Summary
एक सरल, कुशल और मजबूत करने के लिए संयंत्र कोशिकाओं के माध्यम से कई वायरल घटकों का वितरण सिंक्रनाइज़
Protocol
1. संयंत्र सामग्री
- Nicotiana benthamiana encapsidation परख में इस्तेमाल किया जा संयंत्र 4 पत्तियों चरण के (लगभग 3-4 सप्ताह पुराने पौधों) पर होना चाहिए.
2. और वायरल जीनोम कार्यात्मक घटकों के वितरण अभिव्यक्ति agroinfiltration द्वारा कोशिकाओं को संयंत्र के लिए
- दिन 1: (eg. एह 105 या 3101 जीवी) Agrobacterium तनाव pCass-BMV 1 शाही सेना, BMV शाही सेना -2 और BMV 3 शाही सेना 1,2 शरण लेग अगर 50 मिलीग्राम / kanamycin की मिलीलीटर के साथ पूरक प्लेटों पर बड़े हो रहे हैं (के लिए चयन pCASS) वेक्टर और रिफैम्पिसिन की 100mg/ml (Agrobacterium के लिए चुनता है). ऊष्मायन 28 ° C पर किया जा रहा है दो दिन के लिए बाहर किया.
- 3 दिन: लेग शोरबा युक्त 50 मिलीग्राम / kanamycin की मिलीग्राम और 100 मिलीग्राम / दिन के लिए 1 रिफैम्पिसिन की मिलीग्राम 28 ° कक्षीय प्रकार के बरतन में सी 250 आरपीएम पर सेट के 2 मिलीग्राम में लेग अगर थाली से टीका लगाना एकल कॉलोनी.
- 4 दिन: लेग शोरबा पूरक की 50 मिलीलीटर टीका लगानाएड के साथ 50 मिलीग्राम / kanamycin और 100 मिलीग्राम / रिफैम्पिसिन की मिलीलीटर, 10 मिमी एमईएस पीएच 5.6 मिलीग्राम और 100 मिमी Erlenmeyer कुप्पी की 250 मिलीलीटर में संस्कृति का एक मिलीलीटर के साथ 16 घंटे के लिए 28 पर acetosyringone ° 250 RPM में कक्षीय हिलनेवाला पर सी .
- दिन 5: संस्कृति स्थानांतरण (जब 600 आयुध डिपो 1.0 पर पहुंच गया है) 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ओक रिज ट्यूब या बाँझ फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 5000 rpm पर 10 मिनट के लिए
- 10 मिमी 2 MgCl और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर में गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 5000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए भंग करने के लिए, इस कदम एक और एंटीबायोटिक का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के समय को दोहराएँ.
- 10 मिलीलीटर 10 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी एमईएस (5.6 पीएच) युक्त बफर में गोली निलंबित.
- आयुध डिपो को मापने के BMV एक शाही सेना, शाही सेना के 2 और 3 शाही सेना की प्रत्येक संस्कृति के लिए 600 और 0.1 600 आयुध डिपो को समायोजित 10 मिमी 2 MgCl और 10mM एमईएस (5.6 पीएच) का उपयोग.
- 1 मिलीलीटर प्रत्येक तीनों 0.1 आयुध डिपो 600 संस्कृति निलंबन मिश्रण.
- Acetosyringone की 100 मिमी, मिश्रण सज्जन जोड़ेंऔर ly और मिश्रण undisturbed 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखने.
- 1 मिलीलीटर में संस्कृति निलंबन ड्रा. सुई और सिरिंज के बिना.
- शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला पक्ष में 2-3 एन की अच्छी तरह से विस्तार पत्तियों के ऊपर संस्कृति निलंबन घुसपैठ धीरे शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला सतह की पत्ती की एक आधा करने के लिए सिरिंज दबाकर benthamiana (5 चरण पत्तियों, 3-4 हफ्ते पुरानी पौधों).
- अन्य पत्तियों को इस घुसपैठ प्रक्रिया को दोहराएँ.
- ग्रीन हाउस में 24 डिग्री सेल्सियस के साथ घुसपैठ पौधों रखें
- फसल 4 दिनों के बाद घुसपैठ (डीपीआई) 3 पत्तियों घुसपैठ.
3. BMV virions की शुद्धि
- एन लीजिए benthamiana एक तीनों जंगली प्रकार BMV agrotransformants युक्त मिश्रण के साथ agroinfiltrated छोड़ देता है.
- 0.08 एम MgAc, 4.5 पीएच और β-mercaptoethanol के 1/100 मात्रा है जो करने के लिए बस का उपयोग करने से पहले जोड़ा जा रहा है, BMV निष्कर्षण बफर (0.5 एम राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद (w / v) की बराबर मात्रा के साथ एक बाँझ मूसल और मोर्टार में पत्तियों को पीस) 3. वायरस उपज को अधिकतम करने के लिए, यह एसिड धोया रेत (~ 0.5-1 ग्राम) कि पीस आसान और कुशल सेल व्यवधान की सुविधा जोड़ने के लिए सिफारिश की है.
- मलमल कपड़े के 2-3 परतों के माध्यम से पत्ती निकालने फ़िल्टर और घबराहट इकट्ठा करने.
- फिर से पत्ती सामग्री की प्रारंभिक वजन के BMV निष्कर्षण बफर की बराबर मात्रा के साथ मलमल के कपड़े पर बनाए रखा भाग पीस.
- मलमल कपड़े का उपयोग निस्पंदन प्रक्रिया दोहराएँ. ये कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना चाहिए
- एक अपकेंद्रित्र ट्यूब छानना समाधान स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पूर्व ठंडा क्लोरोफॉर्म और भंवर की बराबर मात्रा (या शेक) तक निलंबन का रंग हल्के हरे रंग बदल जाता है.
- Emulsified समाधान अपकेंद्रित्र 12,000 RPM में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
- जलीय चरण लीजिए और चुंबकीय दोषी पर 30 मिनट के लिए किसी भी अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए हलचल.
- निलंबन करने के लिए एक बाँझ ultracentrifuge ट्यूब स्थानांतरण.
- 4 बजे के Beckman ultracentrifuge में 3 घंटे के लिए 30,000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और BMV निलंबन बफर की वांछित मात्रा में गोली निलंबित (के बाँझ आसुत पानी के साथ 1/10 निलंबन बफर पतला BMV निष्कर्षण बफर तैयार).
- आंशिक रूप से उपरोक्त कदम से शुद्ध virion तैयारी २८,००० rpm पर 150 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-40% sucrose के घनत्व ढाल centrifugation के अधीन है
- वायरस बैंड लीजिए या तो स्वयं या एक fractionator द्वारा. वायरस बैंड सफेद रोशनी रोशनी के तहत नीले दिखाई देगा.
- Sucrose के वायरस नमूना वायरस निलंबन बफर के साथ कम से कम 50% से युक्त समाधान जलमिश्रित.
- पतला वायरस युक्त sucrose के समाधान अपकेंद्रित्र के Beckman ultracentrifuge में 30,000 rpm पर 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
- अंत में वीर की वांछित मात्रा में अत्यधिक शुद्ध वायरस गोली निलंबितहमें बफर निलंबन.
- Virion (मिलीग्राम / एमएल) 260 आयुध डिपो में स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपयोग की एकाग्रता को मापने.
नोट: शाही सेना सामग्री के आधार पर, BMV के लिए विलुप्त होने गुणांक 4 5 है.
- मंदिर के तहत देखने virions की शुद्धता की पुष्टि करें (छवि एक)
4. इन विट्रो विधानसभा में प्रोटीन capsid सब यूनिटों के लिए तैयारी
- 5 1x वायरस हदबंदी बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 1.0 मिमी EDTA के 1.0 मिमी डीटीटी और 0.5 मिमी PMSF 0.5 एम 2 CaCl) के 1 लीटर तैयार.
- Sambrook एट अल 6 के अनुसार डायलिसिस झिल्ली तैयार करते हैं.
- एक डायलिसिस बैग में वायरस शुद्ध आवश्यक एकाग्रता बांटना.
- एक 1x वायरस हदबंदी बफर वाले बीकर में वायरस युक्त डायलिसिस बैग रखें.
- 4 ° सी whil में 24 घंटे Dialyzeई सरगर्मी.
- 4 में 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर 24 घंटे और अपकेंद्रित्र बाद डायलिसिस बैग से समाधान ले लीजिए डिग्री सेल्सियस यह अलग virions के BMV शाही सेना से अलग कर देगा.
- सतह पर तैरनेवाला और 4 ° सी गोली के लिए किसी भी वायरस संयुक्त राष्ट्र अलग कण में 3 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र के Beckman अपकेंद्रित्र में 35,000 rpm पर लीजिए.
- सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
- इस स्तर पर यह जरूरी है अलग प्रोटीन capsid सब यूनिटों से किसी भी contaminating के virion शाही सेना को हटाने के लिए. ऐसा करने के लिए, चरण 8 से सतह पर तैरनेवाला जोड़ने के बिना किसी भी शाही सेना (आरएनए 1x विधानसभा बफर में, नीचे देखें) एक उच्च गति centrifugation (3 में घंटे के लिए 30,000 rpm के बाद अधिक प्रोटीन capsid सब यूनिटों का दुबारा जोड़ना रात के दूसरे दौर के अधीन किया जाना चाहिए 4 ° C) किसी भी इकट्ठे virions गोली. इस दुबारा जोड़ना कदम के बाद, सतह पर तैरनेवाला युक्त कोट प्रोटीन किसी भी अवशिष्ट contaminating के शाही सेना के लिए स्वतंत्र होगा. हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए, यह सलाह दी जाती है ध् में एक अतिरिक्त प्रदर्शनदुबारा जोड़ना itro केवल कोट प्रोटीन शाही सेना 1x विधानसभा बफर का उपयोग कर सब यूनिटों के साथ. दुबारा जोड़ना रात से अधिक के बाद, तैयारी इकट्ठे virions से मुक्त हो मंदिर का उपयोग करते हुए सत्यापित चाहिए.
- आयुध डिपो 254 और 280 एनएम पर मापने के द्वारा या ब्रैडफोर्ड परख के रूप में अन्य विधियों द्वारा capsid प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
- 12-15% पश्चिमी धब्बा द्वारा पीछा करने के लिए अलग capsid प्रोटीन सब यूनिटों की अखंडता को निर्धारित एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन करते हैं.
5. शाही सेना के इन विट्रो विधानसभा में virions युक्त
- शाही सेना virions में फिर से इकट्ठा किया जा टेप तैयार है और एकाग्रता की गणना 7.
- Capsid प्रोटीन मिश्रण और 01:05 (wt / wt) 5 के अनुपात में शाही सेना प्रतिलेख.
- एक डायलिसिस बैग के ऊपर मिश्रण बांटना और ठीक करने के लिए किसी भी लीक से बचने के लिए सुरक्षित है.
- १,००० मिलीलीटर तैयार. 5 शाही सेना 1x विधानसभा बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल, 7.2 पीएच,; 10 मिमी KCl 5 मिमी MgCl 2, 1.0 मिमी डीटीटी 50 मिमी NaCl).
- डायलिसिस 1x विधानसभा बफर के खिलाफ बीकर में प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त बैग रखें और हलचल.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल सरगर्मी से 24 घंटे के लिए फिर से विधानसभा प्रतिक्रिया Dialyze.
- डायलिसिस के बैग से 24 घंटे के बाद मिश्रण और लीजिए आरएनए विधानसभा बफर की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- इस मिश्रण में 30 मिनट के लिए कम गति (2,000 XG) पर centrifuging द्वारा एक Centricon 100 स्तंभ के माध्यम से गुजरती हैं.
- स्तंभ एक बार विधानसभा बफर के 1.5 मिलीग्राम के साथ 30 मिनट के लिए धो 4 डिग्री सेल्सियस पर.
- ऊपर धोने कदम दो बार दोहराएँ.
- अंत में, 10,000 जी पर centrifugation द्वारा फिर से इकट्ठा virions 4 में elute ° 5 मिनट के लिए सी.
- आयुध डिपो 260 एनएम virion एकाग्रता का अनुमान है.
6. ऑप्टिकल वायरल भूत का निर्माण (OVGs)
- वांछित एकाग्रता अनुपात (हरे और capsid की इस रिपोर्ट में प्रयुक्त प्रोटीन Indocyanine वजन अनुपात 1:10 था) में शुद्ध प्रोटीन capsid (भारतीय तट रक्षक) हरी 8 एक Indocyanine में जोड़ें pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए capsid और OVG विधानसभा बफर (1 मिमी डीटीटी, pH4.8, 50 मिमी राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद, 1 मिमी EDTA के 1 एम NaCl) के खिलाफ भारतीय तट रक्षक समाधान के प्रोटीन Dialyze.
- 24 घंटे के बाद, डायलिसिस (12 केडीए ध्यान में लीन होना आकार) बैग और अपकेंद्रित्र से 4 बजे +९०,००० आरपीएम पर समाधान इकट्ठा 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस (छवि बी)
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और vortexing या 4 डिग्री सेल्सियस पर यह खुद के द्वारा BMV निलंबन रातोंरात बफर में निलंबित करने के लिए अनुमति देता है के द्वारा BMV निलंबन बफर में गोली निलंबित
- मंदिर (छवि सी) द्वारा OVGs की आकारिकी सत्यापित करें.
- 240 एनएम से 950 एनएम का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (50 Cary, Varian इंक) को मापने के absorbance के, भारतीय तट रक्षक की उपस्थिति में हस्ताक्षर 700 एनएम और 790 एनएम आठ के आसपास चोटियों absorbance के द्वारा पुष्टि की है. (छवि डी)
- ~ 700 एनएम और ~ 800 एनएम पर ठेठ भारतीय तट रक्षक प्रतिदीप्ति चोटियों OVG समाधान के 620 एनएम उत्तेजना spectrofluorometer (छवि डी) (3 Fluorolog, Jobin - Yvon) पर देखा जा सकता है.
आंकड़ा ए मंदिर छवि नकारात्मक दाग BMV एन से शुद्ध virions इस तीनों जंगली प्रकार BMV agroconstructs (पैमाने बार = 100 एनएम) के एक मिश्रण के साथ benthamiana पौधों agroinfiltrated.
इन विट्रो में चित्रा बी गोली युक्त OVGs भारतीय तट रक्षक उच्च गति centrifugation के बाद इकट्ठे हुए.
आंकड़ा सी. मंदिर छवि नकारात्मक दाग भारतीय तट रक्षक युक्त OVGs (पैमाने बार = 100 एनएम).
OVGs का आंकड़ा डी. (शीर्ष) absorbance और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (नीचे). उत्तेजना OVG उत्सर्जन w के लिए इस्तेमाल किया तरंगदैर्ध्य620 एनएम के रूप में.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत agroinfiltration दृष्टिकोण व्यापक रूप से संयंत्र वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण की एक बानगी की सुविधा एक ही सेल एक प्रमुख दोष आमतौर पर नियमित रूप से इस्तेमाल संयंत्र वायरस के यांत्रिक टीका के साथ जुड़े कई agroconstruct का वितरण सिंक्रनाइज़ है vivo में इन विट्रो विधानसभा एक मॉडल के रूप में Brome मोज़ेक वायरस का उपयोग करते हुए अध्ययन में कुशलता से आयोजित किया जा सकता है. निम्नलिखित एन के सफल घुसपैठ के लिए कुछ सुझावों (मैं) benthamiana पत्ते, घुसपैठ से पहले 24 घंटे के लिए पानी नहीं पौधों नहीं है, (ii) Agrobacterium निलंबन संस्कृति रिक्त स्थान में intracellular आसानी से फैल, अगर घुसपैठ 4-5 बजे के बीच प्रदर्शन किया गया है, (iii) संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व अधिक नहीं होनी चाहिए आयुध डिपो में 600 1.0. उच्च सेल घनत्व के साथ agrocultures की घुसपैठ सेल विषाक्तता और पत्ती 9,10 वार्धक्य कि गंभीर रूप से वायरल प्रतिकृति और बाद में virion को प्रभावित कर सकता है प्रेरित करने के लिए जाना जाता हैगठन, (iv) पत्ती के पत्ते को व्यापक क्षति है, जो संयंत्र में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर हो सकता है को रोकने के शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला पक्ष पर घुसपैठ कोमल दबाव के दौरान लागू किया जाना चाहिए, (v) Sucrose घनत्व 10% से 40% करने के लिए ढाल बनाया जा सकता है BMV निलंबन बफर में sucrose के 25% (सर्वोच्च एकाग्रता और सबसे कम एकाग्रता जोड़ने और यह 2 से विभाजित यानी, 10% 40% / 2 = 25% +) और तुरंत 2 के लिए -80 ° सेल्सियस पर स्थिर बनाने के द्वारा एक ट्यूब में -4 घंटा और आगे sucrose के धीरे धीरे एक सीधे स्थिति में यह डिग्री सेल्सियस 4 में रात भर रखकर गल के लिए अनुमति देता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों उनके बहुमूल्य सुझावों के लिए agroinfiltration के विकास में और इन विट्रो विधानसभा assays में प्रयोगशाला के कई सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. इस अध्ययन भागों में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CBET 1,144,237) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES Sodium salts | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| Indocyanine green | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Model: L8-70M | |
| Centricon-100 column | EMD Millipore | YM-100 | |
| Spectrophotometer | Varian, Inc. | Part number 10068900 | |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
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