de la suspension devient vert clair.
7. Centrifuger la solution émulsionnée pendant 15 minutes à 12000 rpm à 4 ° C.
8. Recueillir la phase aqueuse et remuer pendant 30 minutes sur un agitateur magnétique pour retirer tout le chloroforme résiduel.
9. Transférer la suspension à un tube d'ultracentrifugation stérile.
3.
10. Centrifuger à 30000 rpm pendant 3 heures dans une ultracentrifugeuse Beckman à 4 ° C.
11. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans de volume souhaité de tampon de suspension BMV (pour préparer un tampon de suspension de tampon d'extraction dilué BMV à 1/10 avec de l'eau distillée stérile).
12. La préparation virion partiellement purifié provenant de l'étape ci-dessus est soumis à une centrifugation saccharose gradient de densité de 10-40% pour 150 min à 28 000 tpm à 4 ° C.
13. Recueillir le bande de virus, soit manuellement ou par une colonne de fractionnement. La bande de virus apparaissent en bleu sous éclairage en lumière blanche.
14. Diluer la solution contenant du saccharose échantillon de virus d'au moins 50% avec un tampon suspension virale.
15. Centrifuger dilué solution de saccharose contenant le virus pendant 3 heures à 30.000 tours par minute dans une ultracentrifugeuse Beckman à 4 ° C.
16. Enfin suspendre le virus de culot hautement purifié dans un volume souhaité de virnous suspension tampon.
17. Mesurer la concentration du virion (mg / ml) en utilisant un spectrophotomètre à une DO _260.

Nota: Basé sur la teneur en ARN, le coefficient d'extinction pour BMV est 5 ^4.

19. Vérifiez la pureté de virions en regardant sous TEM (Fig. A)

4. Préparation de sous-unités protéiques capside pour assemblage in vitro

1. Préparer 1 litre de 1x virus tampon de dissociation (0,5 M CaCl _2, 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 1,0 mM d'EDTA, 1,0 mM de DTT et 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Préparer membrane de dialyse selon Sambrook et al ^6.
3. Répartir la concentration nécessaire de virus purifié dans un sac de dialyse.
4. Placez le sac de dialyse contenant le virus dans un bêcher contenant le virus 1x tampon de dissociation.
5. Dialyser 24 heures à 4 ° C tout en recueillante agitation.
6. Recueillir la solution de la poche de dialyse après 24 heures et centrifuger à 12000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Ce sera séparer l'ARN des virions BMV dissociées.
7. Recueillir le surnageant et centrifuger à 35000 rpm dans une centrifugeuse Beckman pendant 3 heures à 4 ° C à granulés toute particule virale non dissociée.
8. Recueillir le surnageant.
9. A ce stade, il est impératif d'éliminer toutes les ARN des virions contaminant à partir dissociées sous-unités protéiques de capside. Pour ce faire, le surnageant de l'étape 8 devraient être soumis à une autre ronde de nuit au-dessus du remontage de sous-unités protéiques de capside, sans ajouter de l'ARN (l'ARN 1x assemblage de tampons, voir ci-dessous) suivie d'une centrifugation à grande vitesse (30.000 rpm pendant 3 heures à 4 ° C) à culot des virions assemblés. Après cette étape le remontage, le surnageant contenant sous-unités protéiques manteau serait libre de tout ARN contaminantes résiduelles. Toutefois, pour ce faire, il est conseillé d'effectuer une supplémentaire en vitro remontage avec seulement l'aide de sous-unités protéiques manteau tampon ARN assemblage 1x. Après le remontage pendant la nuit, la préparation doit être exempte de virions assemblés (vérifier à l'aide TEM).
10. Déterminer la concentration de sous-unités protéiques de capside par la mesure à une DO 254 et 280 nm ou par d'autres méthodes telles que dosage de Bradford.
11. Effectuer 12-15% SDS-PAGE suivie par western blot pour déterminer l'intégrité des sous-unités dissociées protéine de capside.

5. In vitro l'assemblage de l'ARN des virions contenant

1. Préparer des transcrits d'ARN à être ré-assemblés dans les virions et de calculer la concentration ^7.
2. Mélanger sous-unités protéiques de capside et l'ARN transcrit à un ratio de 1:5 (poids / poids) ^5.
3. Répartir le mélange ci-dessus pour un sac de dialyse et de sécuriser convenablement pour éviter toute fuite.
4. Préparer 1000 ml. de l'ARN 1x tampon d'assemblage (50 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM de KCl, 5 mM MgCl _2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Placez le sac de dialyse contenant le mélange réactionnel contre un tampon de montage 1x dans le bécher et agiter.
6. Dialyser la réaction ré-assemblage à 4 ° C pendant 24 heures par agitation douce.
7. Collecter le mélange de la poche de dialyse après 24 heures et ajouter 1,5 ml de l'ARN ensemble tampon.
8. Passez ce mélange à travers une colonne Centricon-100 par centrifugation à basse vitesse (2000 xg) pendant 30 minutes.
9. Laver la colonne une fois avec 1,5 ml de tampon d'assemblage à 4 ° C pendant 30 min.
10. Répétez l'étape de lavage ci-dessus deux fois.
11. Enfin, éluer les virions re-assemblés par centrifugation à 10.000 g à 4 ° C pendant 5 min.
12. Estimer la concentration virion à OD 260 nm.

6. Fabrication de fantômes optiques virales (OVGs)

1. Ajouter au vert d'indocyanine (ICG) ⁸ à la protéine de capside purifié à rapport de concentration désiré (le rapport pondéral de la protéine d'indocyanine vert et capside utilisé dans ce rapport est 01:10) une d mélanger par pipetage.
2. Dialyser la solution de protéine de capside et ICG contre le tampon de montage OVG (1 M de NaCl; 50 NaAc mM; EDTA 1 mM, et 1 mM, DTT pH4.8) à 4 ° C pendant 24 heures.
3. Après 24 heures, recueillir la solution de la poche de dialyse (12 kDa taille des pores) et centrifuger à 90000 rpm pendant 1 heure à 4 ° C (fig. B)
4. Eliminer le surnageant et suspendre le culot dans un tampon de suspension par vortex BMV ou lui permettant de suspendre par lui-même dans un tampon de suspension BMV nuit à 4 ° C.
5. Vérifiez la morphologie de OVGs par TEM (Fig. C).
6. Mesurer l'absorbance de 240 nm à 950 nm en utilisant un spectrophotomètre (Cary 50, Varian Inc), la présence de l'ICG est confirmée par la signature pics d'absorption à 700 nm environ et 790 nm ^8. (Fig. D)
7. Les pics de fluorescence typiques du GIC à ~ 700 nm et environ 800 nm peut être vu sur 620 nm d'excitation de la solution OVG (Fig. D) en utilisant spectrofluorimètre (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> Résultats représentant 7.

Figure A. TEM image de virions BMV coloration négative purifiés à partir de N. benthamiana agroinfiltrated avec un mélange de tous les trois sauvages agroconstructs BMV type (barre d'échelle = 100 nm).

Figure B. Pellet in vitro assemblé ICG OVGs contenant la suite de centrifugation à grande vitesse.

Figure C. TEM image de coloration négative ICG OVGs contenant (barre d'échelle = 100 nm).

Figure D. Absorbance (Haut) et la fluorescence (en bas) des spectres de OVGs. La longueur d'onde d'excitation utilisée pour OVG émissions wque 620 nm.

Discussion

Approche agroinfiltration présentée ici peut largement s'appliquer à un large éventail de virus de plantes. Un des traits caractéristiques de cette approche est synchronisé livraison de multiples agroconstruct à la cellule, un même inconvénient majeur souvent associée à l'inoculation mécanique couramment utilisés des virus des plantes. In vivo et dans les études d'assemblage in vitro utilisant des virus de la mosaïque du brome comme un modèle peut être menée efficacement par après quelques conseils. (i) Pour l'infiltration réussie de N. benthamiana laisse, ne pas arroser les plantes pendant 24 heures avant l'infiltration; (ii) la culture en suspension d'Agrobacterium se répandrait dans les espaces intracellulaires avec la facilité, si l'infiltration ont été réalisées entre 4-5 h; (iii) La densité optique de la culture ne doit pas dépasser 1,0 à OD _600. L'infiltration de agrocultures avec une plus grande densité de cellules est connue pour induire une toxicité cellulaire et la sénescence des feuilles ^9,10 qui pourraient gravement affecter la réplication virale et virion ultérieurela formation; (iv) Au cours de la pression d'infiltration douce doit être appliquée sur la face abaxiale de la feuille afin de prévenir des dommages importants à la feuille, ce qui pourrait déclencher la réponse immunitaire dans l'usine; (v) un gradient de densité de saccharose de 10% à 40% peut être faite dans un tube en faisant 25% de saccharose dans un tampon de suspension BMV (en ajoutant la plus forte concentration et la plus faible concentration et en le divisant par 2, soit, 10% + 40% / 2 = 25%) et de geler immédiatement à -80 ° C pendant 2 h -4 et permettant en outre du saccharose à décongeler lentement par le mettant pendant une nuit à 4 ° C dans une position droite.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21