Semplice e robusta In vivo E In vitro per lo Studio Assemblea Virus

Summary

Un modo semplice, efficace e robusto per sincronizzare l'erogazione di più componenti virali di cellule vegetali tramite

Abstract

In positivo-virus con RNA genomi senso patogeno per gli esseri umani, animali e piante, incapsidazione progenie in virioni maturi e stabili è una fase cardinale durante la creazione di infezione in un determinato host. Di conseguenza, lo studio delle incapsidazione decifra le informazioni riguardanti il ​​know-how del meccanismo di regolazione di assemblaggio del virus per formare virioni infettivi. Tale informazione è di vitale importanza nella formulazione di nuovi metodi di arginare diffusione del virus e il controllo delle malattie. Incapsidamento Virus possono essere studiati in vivo e in vitro. Incapsidazione Genoma in vivo è un processo altamente regolato selettiva che le interazioni macromolecolari e compartimentazione subcellulare. Pertanto, lo studio porta a sezionare gli eventi che comprendono incapsidazione virus in vivo avrebbe fornito le conoscenze di base per comprendere come i virus proliferano e assemblare. Recentemente incapsidazione in vitro è stata sfruttata per la ricerca nel campo della biomedica imaging e applicazioni terapeutiche. Non capsulati virus delle piante stanno molto più avanti nella joint venture di incapsidazione in vitro del materiale caricato negativamente straniera. Virus del mosaico Brome (BMV), privi di involucro multicomponente RNA virus patogeno per le piante, è stato utilizzato come sistema modello per lo studio confezionamento genoma in vivo e in vitro. Per i saggi di incapsidamento in Nicotiana benthamiana, mediata da Agrobacterium espressione transiente, si riferiscono come agroinfiltration, è una tecnica efficiente e robusto per la consegna sincronizzata e l'espressione di più componenti alla stessa cella. In questo approccio, una sospensione di cellule di Agrobacterium tumefaciens che trasportano binari vettori plasmidici che trasportano cDNA di mRNA desiredviral è infiltrata nella foglia spazio intercellulare withina utilizzando niente di più sofisticato di una siringa monouso da 1 ml (senza ago). Questo processo determina il trasferimento di inserto di DNA nelle cellule vegetali, il T-DNAInserto rimane transitoriamente nel nucleo e viene quindi trascritto dall'host polimerasi II, con conseguente espressione transiente. La trascrizione mRNA risultante (livellata e poliadenilato) viene poi esportato nel citoplasma per la traduzione. Dopo circa 24 a 48 ore di incubazione, sezioni di foglie infiltrati possono essere prelevati per le analisi biochimiche microscopyor. Agroinfiltration permette grandi numeri (centinaia di migliaia) di cellule trasfettate da simultaneamente. Per incapsidazione in vitro, virioni purificati di BMV sono dissociate in proteina del capside di dialisi contro tampone di cloruro di calcio dissociazione contenente seguita dalla rimozione di RNA e non-virioni dissociate mediante centrifugazione. Genome subunità proteiche del capside impoverito vengono poi riassemblati con desiderati componenti del genoma virale o non virale componenti come indocianina colorante.

Protocol

1. Materiale vegetale

1. Nicotiana benthamiana da utilizzare nel saggio incapsidamento dovrebbe essere a 4 fase foglie (piante settimane circa 3-4 anni).

2. La consegna e l'espressione di componenti funzionali del genoma virale di piantare cellule agroinfiltration

1. Giorno 1: Il ceppo di Agrobacterium (es. EH 105 o GV 3101) ospitante il pCass BMV-1 RNA, RNA BMV 2 e 3 ^1,2 BMV RNA sono coltivate su piastre di agar LB integrato con 50 mg / ml di kanamicina (seleziona per il vettore pCASS) e 100mg/ml di rifampicina (seleziona per l'Agrobacterium). L'incubazione viene effettuata a 28 ° C per due giorni.
2. Giorno 3: Seminare singola colonia dalla piastra di LB agar in 2 ml di brodo LB contenente 50 mg / ml di kanamicina e 100 mg / ml di rifampicina per 1 giorno a 28 ° C in agitatore orbitale impostata a 250 RPM.
3. 4 ° giorno: Inoculare 50 ml del supplemento brodo LBed a 50 mg / ml di kanamicina e 100 mg / ml di rifampicina, 10 mM MES pH 5,6 100 mM e acetosiringone con un ml di coltura in 250 ml di beuta per 16 ore a 28 ° C su agitatore orbitale a 250 rpm .
4. Giorno 5: Trasferire la cultura ₍₆₀₀ OD, quando ha raggiunto 1,0) ad un tubo di Oak Ridge o sterile provetta Falcon e centrifugare per 10 minuti a 5000 rpm a 4 ° C.
5. Sciogliere il pellet in 10 ml di 10 mM MgCl ₂ e centrifugare per 10 minuti a 5000 giri a 4 ° C, Ripetere questa fase una volta per assicurare la rimozione completa del antibiotico.
6. Sospendere il precipitato in 10 ml di tampone contenente 10 mM MgCl ₂ e 10 mM MES (pH 5,6).
7. Misurare la OD ₆₀₀ per ogni coltura di BMV 1 RNA, RNA 2 e 3 RNA e regolare a 0,1 OD ₆₀₀ utilizzando 10 mM MgCl ₂ e 10 mM MES (pH 5,6).
8. Miscelare 1 ml ciascuno tutti e tre 0.1 OD ₆₀₀ sospensioni cultura.
9. Aggiungere 100 mM di acetosiringone, mix gentmente e mantenere la miscela indisturbato a temperatura ambiente per 3 ore.
10. Disegnare la sospensione cultura in 1 ml. siringa senza ago.
11. Infiltrati la sospensione di sopra della cultura nel lato abassiale di 2-3 ben espanse foglie di N. benthamiana (5 foglie di scena, le piante 3-4 settimane di età) premendo delicatamente la siringa alla metà della superficie della foglia abassiale.
12. Ripetere questa procedura per infiltrazioni altre foglie.
13. Mantenere le piante infiltrati nella casa verde con 24 ° C.
14. Harvest infiltrato foglie 3 o 4 giorni dopo l'infiltrazione (dpi).

3. Purificazione di virioni BMV

1. Raccogliere N. benthamiana lascia agroinfiltrated con una miscela contenente tutti e tre di tipo selvatico agrotransformants BMV.
2. Macinare foglie in un mortaio e pestello sterile con un volume uguale (w / v) di estrazione tampone BMV (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 e volume 1/100 di β-mercaptoetanolo, che deve essere aggiunto appena prima dell'uso) ^3. Per massimizzare la resa virus, si raccomanda di aggiungere sabbia lavata acido (~ 0.5-1 g) che facilita la distruzione cellulare semplice macinazione ed efficiente.
3. Filtrare l'estratto di foglie con 2-3 strati di panno di mussola e raccogliere la raffica.
4. Ancora macinare la porzione di trattenuta sul panno di mussola con un volume uguale di tampone di estrazione BMV al peso iniziale di materiale fogliare.
5. Ripetere la procedura di filtrazione con un panno di mussola. Questa procedura deve essere condotta a 4 ° C.
6. Trasferire la soluzione filtrato in un tubo da centrifuga e aggiungere uguale volume di pre-vortice e refrigerati cloroformio (o shake) per 5 minuti alla temperatura ambiente fino al colore della sospensione diventa verde chiaro.
7. Centrifugare emulsionato per 15 minuti a 12.000 RPM a 4 ° C.
8. Raccogliere la fase acquosa e mescolare per 30 minuti su agitatore magnetico per rimuovere ogni residuo di cloroformio.
9. Trasferire la sospensione in una provetta sterile ultracentrifuga.
3.
10. Centrifugare a 30.000 rpm per 3 ore in una ultracentrifuga Beckman a 4 ° C.
11. Eliminare il supernatante e sospendere il pellet nel volume desiderato di tampone sospensione BMV (per preparare tampone diluita sospensione BMV tampone di estrazione a 1/10 con acqua distillata sterile).
12. La preparazione virione parzialmente purificato dal passo precedente viene sottoposto a centrifugazione in gradiente di 10-40% di densità di saccarosio per 150 min a 28000 rpm a 4 ° C.
13. Raccogliere il gruppo virus manualmente o da un frazionatore. La band virus apparirà blu sotto illuminazione a luce bianca.
14. Diluire la soluzione di saccarosio contenente campione di virus almeno il 50% con tampone virus sospensione.
15. Centrifugare diluita virus contenente una soluzione di saccarosio per 3 ore a 30.000 rpm in una ultracentrifuga Beckman a 4 ° C.
16. Infine sospendere il altamente purificate pellet in un volume desiderato di virci sospensione tampone.
17. Misurare la concentrazione del virione (mg / ml) mediante spettrofotometro a OD _260.

Nota: in base al contenuto di RNA, il coefficiente di estinzione per la BMV è 5 ^4.

19. Verificare la purezza di virioni con la visualizzazione in TEM (Fig. A)

4. Preparazione di subunità proteiche del capside di assemblaggio in vitro

1. Preparare 1 litro di tampone di dissociazione 1x virus (0,5 M di CaCl _2, 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT e 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Preparare membrana di dialisi secondo Sambrook et al ^6.
3. Dispensare concentrazione richiesta del virus purificato in un sacchetto di dialisi.
4. Posizionare il sacchetto contenente dialisi virus in un becher contenente il virus 1x tampone di dissociazione.
5. Dializzare 24 ore a 4 ° C whille e agitazione.
6. Raccogliere la soluzione dalla sacca dialisi dopo 24 ore e centrifugare a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Ciò separare il RNA BMV dai virioni dissociate.
7. Raccogliere il supernatante e centrifugare a 35.000 rpm in centrifuga Beckman per 3 ore a 4 ° C a pellet un non-dissociato particella virale.
8. Raccogliere il surnatante.
9. In questa fase è indispensabile per rimuovere eventuali contaminanti RNA virioni dissociate da subunità proteiche del capside. A tale scopo, il supernatante dal passaggio 8 devono essere sottoposti ad un altro ciclo di notte su riassemblaggio di subunità proteiche capside senza aggiungere alcun RNA (in tampone RNA 1x assemblaggio, vedi sotto) seguito da una centrifugazione ad alta velocità (30.000 rpm per 3 ore a 4 ° C) a pellet eventuali virioni assemblati. Dopo questa fase di rimontaggio, il surnatante contenente subunità proteiche cappotto sarebbe priva di RNA residui contaminanti. Tuttavia, per assicurare questo, è consigliabile eseguire un ulteriore vitro rimontaggio con subunità solo proteina di rivestimento utilizzando RNA tampone di montaggio 1x. Dopo una notte rimontaggio, la preparazione deve essere privo di virioni assemblati (verificare con TEM).
10. Determinare la concentrazione di subunità proteiche capside misurando OD 254 e 280 nm o da altri metodi come saggio Bradford.
11. Eseguire 12-15% SDS-PAGE seguita da Western blot per determinare l'integrità delle subunità dissociate proteina del capside.

5. In vitro montaggio di RNA contenente virioni

1. Preparare trascritti di RNA di essere ri-assemblati in virioni e calcolare la concentrazione ^7.
2. Mescolare subunità proteina del capside e RNA trascritto in un rapporto di 1:5 (peso / peso) ^5.
3. Versare il composto sopra un sacchetto di dialisi e adeguatamente sicuro per evitare eventuali perdite.
4. Preparare 1000 ml. di RNA 1x tampone di montaggio (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Posizionare il sacchetto di dialisi contenente la miscela di reazione contro il tampone di montaggio 1x nel bicchiere e mescolate.
6. Dializzare il riassemblaggio reazione a 4 ° C per 24 ore di agitazione.
7. Raccogliere la miscela dalla sacca dialisi dopo 24 ore e aggiungere 1,5 ml di tampone RNA montaggio.
8. Passare tale miscela attraverso una colonna Centricon-100 mediante centrifugazione a bassa velocità (2.000 xg) per 30 minuti.
9. Lavare la colonna volta con 1,5 ml di tampone gruppo a 4 ° C per 30 min.
10. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio due volte.
11. Infine, eluire i ri-assemblati virioni mediante centrifugazione a 10.000 g a 4 ° C per 5 min.
12. Stimare la concentrazione virione a OD 260 nm.

6. Fabbricazione di ottiche Ghosts virali (OVGs)

1. Aggiungere verde indocianina (ICG) ⁸ per la proteina purificata capside a rapporto di concentrazione desiderata (il rapporto in peso di proteina verde indocianina e capside usato in questa relazione è stata 1:10) uno d mescolare accuratamente pipettando.
2. Dializzare la proteina del capside e soluzione ICG contro il tampone gruppo OVG (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA, e 1 mM DTT, pH4.8) a 4 ° C per 24 ore.
3. Dopo 24 ore, raccogliere la soluzione dalla sacca di dialisi (12 kDa dimensione dei pori) e centrifugare a 90.000 rpm per 1 ora a 4 ° C (Fig. B)
4. Rimuovere il surnatante e sospendere la risospeso nel tampone sospensione BMV vortexando o permettendogli di sospensione per sé in sospensione tampone BMV notte a 4 ° C.
5. Verificare la morfologia del OVGs da TEM (Fig. C).
6. Misurare l'assorbanza da 240 nm a 950 nm con spettrofotometro (Cary 50, Varian Inc.), la presenza di ICG è confermata dalla firma picchi di assorbanza circa 700 nm e 790 nm ^8. (Fig. D)
7. I tipici picchi ICG fluorescenza a ~ 700 nm e ~ 800 nm può essere visto su 620 nm di eccitazione della soluzione OVG (Fig. D) con spettrofluorimetro (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> 7. rappresentativi Risultati

Figura A. immagine TEM di colorazione negativa BMV virioni purificati da N. benthamiana agroinfiltrated con un misto di tutte e tre le agroconstructs wild type BMV (barra della scala = 100 nm).

Figura B. di pellet in vitro assemblato ICG OVGs contenenti dopo centrifugazione ad alta velocità.

Figura C. immagine TEM di colorazione negativa OVGs contenenti ICG (barra della scala = 100 nm).

Figura D. Assorbanza (Top) e la fluorescenza (in basso) spettri di OVGs. La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzato per OVG emissione wdi 620 nm.

Discussion

Agroinfiltration approccio qui presentate può essere ampiamente applicabile a un'ampia gamma di virus vegetali. Un elemento caratterizzante di questo approccio è sincronizzata consegna di molteplici agroconstruct alla stessa cella, un grave inconveniente comunemente associato solitamente usata inoculazione meccanica di virus vegetali. In vivo e in vitro studi di assemblaggio utilizzando virus del mosaico del bromo come modello può essere condotto in modo efficiente seguono alcuni suggerimenti. (i) per l'infiltrazione di successo di N. benthamiana foglie, non acqua le piante per 24 ore prima infiltrazione, (ii) coltura in sospensione di Agrobacterium sarebbe diffusa negli spazi intracellulari con facilità, se infiltrazione sono stati eseguiti tra 4-5 ore, (iii) La densità ottica della coltura non deve superare 1.0 OD a _600. Infiltrazione di agrocultures con maggiore densità cellulare è noto per indurre tossicità cellulare e la senescenza foglia di ^9,10 che potrebbe incidere seriamente sulle replicazione virale e la successiva virioneformazione, (iv) Durante infiltrazione leggera pressione deve essere applicato sul lato abassiale della foglia per evitare danni alla foglia, che può innescare la risposta immunitaria in pianta, (v) gradiente di densità di saccarosio dal 10% al 40% può essere fatta in un tubo rendendo 25% di saccarosio in tampone sospensione BMV (aggiungendo la concentrazione più alta e più bassa concentrazione e dividendolo per 2, cioè, 10% + 40% / 2 = 25%) e immediatamente congelare a -80 ° C per 2 hr -4 e consentendo inoltre il saccarosio scongelare lentamente tenendola notte a 4 ° C in una posizione diritta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21