Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

Summary

Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales mediante

Abstract

En los virus con ARN de sentido positivo genomas patógenos para los seres humanos, animales y plantas, la progenie de encapsidación en viriones maduros y estables es una fase de cardenal durante el establecimiento de la infección en un equipo dado. En consecuencia, el estudio de encapsidación descifra la información relativa a los conocimientos del mecanismo de regulación de ensamblaje del virus para formar viriones infecciosos. Dicha información es de vital importancia en la formulación de nuevos métodos de frenar la propagación del virus y control de la enfermedad. Encapsidación del virus puede ser estudiado in vivo e in vitro. Encapsidación del genoma en vivo es un proceso altamente regulado selectiva que implica interacciones macromoleculares y compartimentación subcelular. Por lo tanto, el estudio que lleva a diseccionar los acontecimientos que abarcan encapsidación del virus in vivo proporcionará los conocimientos básicos para comprender cómo los virus proliferan y se ensamblan. Recientemente, en la encapsidación in vitro ha sido explotada para la investigación en el área de la investigación biomédica imaging y aplicaciones terapéuticas. Virus no envueltos de plantas destacan muy por delante en la aventura de en la encapsidación in vitro de la materia con carga negativa externa. Virus de mosaico Brome (BMV), un no envueltos multicomponente patógeno virus ARN a las plantas, ha sido utilizado como un sistema modelo para estudiar embalaje genoma in vivo e in vitro. Para los ensayos de encapsidación en plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium expresión transitoria, se refieren como agroinfiltración, es una técnica eficaz y sólido para la entrega sincronizada y la expresión de varios componentes para la misma célula. En este enfoque, una suspensión de Agrobacterium tumefaciens que llevan las células binarias de vectores plásmidos portadores de ADNc de ARNm desiredviral se infiltra en el espacio intercelular de la hoja withina usando nada más sofisticado que el de una jeringa desechable de 1 ml (sin aguja). Este proceso resulta en la transferencia de inserción de DNA en células vegetales; el T-DNAinserto se mantiene transitoriamente en el núcleo y luego se transcribe por el huésped polimerasa II, que conduce a la expresión transitoria. La transcripción del ARNm resultante (nivelado y poliadenilado) luego se exporta al citoplasma para su traducción. Después de aproximadamente 24 a 48 horas de incubación, las secciones de hojas infiltradas pueden ser degustados por microscopyor análisis bioquímicos. Agroinfiltration permite una gran cantidad (cientos o miles) de las células para ser transfectadas de forma simultánea. Para en la encapsidación in vitro, los viriones purificados de BMV se disocian en proteína de la cápside por diálisis frente a tampón de cloruro de disociación que contiene calcio seguido de la eliminación de ARN y viriones no-disociados por centrifugación. Genoma subunidades de proteína de cápside empobrecido se vuelve a montar con los componentes deseados del genoma viral o no viral de componentes tales como indocianina.

Protocol

1. Material vegetal

1. Plantas de Nicotiana benthamiana para ser utilizados en el ensayo de encapsidación debe estar en fase 4 hojas (plantas semana aproximadamente 3-4 de edad).

2. Entrega y expresión de los componentes funcionales del genoma viral para sembrar las células por agroinfiltración

1. Día 1: La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, EH 105 o GV 3101) que alberga el ARN pCass-BMV 1, 2 y ARN BMV BMV ARN 3 ^1,2 se cultivan en placas de agar LB suplementadas con 50 mg / ml de kanamicina (selecciona para el vector pCASS) y 100mg/ml de rifampicina (selecciona para el Agrobacterium). La incubación se lleva a cabo a 28 ° C durante dos días.
2. Día 3: Se inoculan colonia única de la placa de agar LB en 2 ml de caldo LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de rifampicina durante 1 día a 28 ° C en un agitador orbital fijado en 250 RPM.
3. Día 4: Se inoculan 50 ml de caldo LB el suplementoed con 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de rifampicina, MES 10 mM pH 5,6 y 100 mM acetosiringona con un ml de cultivo en 250 ml de un matraz Erlenmeyer de 16 horas a 28 ° C en un agitador orbital a 250 rpm .
4. Día 5: Traslado de la cultura (OD _600, cuando llegó a 1,0) a un tubo de Oak Ridge o estéril tubo Falcon y se centrifuga durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C.
5. Disolver el precipitado en 10 ml de MgCl2 10 _mM y se centrifuga durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C, Repita este paso una vez más para asegurar la eliminación completa del antibiótico.
6. Suspender el precipitado en 10 ml de tampón conteniendo 10 mM de MgCl ₂ y 10 mM MES (pH 5,6).
7. Mida el diámetro exterior ₆₀₀ por cada cultura de la BMV ARN 1, 2 ARN y ARN 3 y ajustar a 0,1 OD ₆₀₀ con 10 mM de MgCl ₂ y 10 mM MES (pH 5,6).
8. Mezclar 1 ml de cada uno de los tres 0.1 OD ₆₀₀ suspensiones de cultivo.
9. Añadir 100 mM de acetosiringona, mezcla de detergentely y mantener la mezcla en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas.
10. Dibuje la suspensión de la cultura en 1 ml. una jeringa sin aguja.
11. Infíltrate en la suspensión del cultivo anterior en el lado abaxial de 2-3 hojas expandidas bien de N. benthamiana (5 hojas etapa, las plantas 3-4 semanas de edad) presionando suavemente la jeringa a una mitad de la superficie abaxial de la hoja.
12. Repita este procedimiento con la infiltración a otras hojas.
13. Mantenga las plantas se infiltraron en la casa verde con 24 ° C.
14. Cosecha infiltrado en las hojas de 3 a 4 días después de la infiltración (ppp).

3. La purificación de los viriones BMV

1. Recoger N. benthamiana deja agroinfiltradas con una mezcla que contiene los tres tipo salvaje agrotransformants BMV.
2. Moler las hojas en un almirez y mortero estéril con un volumen igual (w / v) de extracción BMV tampón (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 y el volumen 1/100 de β-mercaptoetanol que ha de ser añadido justo antes de su uso) ^3. Para maximizar el rendimiento del virus, se recomienda añadir arena lavada ácido (~ 0.5-1 g) que facilita la ruptura celular fácil de molienda y eficiente.
3. Filtrar el extracto de la hoja a través de 2-3 capas de tela de muselina y recoger la oleada.
4. Nuevamente moler la parte retenida en tela de muselina con un volumen igual de tampón de extracción BMV al peso inicial de material de hoja.
5. Repita el procedimiento de filtración con tela de muselina. Estos pasos deben llevarse a cabo a 4 ° C.
6. Transferir la solución de filtrado a un tubo de centrífuga y añadir volumen igual de pre-enfriada cloroformo y agitar (o batido) durante 5 minutos a la temperatura ambiente hasta que el color de la suspensión se vuelve de color verde claro.
7. Centrifugar la solución emulsionada durante 15 minutos a 12.000 rpm a 4 ° C.
8. Recoger la fase acuosa y se agita durante 30 minutos en un agitador magnético para eliminar cualquier cloroformo residual.
9. Transferir la suspensión a un tubo de ultracentrífuga estéril.
3.
10. Centrifugar a 30.000 rpm durante 3 horas en una ultracentrífuga Beckman a 4 ° C.
11. Se desecha el sobrenadante y suspender el pellet en volumen deseado de tampón de suspensión BMV (para preparar tampón de suspensión diluida BMV tampón de extracción a 1/10 con agua destilada estéril).
12. La preparación virión parcialmente purificada de la etapa anterior se somete a centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa 10-40% para 150 min a 28000 rpm a 4 ° C.
13. Recoger la banda de virus, ya sea manualmente o por un fraccionador. La banda de virus aparecen de color azul con iluminación de luz blanca.
14. Se diluye la solución de sacarosa que contiene muestras de virus por lo menos 50% con tampón de virus de la suspensión.
15. Centrifugar virus diluido que contenía solución de sacarosa durante 3 horas a 30.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman a 4 ° C.
16. Finalmente suspender el sedimento de virus altamente purificado en un volumen deseado de virnos suspensión de amortiguación.
17. Medir la concentración del virión (mg / ml) usando un espectrofotómetro a OD _260.

Nota: Basado en el contenido de ARN, el coeficiente de extinción para la BMV es 5 ^4.

19. Verifique la pureza de los viriones por ver en TEM (Fig. A)

4. Preparación de las subunidades de proteína de la cápside para montaje in vitro

1. Preparar 1 litro de tampón 1x virus de disociación (0,5 M CaCl _2; 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 1,0 mM de EDTA; 1,0 mM de DTT y 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Preparar membrana de diálisis de acuerdo con Sambrook et al ^6.
3. Dispensación concentración requerida de virus purificado en una bolsa de diálisis.
4. Coloque el virus que contiene la bolsa de diálisis en un vaso que contiene el virus 1x tampón de disociación.
5. Dializar 24 horas a 4 ° C whilagitación e.
6. Recoger la solución de la bolsa de diálisis después de 24 horas y centrifugar a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Esto separar el ARN BMV de los viriones disociados.
7. Recoger el sobrenadante y se centrifuga a 35.000 rpm en centrífuga Beckman durante 3 horas a 4 ° C para sedimentar la no-disociado partícula del virus.
8. Recoger el sobrenadante.
9. En esta etapa es imprescindible para eliminar los contaminantes del ARN del virión disociados subunidades de la proteína de cápside. Para hacer esto, el sobrenadante del paso 8 debe ser sometido a otra ronda de noche sobre el reensamblaje de las subunidades de proteína de la cápside sin añadir ningún ARN (ARN en 1x tampón de montaje, véase más adelante), seguido por una centrifugación a alta velocidad (30.000 rpm durante 3 horas a 4 ° C) para que sedimenten los viriones ensamblados. Después de este paso reensamblaje, el sobrenadante subunidades que contienen proteína de la cubierta estaría libre de cualquier ARN residuales contaminantes. Sin embargo, para asegurar esto, es conveniente realizar una adicional en vitro reensamblaje con sólo subunidades capa de proteínas utilizando ARN tampón ensamblado 1x. Después de un día para el montaje, la preparación debe estar libre de viriones ensamblados (verificar mediante TEM).
10. Determinar la concentración de las subunidades de proteína de la cápside midiendo a OD 254 nm y 280 o por otros métodos tales como ensayo de Bradford.
11. Realizar 12-15% de SDS-PAGE seguida por Western blot para determinar la integridad de las subunidades de la proteína de cápside disociados.

5. In vitro montaje de ARN que contiene viriones

1. Preparar las transcripciones de ARN para ser re-ensamblados en viriones y calcular la concentración ^7.
2. Mezclar subunidades cápside de proteínas y ARN transcrito en una proporción de 1:5 (peso / peso) ^5.
3. Dispense la mezcla anterior a una bolsa de diálisis y asegurar apropiadamente para evitar cualquier fuga.
4. Preparar 1.000 ml. de ARN 1x tampón de montaje (50 mM de NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,2; 10 mM de KCl; 5 mM de MgCl _2, 1,0 mM de DTT) ^5.
5. Coloque la bolsa de diálisis que contiene la mezcla de reacción frente a tampón de montaje 1x en el vaso y remover.
6. Dializar la reacción de re-ensamblaje a 4 ° C durante 24 horas por agitación suave.
7. Recoger la mezcla de la bolsa de diálisis después de 24 horas y añadir 1,5 ml de ARN tampón ensamblado.
8. Pase esta mezcla a través de un Centricon-100 en la columna por centrifugación a baja velocidad (2.000 xg) durante 30 minutos.
9. Lavar la columna una vez con 1,5 ml de tampón de montaje a 4 ° C durante 30 min.
10. Repita el paso por encima de lavado dos veces.
11. Finalmente, eluir los viriones de re-ensambladas por centrifugación a 10.000 ga 4 ° C durante 5 min.
12. Estimación de la concentración en el virión de DO 260 nm.

6. La fabricación de ópticas fantasmas virales (OVGs)

1. Añadir verde de indocianina (ICG) ⁸ a la proteína purificada cápside en el coeficiente de concentración deseada (la relación en peso de la proteína verde de indocianina y la cápside utilizada en este informe fue 1:10) una d mezclar bien con la pipeta.
2. Dializar la proteína de la cápside y la solución ICG contra el tampón de montaje OVG (1 M de NaCl; 50 mM de NaAc, 1 mM EDTA y DTT 1 mM, pH4.8) a 4 ° C durante 24 horas.
3. Después de 24 horas, recoger la solución de la bolsa de diálisis (12 kDa de tamaño de poro) y se centrifuga a 90.000 rpm durante 1 hora a 4 ° C (Fig. B)
4. Eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento en tampón de suspensión BMV por agitación o de lo que le permite suspender por sí misma en un tampón de suspensión de la BMV la noche a 4 ° C.
5. Verifique que la morfología de OVGs por TEM (Fig. C).
6. Medir la absorbancia de 240 nm a 950 nm utilizando un espectrofotómetro (Cary 50, Varian Inc.), la presencia de ICG es confirmado por los picos de absorción de la firma alrededor de 700 nm y 790 nm ^8. (Fig. D)
7. Los típicos picos de fluorescencia ICG a ~ 700 nm y ~ 800 nm se puede ver a la excitación de 620 nm de la solución de OVG (Fig. D), utilizando espectrofluorómetro (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> 7. Resultados representativos

Figura A. TEM imagen de viriones BMV tinción negativa purificados de N. benthamiana plantas agroinfiltradas con una mezcla de las tres de tipo salvaje agroconstructs BMV (barra de escala = 100 nm).

Figura B. Pellet in vitro montado ICG OVGs que contienen después de centrifugación a alta velocidad.

Figura C. TEM imagen de tinción negativa del ICG OVGs que contienen (barra de escala = 100 nm).

Figura D. Absorbancia (Arriba) y fluorescencia (abajo) los espectros de OVGs. La longitud de onda de excitación utilizados para OVG emisión wcomo 620 nm.

Discussion

Enfoque agroinfiltration que aquí se presenta ampliamente puede ser aplicable a una amplia gama de virus de plantas. Una característica distintiva de este enfoque se sincroniza la entrega de múltiples agroconstruct a la celda-un mismo inconveniente importante comúnmente asociada con la inoculación utiliza rutinariamente mecánica de virus de plantas. In vivo e in vitro en los estudios de montaje utilizando virus del mosaico del bromo como un modelo puede llevar a cabo eficientemente por siguientes consejos. (i) para la infiltración exitosa de N. benthamiana se va, no regar las plantas durante 24 horas antes de la infiltración, (ii) cultivo de Agrobacterium suspensión se extendería en los espacios intracelulares con facilidad, si la infiltración se realizaron entre las 04.05 pm, (iii) La densidad óptica de la cultura no debe exceder de 1,0 en OD _600. La infiltración de agrocultures con mayor densidad celular se sabe que inducen toxicidad celular y senescencia de la hoja ^9,10 que podría afectar gravemente a la replicación viral y posterior viriónformación, (iv) Durante presión infiltración suave debe ser aplicado en el lado abaxial de la hoja para evitar daños a la hoja, lo que podría desencadenar la respuesta inmune en planta, (v) gradiente de densidad de sacarosa del 10% al 40% se puede hacer en un tubo, haciendo 25% de sacarosa en tampón de suspensión BMV (mediante la adición de la concentración más alta y más baja concentración y dividiéndolo por 2, es decir, 10% + 40% / 2 = 25%) e inmediatamente se congelan a -80 ° C durante 2 h -4 y seguir permitiendo la sacarosa para descongelar lentamente por mantenerla durante la noche a 4 ° C en una posición recta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21