פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

Summary

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות

Abstract

בשנת וירוסים עם פתוגניים חיובי במובן הגנום RNA לבני אדם, בעלי חיים וצמחים, encapsidation צאצאים לתוך virions בוגרת ויציבה היא השלב הקרדינל במהלך הקמת זיהום המארח נתון. כתוצאה מכך, המחקר של encapsidation מפענח מידע על הידע של מנגנון ויסות הרכבה וירוס כדי ליצור virions זיהומיות. מידע זה חיוני בגיבוש שיטות חדשניות של בלימת התפשטות וירוס לבקרת מחלות. Encapsidation וירוס ניתן ללמוד in vivo ו במבחנה. Encapsidation הגנום in vivo היא תהליך סלקטיבי פיקוח הדוק מעורבים באינטראקציות macromolecular ו המידור subcellular. לכן, ללמוד המוביל לנתח אירועים המקיף encapsidation וירוסים in vivo יספק ידע בסיסי כדי להבין כיצד וירוסים להתרבות ולהרכיב. לאחרונה encapsidation חוץ גופית נוצל למחקר בתחום של ביו IMAגינג ויישומים טיפוליים. שאינם עטופים וירוסים צמחיים לעמוד רחוק במיזם של ב encapsidation חוץ גופית של חומר זר טעון שלילית. וירוס Brome פסיפס (BMV), שאינם עטופים multicomponent פתוגניים RNA וירוס לצמחים, שימש כמערכת מודל לחקר הגנום אריזה in vivo ו במבחנה. מבחני encapsidation בצמחים ניקוטיאנה benthamiana, Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף, מכנים agroinfiltration, היא טכניקה יעילה וחזקה למסירה מסונכרן וביטוי של רכיבים מרובים באותו התא. בגישה זו, ההשעיה של תאים Agrobacterium tumefaciens הנושאים פלסמיד וקטורים בינאריים הנושאים cDNAs של mRNAs desiredviral הוא שחדר עלה אינטר שטח withina באמצעות לא מתוחכמת יותר מזרק חד פעמי 1 מ"ל (בלי מחט). תהליך זה גורם להעברת להוסיף לתוך ה-DNA בתאי צמח, T-DNAהכנס נותר זמני בגרעין והוא עיבד מכן על ידי פולימראז II המארח, מה שמוביל ביטוי חולף. תעתיק mRNA וכתוצאה מכך (כתרים ו polyadenylated) מיוצא ואז הציטופלסמה לתרגום. לאחר כ 24 עד 48 שעות של דגירה, קטעי עלים ההסתננות ניתן שנדגמו עבור ניתוחים ביוכימיים microscopyor. Agroinfiltration מאפשר מספר גדול (מאות עד אלפים) של תאים transfected להיות בעת ובעונה אחת. שכן encapsidation חוץ גופית, virions מטוהרים של BMV הם ניתק את החלבון capsid ידי dialyzing נגד ניתוק המכילה סידן כלוריד חיץ ואחריו הסרת RNA ובלתי הסתייגותם virions על ידי צנטריפוגה. הגנום יחידות משנה מרוקנים חלבון קפסיד הם מחדש אז עם הרכיבים הרצויים הגנום הנגיפי או שאינם נגיפיים רכיבים כגון indocyanine צבע.

Protocol

1. הצמח החומר

1. ניקוטיאנה צמחים benthamiana כדי לשמש assay encapsidation צריך להיות בשלב עלים 4 (צמחים בשבוע 3-4 כ ישנים).

2. משלוח וביטוי של רכיבים פונקציונליים הגנום הנגיפי לשתול תאים על ידי agroinfiltration

1. יום 1: זן Agrobacterium (למשל EH 105 או GV 3101) מחסה pCass-BMV RNA 1, 2 ו BMV RNA RNA BMV 3 ^1,2 גדלים על אגר צלחות ליברות השלימו עם 50 מ"ג / מ"ל של kanamycin (בוחר עבור וקטור pCASS) ו 100mg/ml של ריפאמפיצין (בוחר עבור Agrobacterium). הדגירה מתבצעת על 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
2. יום 3: מושבה אחת מהצלחת ולחסן LB אגר לתוך 2 מ"ל של מרק LB המכיל 50 מ"ג / מ"ל ו kanamycin 100 מ"ג / מ"ל של ריפאמפיצין ליום 1 ב 28 מעלות צלזיוס מסלולית שאכר נקבע על 250 סל"ד.
3. יום 4: מחסן 50 מ"ל תוספת מרק LBאד עם 50 מ"ג / מ"ל ​​ו kanamycin 100 מ"ג / מ"ל ​​של ריפאמפיצין, 10 mM MES-pH 5.6 ו 100 מ"מ עם acetosyringone מ"ל 1 של התרבות ב 250 מ"ל של הבקבוק Erlenmeyer במשך 16 שעות ב 28 מעלות צלזיוס על מסלולית שאכר בסל"ד 250 .
4. יום 5: מעבירים את התרבות (כאשר OD ₆₀₀ הגיעו 1.0) על צינור רכס אלון או צינור סטרילי פלקון ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל"ד 5000 ב 4 ° C.
5. ממיסים את גלולה ב 10 מ"ל של 10 מ"מ MgCl ₂ ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל"ד 5000 ב 4 ° C, חזור על פעולה זו פעם נוספת על מנת להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה.
6. להשעות גלולה במאגר המכיל 10 מ"ל 10 mM MgCl ₂ ו 10 mM MES (pH 5.6).
7. למדוד את OD ₆₀₀ עבור כל תרבות של BMV RNA 1, 2 ו-RNA-RNA 3 ולהתאים 0.1 OD ₆₀₀ באמצעות 10 mM MgCl ₂ ו 10mm MES (pH 5.6).
8. מערבבים 1 מ"ל כל אחד בכל שלושת 0.1 OD ₆₀₀ השעיות תרבות.
9. הוספת 100 מ"מ של acetosyringone, לערבב GentLY ולשמור על תערובת באין מפריע בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
10. צייר את ההשעיה התרבות לתוך מ"ל 1. מזרק ללא מחט.
11. לחדור ההשעיה התרבות מעל לצד abaxial של 2-3 היטב מורחבת עלי נ benthamiana (5 עלים, צמחים בשלב בשבוע 3-4 ישנים) על ידי לחיצה בעדינות את המזרק עד מחצית משטח abaxial של עלה.
12. חזור על הליך זה כדי חדירת עלים אחרים.
13. שמור על צמחים ההסתננות בבית ירוק עם 24 ° C.
14. קציר הסתננו עלים 3 עד 4 ימים חדירת הפוסט (dpi).

3. טיהור virions BMV

1. איסוף נ benthamiana משאיר agroinfiltrated בתערובת המכילה את כל שלושת סוגי בר agrotransformants BMV.
2. טוחנים עלים העלי מרגמה סטרילית עם נפח שווה (W / V) של BMV מיצוי המאגר (0.5 מ 'NaAc, 0.08 מ' MgAc, pH 4.5 ונפח 1/100 של mercaptoethanol-β אשר יתווספו רק לפני השימוש) ^3. על מנת למקסם את התשואה וירוס, מומלץ להוסיף חול מולבן (~ 0.5-1 גרם) המאפשרת הפרעה תא שחיקה קלה ויעילה.
3. לסנן את תמצית עלי דרך 2-3 שכבות של בד מוסלין ולאסוף פרץ.
4. שוב לטחון את החלק שמרו על בד מוסלין עם נפח זהה של מיצוי מאגר BMV למשקל ההתחלתי של החומר עלה.
5. חזור על הליך סינון באמצעות בד מוסלין. פעולות אלה צריכות להתבצע ב 4 ° C.
6. מעבירים את הפתרון תסנין לצינור צנטריפוגות ומוסיפים נפח שווה של כלורופורם מראש ומצוננים, מערבולת (או שייק) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עד צבע ההשעיה הופך ירוק בהיר.
7. בצנטריפוגה פתרון תחליב במשך 15 דקות בסל"ד 12,000 ב 4 ° C.
8. לאסוף את השלב מימית ומערבבים במשך 30 דקות על stirrer מגנטי כדי להסיר כל כלורופורם שיורית.
9. מעבירים את ההשעיה לצינור ultracentrifuge סטרילית.
3 כמו כרית.
10. סרכזת בסל"ד 30,000 למשך 3 שעות ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C.
11. מחק supernatant ו להשעות גלולה בהיקף הרצוי מאגר ההשעיה BMV (להכין מאגר ההשעיה לדלל חיץ BMV החילוץ כדי 1/10 עם מים מזוקקים סטריליים).
12. הכנה virion מטוהרים חלקית משלב מעל נתונה 10-40% צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע דקות 150 סל"ד 28000 ב 4 ° C.
13. איסוף הלהקה וירוס באופן ידני או על ידי fractionator. הלהקה תופיע וירוס כחול תחת תאורה של אור לבן.
14. לדלל את הפתרון סוכרוז המכיל מדגם וירוס לפחות 50% עם חיץ ההשעיה וירוס.
15. סרכזת וירוס בדילול מלא המכיל פתרון סוכרוז במשך 3 שעות ב -30,000 סל"ד ב ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C.
16. בסופו של דבר להשעות את מטוהרים מאוד וירוס גלולה בהיקף הרצוי virלנו ההשעיה המאגר.
17. למדוד את ריכוז virion (מ"ג / מ"ל) באמצעות ספקטרופוטומטר ב OD _260.

הערה: מבוסס על תוכן RNA, מקדם הכחדה של BMV הוא 5 ^4.

19. אמת טוהר virions ידי הצגת תחת TEM (איור)

4. הכנת יחידות משנה חלבון קפסיד עבור במבחנה הרכבה

1. הכן 1 ליטר 1x וירוס דיסוציאציה חיץ (0.5 מ 'CaCl _2, 50 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 1.0 מ"מ EDTA, 1.0 מ"מ ו 0.5 מ"מ DTT PMSF) ^5.
2. הכן את קרום דיאליזה פי Sambrook ואח' ^6.
3. לוותר על הריכוז הנדרש מטוהרים וירוס לתוך שקית דיאליזה.
4. מניחים וירוס המכיל שקית דיאליזה לתוך מבחנה המכילה מאגר וירוס 1x דיסוציאציה.
5. Dialyze 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס whilדואר ערבוב.
6. איסוף פתרון משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. זה יהיה להפריד RNA BMV מן virions הסתייגותם.
7. איסוף supernatant ו צנטריפוגות בסל"ד 35,000 בצנטריפוגה Beckman במשך 3 שעות 4 ° C עד גלולה כל חלקיק בלתי ניתק את הנגיף.
8. איסוף supernatant.
9. בשלב זה הוא הכרחי כדי להסיר כל RNA virion מזהמים מן הסתייגותם יחידות משנה חלבון קפסיד. לשם כך, supernatant משלב 8 יש נתון לסיבוב נוסף של הלילה על והרכבה מחדש של יחידות משנה חלבון קפסיד מבלי להוסיף כל רנ"א (RNA במאגר הרכבה 1x, ראה להלן) ואחריו צנטריפוגה במהירות גבוהה (30,000 סל"ד למשך 3 שעות בבית 4 ° C) גלולה כל virions שנאספו. לאחר שלב זה והרכבה מחדש, את supernatant המכילים חלבון יחידות משנה המעיל יהיה ללא כל RNA מזהמים שיורית. עם זאת, כדי להבטיח זאת, מומלץ לבצע נוסף Vitro והרכבה מחדש רק עם חלבון יחידות משנה המעיל באמצעות RNA חיץ 1x הרכבה. אחרי לילה על והרכבה מחדש, הכנה חייבת להיות ללא virions התאספו (לוודא באמצעות TEM).
10. קבע את הריכוז של חלבון קפסיד יחידות משנה על ידי מדידת OD ב 254 ו 280 ננומטר או בשיטות אחרות כגון assay ברדפורד.
11. לבצע 12-15% SDS-PAGE ואחריו כתם המערבי על מנת לקבוע את שלמות יחידות משנה הסתייגותם חלבון קפסיד.

5. במבחנה הרכבה של RNA המכיל virions

1. תעתיקי רנ"א כדי להכין מחדש התאספו לתוך virions ולחשב את ריכוז ^7.
2. מערבבים יחידות משנה חלבון קפסיד ו-RNA תעתיק ביחס של 1:05 (wt / wt) ^5.
3. מחלקים את התערובת מעל ל שקית דיאליזה לאבטח כראוי כדי למנוע הדלפות.
4. הכינו 1,000 מ"ל. של רנ"א 1x הרכבה חיץ (50 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.2, 10 mM KCl: 5 מ"מ MgCl _2, 1.0 מ"מ DTT) ^5.
5. מניחים את שקית דיאליזה ובה תערובת תגובת נגד המאגר הרכבה 1x לתוך הכוס ומערבבים.
6. Dialyze התגובה הרכבה מחדש על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות על ידי ערבוב עדין.
7. לאסוף את התערובת משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ומוסיפים 1.5 מ"ל של חיץ הרכבה RNA.
8. מעבירים את התערובת דרך עמודה Centricon-100 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (2000 XG) במשך 30 דקות.
9. לשטוף את הטור פעם אחת עם 1.5 מ"ל של חיץ הרכבה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
10. חזור על השלב כביסה מעל פעמיים.
11. לבסוף, elute מחדש virions שנאספו על ידי צנטריפוגה ב g 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
12. להעריך את ריכוז virion ב OD 260 ננומטר.

6. ייצור של רוחות ויראלי אופטי (OVGs)

1. הוסף Indocyanine ירוק (ICG) ⁸ לחלבון capsid מטוהרים ביחס לריכוז הרצוי (יחס משקל Indocyanine חלבון ירוק capsid בו גם בדו"ח זה היה 01:10) ד ומערבבים היטב על ידי pipetting.
2. Dialyze חלבון capsid פתרון ICG נגד המאגר הרכבה OVG (1 M NaCl, 50 מ"מ NaAc: 1 mM EDTA, ו 1 mM DTT, pH4.8) בשעה 4 ° C למשך 24 שעות.
3. לאחר 24 שעות, לאסוף את הפתרון משקית הדיאליזה (12 גודל הנקבוביות kDa) ו צנטריפוגות בסל"ד 90,000 במשך שעה 1 ב 4 ° C (איור ב ')
4. הסר את supernatant ו להשעות גלולה במאגר ההשעיה BMV ידי vortexing או הפעלתו על ידי להשעות עצמו במאגר ההשעיה BMV לילה ב 4 ° C.
5. בדוק את המורפולוגיה של OVGs ידי TEM (איור ג').
6. למדוד את ספיגת מ 240 ננומטר עד 950 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (קרי 50, וריאן Inc), נוכחות של ICG הוא אושר על ידי ספיגת פסגות חתימה סביב 700 ננומטר ו 790 ננומטר ^8. (איור ד ')
7. פסגות לתקופה מוגבלת של הקרינה ICG ב ~~~HEAD=NNS 700 ננומטר ו -800 ננומטר ~~~HEAD=NNS ניתן לראות על עירור 620 ננומטר של פתרון OVG (איור ד ') באמצעות spectrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> 7. נציג תוצאות

איור א TEM דמות צבעונית שלילי virions BMV מטוהרים מן נ צמחים benthamiana agroinfiltrated בתערובת של כל שלושת agroconstructs מסוג BMV בר (בר בקנה מידה = 100 ננומטר).

איור ב 'גלולה של במבחנה התאספו ICG OVGs המכילים לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה.

איור ג TEM דמות שלילי OVGs מוכתמים המכילים ICG (בר בקנה מידה = 100 ננומטר).

איור ספיגת ד (למעלה) ואת הקרינה (התחתון) של ספקטרום OVGs. גל עירור המשמש OVG פליטת Wכ 620 ננומטר.

Discussion

הגישה המוצגת כאן יכול Agroinfiltration נרחב לחול על מגוון רחב של וירוסים צמחיים. תכונה סימן ההיכר של גישה זו מסונכרן מסירת agroconstruct מרובות תאים באותו החיסרון העיקרי נפוץ הקשורים חיסון מכני בשימוש שגרתי של וירוסים צמחיים. In vivo ו במבחנה הרכבה באמצעות וירוס Brome פסיפס כמודל ניתן לבצע ביעילות על ידי טיפים הבאות. (i) עבור חדירה מוצלחת של נ benthamiana עוזב, לא להשקות את הצמחים למשך 24 שעות לפני החדירה, (ii) תרבות Agrobacterium ההשעיה תתפשט לתוך חללים תאיים בקלות, אם החדירה בוצעו בין 4-5 PM: (ג) צפיפות אופטית של התרבות לא יעלה על 1.0 ב OD _600. חדירת agrocultures עם צפיפות התאים גבוהה יותר ידוע לגרום לרעילות תאים ההזדקנות עלה ^9,10 זה יכול להשפיע קשות השכפול הנגיפי virion לאחר מכןהיווצרות: (ד) במהלך חדירה לחץ עדין יש להחיל בצד abaxial עלה כדי למנוע נזק רב עלים, מה שעשוי לעורר תגובה חיסונית במפעל; (ה) צפיפות סוכרוז הדרגתי מ -10% ל -40% יכול להתבצע בצינור על ידי ביצוע 25% סוכרוז במאגר ההשעיה BMV (על ידי הוספת את הריכוז הגבוה ביותר והריכוז הנמוך ביותר וחלוקתו ב 2 כלומר, 10% + 40% / 2 = 25%) ומיד להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעה ו -4 נוספים המאפשר סוכרוז להפשיר לאט על ידי שמירה על אותה בן לילה על 4 מעלות צלזיוס במצב ישר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21