Summary
를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한 방법
Abstract
인간, 동물과 식물, 자손의 encapsidation 성숙하고 안정적인 virions에 대한 긍정-센스 RNA의 genomes의 병원성과 바이러스에 주어진 호스트에있는 감염의 설립 중에 추기경 단계입니다. 따라서 encapsidation의 연구 노하우 전염성 virions를 형성하기 위해 바이러스 어셈블리를 조절 메커니즘에 관한 정보를 deciphers. 이러한 정보는 바이러스 확산과 질병 통제 curbing의 소설 방법을 공식화에 매우 중요합니다. 바이러스 encapsidation는 생체내 및 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 생체내의 게놈 encapsidation은 macromolecular 상호 작용과 subcellular compartmentalization 관련된 고도 규제를 선별하는 과정입니다. 따라서 생체내에서 바이러스 encapsidation를 포함한 이벤트가 바이러스 분아 따위에 의해 중식 및 조립 방법을 이해하는 기초 지식을 제공하는 해부하기 위해 선도적인 연구합니다. 최근 시험 관내 encapsidation에 생물 의학 IMA의 영역에서 연구에 악용되었습니다ging 및 치료 응용 프로그램입니다. 비 싸여 식물 바이러스 부정 청구 외국 재료의 시험 관내 encapsidation에의 투자에 앞서 서다. Brome의 모자이크 바이러스 (BMV), 식물 비 싸여 복수 RNA 바이러스 병원성는 생체내 및 시험 관내의 게놈 포장을 연구를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다. Nicotiana benthamiana 공장에서 encapsidation의 assays 들어, Agrobacterium-매개 과도 표현은, agroinfiltration처럼 보이겠 동일한 세포에 여러 구성 요소의 동기화된 전달과 표현에 대한 효율적이고 강력한 기술입니다. 이 접근법에서는 desiredviral mRNAs의 cDNAs 들고 이진 플라스미드 벡터를 나르는 Agrobacterium tumefaciens 전지의 정지 1 ML 일회용 주사기 (바늘없이)보다 더 정교한 아무것도 사용하지 세포 사이 공간 withina 잎으로 침입한다. 식물 세포로의 DNA 삽입의 전송에서 이러한 프로세스 결과, T-DNA인서트는 핵에 transiently 남아 후 호스트 중합 효소 II에 의해 베꼈는데되며, 과도 표현식로 이어지는. 결과 mRNA 성적 증명서는 (뒤덮힌 및 polyadenylated)가 번역을 위해 세포질에 수출되고 있습니다. 부화의 약 24~48시간 후 침투 나뭇잎 부분은 microscopyor 생화 학적 분석을위한 샘플 수 있습니다. Agroinfiltration 동시에 transfected되는 세포의 다수 (수백 수천까지)를 허용합니다. 시험 관내 encapsidation의 경우, BMV의 정화 virions는 원심 분리하여 RNA 및 취소 dissociated virions의 제거 다음에 분리 버퍼가 포함된 염화칼슘으로부터 dialyzing하여 capsid 단백질로 dissociated 있습니다. 게놈 소진 capsid 단백질 subunits 그런 다음 원하는 바이러스성 게놈 구성 요소 또는 염료 indocyanine 같은 비 바이러스성 구성 요소와 재조 립된다.
Protocol
1. 식물 재료
- encapsidation 분석에 사용되는 Nicotiana benthamiana 공장은 4 잎 무대 (약 3~4주 오래된 식물)에 있어야합니다.
2. 기능성 바이러스성 게놈 구성 요소의 전달 및 표현이 agroinfiltration하여 세포를 심는 방법
- 제 1 일 : Agrobacterium 변형 (예 : EH 105 또는 GV 3101) pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 BMV RNA 3 1,2를 숨겨주가 50 kanamycin의 MG / ML로 보충 LB 한천 플레이트에서 재배되는 (위해 선정 pCASS 벡터)와 rifampicin의 100mg/ml ()는 Agrobacterium을 위해 선택됩니다. 부화는 이틀 동안 28 ° C에서 실시되고있다.
- 3 일 : 50 밀리그램 / kanamycin 28 1 하루 100 밀리그램 / rifampicin의 ML ° 250 rpm으로 설정 궤도 흔드는에서 C의 ML이 포함된 LB의 국물 2 ML에 LB 한천 플레이트에서 접종 단일 군락.
- 4 일 : LB의 국물 보충의 50 ML의 예방에드는 50와 MG / kanamycin과 rifampicin 100 밀리그램 / ML, 10 MM MES 산도 5.6의 ML 100 MM은 28 16 시간 동안 Erlenmeyer 플라스크에 250 ML에 문화 중 하나를 ML로 acetosyringone ° 궤도 흔드는에서 C를 250 rpm으로 .
- 주 5 : 4 ° C.에서 5,000 rpm으로 10 분간 참나무 능선 튜브 또는 멸균 팔콘 튜브 및 원심 분리기로 (OD 600 1.0에 도달하면) 문화를 전송
- 이 단계에게 항생제의 완전한 제거를 보장하기 위해 한 번 더 반복, 4 ° C에서 5,000 rpm으로 10 분 동안 10 밀리미터 MgCl 2, 원심 분리기 10 ML에 펠릿를 해산.
- 10 밀리미터 MgCl 2와 10 밀리미터 MES (산도 5.6)가 포함된 10 ML 버퍼에 펠렛을 일시 중지합니다.
- BMV RNA 1, 2, RNA RNA 3 각 문화에 대해 OD 600 측정 및 10 밀리미터에게 MgCl 2와 10mM MES (산도 5.6)을 사용하여 0.1 OD 600으로 조정합니다.
- 한 ML 각 세 0.1 OD 600 문화 현탁액을 섞는다.
- acetosyringone 100 밀리미터, 믹스 신사 추가기껏해야 3 시간 동안 실온에서 혼합물은 그대로 유지.
- 한 ML에 문화 현탁액을 그립니다. 바늘없는 주사기.
- 북아 일로부터 2-3 잘 확장된 나뭇잎의 abaxial 측면으로 위의 문화 서스펜션 침투 부드럽게 잎의 abaxial 표면의 절반에 주사기를 눌러 benthamiana (5 단계 잎, 3-4주 오래된 식물).
- 다른 나뭇잎이 침투 절차를 반복합니다.
- 24 ° C.로 녹색 집 안에 침입 식물을 유지
- 수확은 4 일 게시물 침투 (DPI)에 잎이 3 침투.
3. BMV의 virions의 정제
- N.를 수집 benthamiana는 세 종류의 야생 BMV의 agrotransformants를 포함하는 혼합 가스로 agroinfiltrated 떠난다.
- 0.08 M MgAc, 산도 4.5 단 사용하기 전에 추가되어야하는 β-메르 캅 토 에탄올의 1백분의 1 볼륨, BMV 추출 버퍼 (0.5 M NaAc의 동일 부피 (W / V)로 멸균 유봉과 박격포의 잎을 갈아서) 3. 바이러스 수율을 최대화하기 위해, 그것은 분쇄 간단하고 효율적인 세포 파괴를 용이하게 산성 씻은 모래 (~ 0.5-1 G)를 추가하는 것이 좋습니다.
- 캘리코 천에로부터 2-3 레이어를 통해 잎 추출물을 필터링하고 단말마를 수집합니다.
- 다시 잎 소재의 초기 무게로 BMV 추출 버퍼의 동일한 볼륨 캘리코 천에 대한 유지 부분을 갈아서.
- 캘리코 헝겊을 사용하여 여과 절차를 반복합니다. 이 단계는 4 ° C.에 실시하여야한다
- 원심 튜브에 여과물 솔루션을 전송하고 정학의 색상이 밝은 녹색을 화나게 때까지 실온에서 5 분간 미리 냉장 클로로포름과 소용돌이 동등 볼륨 (또는 쉐이크)을 추가합니다.
- 4에서 12,000 rpm으로 15 분간 유화 솔루션을 원심 ° C.
- 수성 단계를 수집하고 잔류 클로로포름을 제거하는 마그네틱 활동가 30 분 동안 저어.
- 멸균 ultracentrifuge 관에 정지를 전송합니다.
- 4에서 Beckman의 ultracentrifuge에서 3 시간 동안 30,000 rpm으로 원심 ° C.
- 뜨는을 취소하고 (멸균 증류수 1 / 10으로 서스펜션 버퍼 묽은 BMV 추출 버퍼를 준비하는) BMV 서스펜션 버퍼의 원하는 볼륨으로 펠렛을 일시 중지합니다.
- 위의 단계에서 부분적으로 정화 virion 준비는 4 ° C.에서 28,000 rpm으로 150 분 동안 10~40%의 자당 밀도 구배 원심 분리를 받게됩니다
- 수동 또는 fractionator에 의한 바이러스 밴드를 수집합니다. 바이러스 밴드는 흰색 밝은 조명 아래에서 파란색으로 표시됩니다.
- 바이러스 서스펜션 버퍼로 적어도 50 %는 바이러스 샘플을 포함 자당 솔루션을 희석.
- 4에서 Beckman의 ultracentrifuge에서 30,000 rpm으로 3 시간 동안 희석 바이러스가 포함된 자당 용액을 원심 ° C.
- 마지막으로 비르 중 원하는 볼륨으로 높은 정화 바이러스 펠릿을 정지우리 정학 버퍼.
- OD 260에서 분광 광도계를 사용하여 virion (MG / ML)의 농도를 측정합니다.
참고 : RNA 내용을 바탕으로 BMV에 대한 흡광 계수가 5 4입니다.
- TEM 밑에 보면 virions의 순도 (그림)를 확인
4. 체외 조립에 대한 capsid 단백질 subunits의 작성
- 5 1X 바이러스 분리 버퍼 (; 50 MM 트리스 HCL, pH를 7.5; 1.0 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.0 밀리미터 DTT와 PMSF 0.5 MM 0.5 M CaCl 2) 1 리터를 준비합니다.
- Sambrook 외 6에 따라 투석 막을 준비합니다.
- 투석 주머니에 바이러스를 정제의 필요한 농도를 분배.
- 1X 바이러스 분리 버퍼를 포함 비커에 바이러스가 포함된 투석 주머니를 놓습니다.
- 4 ° C whil에서 24 시간 Dialyze전자 저어.
- 4에서 15 분에 해당하는 12,000 XG에 24 시간 원심 후 투석 가방에서 솔루션을 수집 ° C. 이것은 dissociated virions에서 BMV RNA를 분리합니다.
- 4 펠렛에 ° C에서 어떠한 취소 dissociated 바이러스 입자에서 3 시간 동안 Beckman의 원심 분리기에서 35,000 rpm으로 뜨는와 원심 분리기를 수집합니다.
- 표면에 뜨는를 수집합니다.
- 이 단계에서는 그것은 dissociated capsid 단백질 subunits로부터 오염 virion의 RNA를 제거하기 위해 필수적입니다. 이렇게하려면 8 단계에서 뜨는는 고속 원심 분리 (3 시간에서 30,000 RPM이어서 모든 RNA를 (RNA 1X 조립 버퍼에 아래 참조) 추가하지 않고 capsid 단백질 subunits의 reassembly여 야간의 또 다른 라운드를 받게됩니다 4 ° C) 펠릿 모든 조립 virions 있습니다. 이 reassembly 단계 후에 뜨는 포함 코트 단백질 subunits는 잔류 오염 RNA의 무료 것입니다. 그러나 이것을 위해, 그것은 V에 추가를 수행하는 것이 좋습니다reassembly RNA 1X 조립 버퍼를 사용하여 전용 코트 단백질 subunits로 itro. reassembly 밤이여 후 준비 (TEM을 사용하여 확인) 조립 virions 무료 여야합니다.
- OD 254 및 280 nm의에서 측정하여 또는 그러한 브래드 포드 분석과 같은 다른 방법에 의한 capsid 단백질 subunits의 농도를 결정합니다.
- 12~15% dissociated capsid 단백질 subunits의 무결성을 확인하는 서양 얼룩 이어 SDS-PAGE를 수행합니다.
5. RNA의 체외 조립에 virions를 포함하는
- virions로 다시 조립되는 RNA의 성적 증명서를 준비하고 집중 7을 계산합니다.
- capsid 단백질 subunits을 섞어서 1시 5분 (wt / wt) 5의 비율로 성적표를 알 엔.
- 투석 주머니에 상기 혼합물을 분배하고 적절하게 모든 누수를 피하기 위해 확보.
- 1000 ML을 준비합니다. 5 RNA 1X 조립 버퍼 (; 50 MM 트리스-HCL, pH를 7.2,, 10 MM KCl 5 밀리미터 MgCl 2, 1.0 밀리미터 DTT 50 MM NaCl)의.
- 비커에 1X 조립 버퍼에 대해 반응 혼합물을 포함하는 투석 가방을 놓고 저어.
- 부드럽게 저어하여 24 시간 동안 4 ° C에서 다시 조립 반응을 Dialyze.
- 24 시간 이내에 투석 주머니의 혼합물을 수집하여 RNA 조립 버퍼의 1.5 ML을 추가합니다.
- 30 분 동안 저속 (2,000 XG)에서 centrifuging하여 Centricon-100 컬럼을 통해이 혼합물을 전달합니다.
- 30 분 동안 4 ° C에서 어셈블리 버퍼의 1.5 ML로 한 칼럼을 씻으십시오.
- 두 번 이상 세척 단계를 반복합니다.
- 마지막으로, 4에서 1만그램에서 원심 분리하여 다시 조립 virions을 elute ° C를 5 분 동안.
- OD 260 nm의에서 virion 농도를 예상됩니다.
6. 광학 바이러스성 유령의 제조 (OVGs)
- 원하는 농도 비율 (이 보고서에 사용된 녹색과 capsid 단백질을 Indocyanine의 중량 비율이 1시 10분이었다)에서 정화 capsid 단백질로 녹색 (ICG) 8 Indocyanine 추가 d는 pipetting에 의해 철저하게 섞는다.
- 24 시간 동안 4 ° C에서 OVG 조립 버퍼 (1 밀리미터 DTT, pH4.8, 50 MM NaAc; 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 M NaCl)에 대한 capsid 단백질과 ICG 솔루션을 Dialyze.
- 24 시간 이내에, 4에서 1 시간 동안 90,000 rpm으로 투석 가방 (12 kDa 기공 크기)와 원심 분리기에서 솔루션을 수집 ° C (그림 B)
- 4 ° C.에 vortexing하거나 야간 BMV 서스펜션 버퍼에서 자체적으로 중단하도록 허용함으로써 뜨는을 제거하고 BMV 서스펜션 버퍼에 펠릿을 정지
- TEM (그림 C)에 의해 OVGs의 형태를 확인합니다.
- 240 NM에서 분광 광도계 (캐리 50, Varian 주식 회사)를 사용하여 950 nm의로 흡광도를 측정, ICG의 존재는 700 nm의 및 790 nm의 팔 주위 서명 흡광 봉우리가 확인된다. (그림 D)
- ~ 700 nm의와 ~ 800 nm의의 전형적인 ICG 형광 봉우리가 spectrofluorometer을 사용 OVG 솔루션의 620 나노미터 여기 (그림 D) (Fluorolog 3 Jobin-Yvon)시 볼 수 있습니다.
N.에서 정화 부정적인 스테인드 BMV의 virions의 그림 A. TEM 이미지 benthamiana 공장은 세 종류의 야생 BMV의 agroconstructs (스케일 바 = 100 nm의)의 혼합물로 agroinfiltrated.
체외에서의 그림 B. 펠렛은 고속 원심 분리에 따라 함유 OVGs을 ICG 조립.
부정적인 스테인드 ICG가 포함된 OVGs의 그림 C. TEM 이미지 (스케일 바 = 100 nm의).
OVGs의 그림 D.의 흡광도 (위쪽)과 형광 (아래) 스펙트럼. OVG 방출 w에 사용 여기 파장620 nm의 있습니다.
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Discussion
여기에 제시된 Agroinfiltration 접근 방식은 널리 식물 바이러스의 광범위한 적용이 될 수 있습니다. 이 방법의 특징 기능은 동일한 세포 - 일반적으로 식물 바이러스의 일상적으로 사용되는 기계적인 접종과 관련된 주요 단점에 여러 agroconstruct의 전송을 동기화됩니다. 생체내과 모델로 brome의 모자이크 바이러스를 이용한 체외 조립의 연구에에 의해 효율적으로 수행할 수 다음과 같은 몇 가지 팁.은 (i) 북아 일의 성공적인 침투를 위해 benthamiana이 침투하기 전에 24 시간 동안 물, 식물, 안 떠난다; 침윤이 4-5시 사이에 수행되었다 경우 (2) Agrobacterium 서스펜션 문화는 쉽게 세포 내 공간에 확산 것이다, (3) 문화의 광학 밀도를 넘지 않아야 OD 600에서 1.0. 높은 세포 밀도 agrocultures의 침투가 심한 바이러스성 복제 및 후속 virion에 영향을 미칠 수있는 세포 독성 및 잎 노화 9,10을 유발하는 것으로 알려져형성, (4) 침투 부드러운 압력 동안은 식물의 면역 반응을 발화시킬 수도 잎에 광범위한 손상을 방지하기 위해 잎사귀의 abaxial 측면에 적용해야, 10 %에서 40 % (V) 자당 밀도 구배을 만들 수 즉시 2 -80 ° C에서 동결 (최고 농도와 최저 농도를 추가하고 즉 10 % + 40% / 2 = 25 % 2로 그것을 나누어) BMV 서스펜션 버퍼에서 자당의 25 %를 제작하여 튜브에 -4 시간 및 추가로 자당이 연속 순위에서 4 ° C에서 그것이 하룻밤 사이에 유지하여 천천히 녹여 있도록합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자 agroinfiltration의 개발과 체외 조립 assays들의 소중한 제안에 대한 실험실의 몇몇 회원을 감사드립니다. 이 작품은 캘리포니아 대학에서 교부금에 의해 재정 지원되었다. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET-1144237)에서 교부금에 의해 부분에서 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES Sodium salts | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| Indocyanine green | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Model: L8-70M | |
| Centricon-100 column | EMD Millipore | YM-100 | |
| Spectrophotometer | Varian, Inc. | Part number 10068900 | |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L. Plant Virology Protocols. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
