Enkel och robust In vivo Och In vitro Tillvägagångssätt för att studera Virus Assembly

Summary

En enkel, effektiv och robust sätt att synkronisera leveransen av multipla virala komponenter till växtceller genom

Abstract

I virus med positiv RNA-genom patogena för människor, djur och växter, avkomma inkapsling i mogna och stabila virioner är en kardinal fas under etablering av infektion i en given värd. Följaktligen dechiffrerar studie av inkapsling uppgifter om know-how av mekanismen reglera viruset församlingen att bilda infektiösa virioner. Sådan information är viktig att formulera nya metoder för att stävja virus sprids och sjukdomar. Virus inkapsling kan studeras in vivo och in vitro. Genome inkapsling in vivo är en starkt reglerad selektiv process där makromolekylära interaktioner och subcellulära uppdelningsåtgärder. Därför studerar vilket leder till dissekera händelser omfattar virus inkapsling in vivo skulle ge grundläggande kunskaper för att förstå hur virus förökar och montera. Nyligen in vitro inkapsling har utnyttjats för forskning inom området biomedicinsk imaGing och terapeutiska tillämpningar. Icke höljeförsedda växtvirus står långt fram i satsningen av in vitro inkapsling av den negativt laddade främmande material. Brome mosaikvirus (BMV), ett icke höljeförsedda multikomponent RNA-virus som är patogena för växter, har använts som ett modellsystem för att studera genomet förpackning in vivo och in vitro. För inkapsling analyser i Nicotiana benthamiana växter, Agrobacterium-medierad övergående uttryck, refererar till som agroinfiltration är en effektiv och robust teknik för den synkroniserade leverans och expression av flera komponenter till samma cell. I detta tillvägagångssätt är en suspension av Agrobacterium tumefaciens celler som bär binära plasmidvektorer som bär cDNA för desiredviral mRNA infiltreras i det intercellulära utrymmet withina blad med inget mer sofistikerat än en 1 ml engångsspruta (utan nål). Denna process resulterar i överföringen av DNA-insättningen i växtceller; den T-DNA-insatsen förblir transient i kärnan och därefter transkriberas av värden polymeras II, vilket leder till övergående uttryck. Den resulterande mRNA-transkript (tak och polyadenylerat) sedan exporteras till cytoplasman för översättning. Efter ungefär 24 till 48 timmars inkubation, kan sektioner av infiltrerade blad tas prov för microscopyor biokemiska analyser. Agroinfiltration medger ett stort antal (hundratals till tusentals) celler som skall transfekteras samtidigt. För in vitro inkapsidering, renade virioner av BMV dissocieras in kapsidprotein genom dialys mot dissociation buffert innehållande kalciumklorid, följt av avlägsnande av RNA och icke-differentierade virioner genom centrifugering. Genomet utarmade kapsidproteinet subenheter sedan ihop med önskade virala genomet komponenter eller icke-virala komponenter, såsom indocyanin färgämne.

Protocol

1. Växtmaterial

1. Nicotiana benthamiana växter ska användas i inkapsling analysen bör vara 4 blad stadium (ca 3-4 veckor gamla växter).

2. Leverans och expression av funktionella virala genomet komponenter till växtceller genom agroinfiltration

1. Dag 1: Agrobacterium-stam (t ex EH 105 eller GV 3101) härbärgerande pCass-BMV-RNA 1, BMV-RNA 2 och BMV-RNA 3 ^1,2 odlas på LB-agarplattor kompletterade med 50 mg / ml av kanamycin (selekterar för i pCASS vektor) och 100mg/ml av rifampicin (väljer för Agrobacterium). Inkuberingen utförs vid 28 ° C under två dagar.
2. Dag 3: Inokulera enda koloni från LB-agarplatta i 2 ml LB-buljong innehållande 50 mg / ml kanamycin och 100 mg / ml rifampicin under 1 dag vid 28 ° C i orbital skakanordning inställd på 250 varv per minut.
3. Dag 4: Ympa 50 ml av LB-buljong komplementED med 50 mg / ml kanamycin och 100 mg / ml rifampicin, 10 mM MES pH 5,6 och 100 mM acetosyringon med en ml kultur i en 250 ml Erlenmeyer-kolv under 16 timmar vid 28 ° C på rotationsskak vid 250 rpm .
4. Dag 5: Överföring av kulturen (när OD ₆₀₀ nådde 1,0) till en Oak Ridge-rör eller sterilt Falcon-rör och centrifugera i 10 minuter vid 5000 rpm vid 4 ° C.
5. Upplösa pelleten i 10 ml 10 _mM MgCl2 och centrifugera i 10 minuter vid 5000 RPM vid 4 ° C, upprepa detta steg en gång för att säkerställa fullständigt avlägsnande av antibiotikumet.
6. Suspendera pelleten i 10 ml buffert innehållande 10 _mM MgCl2 och 10 mM MES (pH 5,6).
7. Mäta OD ₆₀₀ för varje kultur av BMV-RNA 1, 2-RNA och RNA 3 och justera till 0,1 OD ₆₀₀ med användning av 10 _mM MgCl2 och 10 mM MES (pH 5,6).
8. Blanda 1 ml vardera alla tre 0,1 OD ₆₀₀ kultur suspensioner.
9. Tillsätt 100 mM acetosyringon, blanda gently och hålla blandningen ostörd vid rumstemperatur under 3 timmar.
10. Rita kulturen suspensionen i 1 ml. spruta utan nål.
11. Infiltrera ovanstående kulturen suspensionen i abaxiala sida 2-3 väl expanderade blad av N. benthamiana (5 blad etapp, 3-4 veckor gamla växter) genom att försiktigt trycka sprutan till hälften av abaxiala ytan av blad.
12. Upprepa denna infiltration förfarande till andra blad.
13. Håll plantorna i växthuset med 24 ° C.
14. Skörd infiltrerade blad 3 till 4 dagar efter infiltrering (dpi).

3. Rening av BMV-virioner

1. Samla N. benthamiana lämnar agroinfiltrated med en blandning innehållande alla tre av vildtyp BMV agrotransformants.
2. Mala bladen i en steril mortel med lika stor volym (vikt / volym) av BMV extraktionsbuffert (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 och 1/100 volym av β-merkaptoetanol som skall tillsättas strax före användning) ^3. För att maximera virusutbyte, rekommenderas att lägga syratvättad sand (~ 0,5-1 g) som gör det lättare slipning och effektiv cell störningar.
3. Filtrera bladextraktet via 2-3 lager av tunt tyg och samla in febrila.
4. Återigen mala den kvarhållna delen på tunt tyg med lika stor volym av BMV extraktionsbuffert till den initiala vikten av bladmaterial.
5. Upprepa filtrering förfarande med användning av tunt tyg. Dessa steg skall utföras vid 4 ° C.
6. Överföra filtratet lösningen till ett centrifugrör och tillsätt lika stor volym av i förväg kyld kloroform och virvel (eller skaka) under 5 minuter vid rumstemperatur tills färgen hos suspensionen blir ljust grön.
7. Centrifugera det emulgerade lösningen under 15 minuter vid 12.000 rpm vid 4 ° C.
8. Samla den vattenhaltiga fasen och rör om under 30 minuter på magnetisk omrörare för att avlägsna eventuellt kvarvarande kloroform.
9. Överföra suspensionen till en steril ultracentrifugrör.
3.
10. Centrifugera vid 30000 rpm under 3 timmar i en Beckman ultracentrifug vid 4 ° C.
11. Kasta bort supernatanten och suspendera pelleten i önskad volym av BMV suspensionsbuffert (för att framställa suspensionen buffert utspädd BMV extraktionsbuffert till 1/10 med sterilt destillerat vatten).
12. Den partiellt renade virus-beredning från ovanstående steg underkastas 10-40% sackarosdensitetsgradient centrifugering under 150 min vid 28 tusen varv per minut vid 4 ° C.
13. Samla upp Virusbandet antingen manuellt eller genom en fraktioneringskolonn. Viruset Bandet kommer att visas blått under vitt ljus belysning.
14. Späd den sackaroslösning innehållande virusprovet åtminstone 50% med virussuspension buffert.
15. Centrifugera utspätt virus innehållande sackaros-lösning under 3 timmar vid 30.000 rpm i en Beckman ultracentrifug vid 4 ° C.
16. Slutligen suspendera den höggradigt renade viruspelleten i en önskad volym av viross suspensionen buffert.
17. Mäta koncentrationen av virionen (mg / ml) med användning av spektrofotometer vid OD _260.

Obs: Baserat på RNA-halt är extinktionskoefficienten för BMV 5 ^4.

19. Kontrollera renheten i virioner genom att titta i TEM (bild A)

4. Beredning av kapsidproteinet subenheter för in vitro-montering

1. Framställa 1 liter 1x viruset dissociation buffert (0,5 _M CaCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,0 mM EDTA; 1,0 mM DTT och 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Framställ dialysmembran enligt Sambrook et al ^6.
3. Dispensera erforderliga koncentrationen av renat virus i en dialyspåse.
4. Placera den virusinnehållande dialyspåsen i en bägare innehållande 1 x viruset dissociationsbuffert.
5. Dialysera 24 timmar vid 4 ° C while omrörning.
6. Samla upp lösningen från dialyspåsen efter 24 timmar och centrifugera vid 12000 x g under 15 min vid 4 ° C. Detta kommer att separera BMV RNA från de dissocierade virioner.
7. Samla upp supernatanten och centrifugera vid 35000 rpm i Beckman-centrifug under 3 timmar vid 4 ° C för att pelletera all icke-dissocierade viruspartikel.
8. Samla upp supernatanten.
9. I detta skede är det absolut nödvändigt att ta bort kontaminerande virion-RNA från dissocierade kapsidprotein subenheter. För att göra detta bör supernatanten från steg 8 utsättas för ytterligare en runda över natten montering av kapsidproteinet subenheter utan att lägga något RNA (i RNA 1x montering buffert, se nedan) följt av en hög hastighet centrifugering (30.000 rpm i 3 timmar vid 4 ° C) för att pelletera de hopsatta virioner. Efter denna montering steg skulle supernatanten innehållande belägga proteinsubenheter vara fri från eventuella kvarvarande kontaminerande RNA. Men för att säkerställa detta är det lämpligt att genomföra en extra i Vitro återmontering med endast subenheter höljesprotein som använder RNA-1x montering buffert. Efter över natten återmontering måste beredningen vara fri från sammansatta virioner (verifiera med TEM).
10. Bestämma koncentrationen av kapsidproteinet subenheter genom mätning vid OD 254 och 280 nm eller genom andra metoder såsom Bradford-analysen.
11. Utföra 12-15% SDS-PAGE följt av Western blöt för att bestämma integriteten av de dissocierade kapsidprotein subenheter.

5. In vitro montering av RNA som innehåller virioner

1. Framställa RNA-transkriptioner som skall åter-monteras in i virioner och beräkna koncentrationen ^7.
2. Blanda kapsidproteinet subenheter och RNA-transkriptet i ett förhållande av 1:5 (vikt / vikt) ^5.
3. Dispensera den ovan angivna blandningen till en dialyspåse och korrekt säkra att undvika läckor.
4. Framställ 1000 ml. RNA 1x montering buffert (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 _mM MgCl2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Placera dialyspåse innehållande reaktionsblandningen mot 1x montering buffert i bägaren och omrördes.
6. Dialysera återmontering reaktion vid 4 ° C under 24 timmar med varsam omrörning.
7. Samla upp blandningen från dialyspåsen efter 24 timmar och tillsätt 1,5 ml av RNA montering buffert.
8. Passera denna blandning genom en Centricon-100-kolonn genom centrifugering vid låg hastighet (2000 x g) under 30 minuter.
9. Tvätta kolonnen gång med 1,5 ml av sammansättningen buffert vid 4 ° C under 30 minuter.
10. Upprepa ovanstående tvättsteg två gånger.
11. Slutligen eluera åter hopsatta virioner genom centrifugering vid 10.000 g vid 4 ° C under 5 minuter.
12. Uppskatta virionens koncentrationen vid OD 260 nm.

6. Tillverkning av optiska virala Ghosts (OVGs)

1. Lägg indocyaningrönt (ICG) ⁸ till det renade kapsidproteinet i önskad koncentration förhållande (viktförhållandet indocyaningrönt och kapsidproteinet som används i denna rapport var 1:10) en d Blanda noggrant genom pipettering.
2. Dialysera kapsidproteinet och ICG-lösning mot OVG aggregatet buffert (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA, och 1 mM DTT, pH4.8) vid 4 ° C under 24 timmar.
3. Efter 24 timmar uppsamlades den lösning från dialyspåsen (12 kDa porstorlek) och centrifugera vid 90 tusen varv per minut under 1 timme vid 4 ° C (fig B)
4. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i BMV suspension buffert genom vortexning eller låter det att avbryta av sig själv inom BMV suspensionsbuffert natten vid 4 ° C.
5. Kontrollera morfologi OVGs av TEM (Fig. C).
6. Mät absorbansen från 240 nm till 950 nm med användning spektrofotometer (Cary 50, Varian Inc.); närvaro av ICG bekräftas av toppar signatur absorbans cirka 700 nm och 790 nm ^8. (Fig. D)
7. De typiska ICG fluorescens topparna vid ~ 700 nm och ~ 800 nm kan ses vid 620 nm excitation av OVG lösning (bild D) med spektrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> 7 Representativa resultat

Figur A. TEM bild av negativt färgade BMV virioner renade från N. benthamiana växter agroinfiltrated med en blandning av alla tre av vildtyp BMV agroconstructs (Skalstreck = 100 nm).

Figur B. Pellet av in vitro monterade ICG innehåller OVGs efter höghastighetscentrifugering.

Figur C. TEM bild av negativt färgade ICG innehåller OVGs (skala bar = 100 nm).

Figur D. Absorbans (Top) och fluorescens (botten) spektra av OVGs. Excitationsvåglängden för OVG utsläpp wsom 620 nm.

Discussion

Agroinfiltration tillvägagångssätt presenteras här kan allmänt tillämpas på ett brett spektrum av växtvirus. En kännetecknande egenskap hos detta tillvägagångssätt är synkroniserad avgivning av multipla agroconstruct till samma cell-en stor nackdel förknippad med rutinmässigt används mekanisk inokulering av växtvirus. In vivo och in vitro montering studier med användning av Brome mosaikvirus som en modell kan utföras effektivt genom Följande några tips. (i) för framgångsrik infiltration av N. benthamiana lämnar, inte vattna blommorna i 24 timmar innan infiltration, (ii) Agrobacterium suspension kulturen skulle spridas till intracellulär utrymmen med lätthet, om infiltration genomfördes mellan 4-5 PM, (iii) Den optiska densiteten av kulturen inte bör överstiga 1,0 vid OD _600. Infiltrering av agrocultures med högre celldensitet är känd för att inducera cell-toxicitet och bladens åldrande ^9,10 som allvarligt skulle kunna påverka virusreplikation och efterföljande virionenformation, (iv) Under infiltration lätt tryck bör tillämpas på abaxiala sidan av bladet för att förhindra omfattande skador på bladet, vilket kan utlösa immunsvar i anläggningar, (v) sackarosdensitetsgradient från 10% till 40% kan göras i en tub genom att 25% av sackaros i BMV suspensionsbuffert (genom tillsats av den högsta koncentrationen och lägsta koncentration och dividera det med 2 dvs. 10% + 40% / 2 = 25%) och omedelbart fryser vid -80 ° C under 2 -4 h och vidare låta sackaros att tina långsamt genom att hålla den över natten vid 4 ° C i en rak position.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21